CN102718963B - 聚合物多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学技术领域，涉及一种聚合物多肽的制备方法，公开了一种制备醋酸格拉替雷的方法。本发明所述制备方法以丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸、酪氨酸的羧基内酸酐为原料，在二氧六环中用二乙胺作为引发剂引发聚合，得到带有保护基的聚合物，所得带有保护基的聚合物在18-30℃下与20-25%溴化氢醋酸溶液进行脱苄基反应，反应液倒入冰水中析出固体，所得固体用乙醚洗涤，过滤后收集固体，加入哌啶水溶液脱除三氟乙酰基得到格拉替雷粗产品溶液，纯化制得醋酸格拉替雷。与现有技术相比，本发明所述制备方法操作简单、对醋酸格拉替雷分子量影响小，醋酸格拉替雷收率高，适合于醋酸格拉替雷大规模产业化生产。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，涉及聚合物多肽的制备方法，尤其涉及一种制备醋酸格拉替雷的方法。
背景技术
醋酸格拉替雷，英文名为Glatiramer acetate，是一种合成的肽类化合物，是由Teva和Marion公司合作研制的多发性硬化症（Multiple Sclerosis，MS）治疗药物，商品名Copaxone醋酸格拉替雷分子式为C25H45N5O13，是由L-Alanine，L-Lysine，L-Glutamic，L-Tyrosine四种氨基酸组成的多聚物，四种氨基酸的摩尔比为0.427:0.338:0.141:0.095，平均分子量为4.7～11KDa，结构式为：(Ala,Lys,Glu,Tyr)x·XCH3COOH或(C3H7NO2·C6H14N2O2·C5H9NO4·C9H11NO3)X·XC2H4O2）。
药理研究表明醋酸格拉替雷与免疫系统内的调控因子结合并进入中枢神经，透过一连串的免疫作用扭转多发性硬化症患者其自体免疫进程；亦即刺激「有害」或前发炎性的T细胞转换为「有益的」或抗发炎的T细胞。醋酸格拉替雷可直接作用於神经细胞损伤部位并直接减少发炎情形。这些效益都有助於减少多发性硬化症患者其复发率，以及有效降低其进一步的损伤。
许多研究与临床经验证实醋酸格拉替雷能大幅度地减低多发性硬化症患者的复发率，防止神经进一步的损伤与恶化，改善失能的病况，减少脑部损伤。而且醋酸格拉替雷的副作用发生率少，有助于提升患者的耐受性。在其它长期使用的疗效研究里(6年至最长12年不等)，醋酸格拉替雷亦证实能持续地延缓患者其神经学上病程的恶化或者让患者维持稳定的病况，减少脑内损伤并防止神经元大量遭受破坏终至丧失功能的恶化情形。所以说醋酸格拉替雷具有很高的药用价值和广阔的市场前景。
制备醋酸格拉替雷的方法最早在Euro.J.Immune.1,242(1971，Tietelbaumet al)和美国专利US 3,849,550中有描述。其中描述的方法均以丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸、酪氨酸的羧基内酸酐为原料，在二氧六环中用二乙胺作为引发剂引发聚合，得到带有保护基的聚合物。聚合物用溴化氢醋酸溶液脱苄基，得到三氟乙酰基格拉替雷。三氟乙酰基格拉替雷用哌啶水溶液脱除三氟乙酰基，最后通过纯化得到醋酸格拉替雷。后续的专利US5,800,808（1998）,US 6,054,430（2000）,US 6,048,898（2000）,US 6,342,476（2002）,US 6,362,161(2002),US 6,620,847(2003),US 6,939,539(2005),US 7,199,098(2007),US 10,014,477以及WO 00/05250，WO09/016653均按照该方法进行制备，得到平均分子量为5000-9000Da的多肽聚合物。其中US5,800,808（1998）,US 6,054,430（2000）,US 6,048,898（2000）,US 6,342,476（2002）,US 6,362,161(2002),US 6,620,847(2003),US 6,939,539(2005),US 7,199,098(2007),US 10,014,477以及WO 00/05250在制备三氟乙酰基格拉替雷的过程中，均采用33%溴化氢醋酸溶液20-28℃下反应10-50h。WO09/016653对该步骤做了修改，反应时间改为1-5h，温度改为35-45℃。这两种方法都采用高浓度的溴化氢醋酸溶液，在去保护的过程中对肽链的切断作用十分明显，因此不利于对产品分子量的控制。
WO 2004/043995和US 2006/0172542用Z或带有取代基的Z保护Lys，苄酯或带有取代基的苄酯保护Glu，聚合之后在冰醋酸溶液中用催化剂催化氢化，直接得到聚合物的醋酸盐，然后进行纯化。该方法的优点是合成步骤少，与采用HBr/HOAc溶液去保护相比，在去保护过程中不切断肽链，对分子量不产生影响。
然而，上述制备方法工艺复杂、醋酸格拉替雷收率低，不适合醋酸格拉替雷的产业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种对醋酸格拉替雷分子量影响小、收率高的制备醋酸格拉替雷的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备醋酸格拉替雷的方法，包括以下步骤：
1）以丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸、酪氨酸的羧基内酸酐为原料，在二氧六环中用二乙胺作为引发剂引发聚合，得到带有保护基的聚合物；
2）取步骤1）所得带有保护基的聚合物在18-30℃下与20-25%溴化氢醋酸溶液进行脱苄基反应，反应结束后反应液倒入冰水中析出固体；
3）取步骤2）所得固体用乙醚洗涤，过滤后收集固体；
4）向步骤3）所得固体中加入哌啶水溶液脱除三氟乙酰基得到格拉替雷粗产品溶液，纯化制得醋酸格拉替雷。
本发明所述制备醋酸格拉替雷的方法采用丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸、酪氨酸的羧基内酸酐为原料，在二氧六环中用二乙胺作为引发剂引发聚合，得到带有保护基的聚合物。带有保护基的聚合物用20-25%的溴化氢醋酸溶液反应脱苄基，得到三氟乙酰基格拉替雷。然后用三氟乙酰基格拉替雷用乙醚洗涤除去反应产生的苄溴。之后用哌啶水溶液脱除三氟乙酰基格拉替雷的三氟乙酰基得到格拉替雷，纯化冻干得到醋酸格拉替雷。
优选的，步骤1）所述丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸与酪氨酸的羧基内酸酐的摩尔比为0.9:0.7:0.3:0.2。
本发明所述制备醋酸格拉替雷的方法在步骤1）中羧基内酸酐的聚合由二乙胺引发，同时反应体系中痕量水分也会对反应产生影响。由二乙胺引发得到的肽链较长，而由水引发得到的肽链则较短。因此反应体系中的水分对聚合物的分子量分布有很大的影响，得到的聚合物分子量往往很难均一。本发明步骤2）通过在18-30℃下，采用20-25%溴化氢醋酸溶液脱除苄基，同时还会切断肽链。本发明采用溴化氢醋酸溶液浓度低，对产品分子量的控制更加容易，从而调节产品分子量，稳定得到分子量分布在5000-9000Da的产品。
优选的，步骤2）所述脱苄基反应的反应时间为20～25h。更优选为23h
本发明所述制备醋酸格拉替雷的方法在步骤3）中，用乙醚洗涤步骤2）所得三氟乙酰基格拉替雷固体，以除去脱苄基产生的苄溴，提高反应的收率。同时乙醚沸点较低，可以快速去除三氟乙酰基格拉替雷样品中的水分，既减少残余的水分对聚合物的分子量的影响，又有利于缩短干燥时间。
优选的，所述乙醚洗涤为加入乙醚洗涤三次，每次搅拌25min。
本发明所述制备方法步骤4）利用哌啶水溶液脱除三氟乙酰基格拉替雷的三氟乙酰基得到格拉替雷粗产品溶液，然后经纯化制得醋酸格拉替雷。
优选的，所述纯化为超滤、透析或凝胶过滤。
在某一些具体实施方式中，所述超滤为用格拉替雷粗产品溶液截留量为2KDa超滤膜纯化至溶液pH值为5.0-6.5后冻干。
在某一些具体实施方式中，所述透析为将格拉替雷粗产品溶液置于截留量为5KDa透析袋中，用0.3v/v%乙酸溶液透析至pH值为5.0-6.56.0后冻干。
在另一些具体实施方式中，所述凝胶过滤为格拉替雷粗产品溶液用SEPHADEX G25或SEPHADEX G50凝胶柱，以0.01-2.0M醋酸铵水溶液为流动相过滤，收集分子量为7-8KDa的组分，浓缩后冻干。
与现有技术相比，本发明所述制备方法操作简单、对醋酸格拉替雷分子量影响小，醋酸格拉替雷收率高，适合于醋酸格拉替雷大规模产业化生产，并且制得的醋酸格拉替雷纯度高、杂质含量低，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
附图说明
图1示实施例5醋酸格拉替雷凝胶过滤层析图谱，其中醋酸格拉替雷产品平均分子量为7409；
图2示实施例5醋酸格拉替雷质谱图，其中横坐标为质核比（m/z），纵坐标为相对离子丰度（%），其中右上角插图为质荷比为1500～5000相对离子丰度。
具体实施方式
本发明实施例公开了聚合物多肽的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：带有保护基聚合物的制备
在5L三口圆底烧瓶中加入丙氨酸羧基内酸酐103.5g（0.9mol）、ξ-三氟乙酰基赖氨酸羧基内酸酐187.6g（0.70mol）、γ-苄基谷氨酸羧基内酸酐78.9g（0.3mol）、酪氨酸羧基内酸酐41.4g（0.20mol）和3L二氧六环，搅拌溶解。再加入0.01%二乙胺引发聚合反应，室温搅拌24h后倒入30L水中淬灭反应，固体用10L水洗涤后过滤，干燥得白色固体313.9g，收率为76.3%。
实施例2：三氟乙酰基格拉替雷制备
在50mL圆底烧瓶中加入3g实施例1制得的带保护基聚合物，加入30mL25%溴化氢醋酸溶液，在25℃搅拌23h，反应结束后将反应液倒入300mL冰水中析出固体，过滤后收集固体用水洗涤（300mL）后过滤抽干。收集固体加入50mL乙醚洗涤三次，每次搅拌25min，过滤后干燥，得到白色固体2.2g，收率为73.3%。
实施例3：三氟乙酰基格拉替雷的制备
在5L圆底烧瓶中加入300g实施例1制得的带保护基聚合物，加入3000mL 20-25%溴化氢醋酸溶液，在25℃搅拌23h，反应结束后将反应液倒入30L冰水中析出固体，过滤后收集固体用30L水洗涤后过滤抽干。收集固体加入5L乙醚洗涤三次，每次搅拌25min，样品过滤后干燥，得到白色固体216.9g，收率为72.3%。
实施例4：格拉替雷粗品溶液的制备
在20L反应釜中加入200g实施例3制得的三氟乙酰基格拉替雷，加入15L1M哌啶水溶液，在室温下搅拌24h过滤，收集滤液得到浅黄色水溶液，即为格拉替雷粗产品溶液。
实施例5：凝胶过滤纯化
取实施例4制得的格拉替雷粗品溶液，用600×26mm SEPHADEX G50凝胶柱凝胶过滤，流动相为0.1M醋酸铵水溶液，流速5mL/min，上样量30mL，紫外检测器进行监测，收集分子量为7-8KDa的组分，浓缩冻干后得到类白色的醋酸格拉替雷固体160mg。凝胶过滤层析图谱图1，质谱结果检测见图2。
实施例6：凝胶过滤纯化
取实施例4制得的格拉替雷粗品溶液，用600×26mm SEPHADEX G25凝胶柱凝胶过滤，流动相为0.1M醋酸铵水溶液，流速5mL/min，上样量30mL，紫外检测器进行监测，收集分子量为7-8KDa的组分，浓缩冻干后得到类白色的醋酸格拉替雷固体150mg。质谱结果与实施例5相似。
实施例7：透析纯化
取20mL实施例4制得的格拉替雷粗品溶液于截留量为5000Da的透析袋中，用0.3%HOAc溶液透析至pH值为6.0，冻干得到180mg醋酸格拉替雷。质谱结果与实施例5相似。
实施例8：超滤纯化
取500mL取实施例4制得的格拉替雷粗品溶液，用截留量为2KDa切向流超滤膜包进行超滤纯化，超滤纯化至pH值为6.0，冻干得到3.9g醋酸格拉替雷。质谱结果与实施例5相似。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (1)
1.一种制备醋酸格拉替雷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸、酪氨酸的羧基内酸酐为原料，在二氧六环中用二乙胺作为引发剂引发聚合，得到带有保护基的聚合物；
2）取步骤1）所得带有保护基的聚合物在18-30℃下与20-25%溴化氢醋酸溶液进行脱苄基反应，反应结束后反应液倒入冰水中析出固体；所述脱苄基反应的反应时间为20～25h；
3）取步骤2）所得固体用乙醚洗涤，过滤后收集固体；
4）向步骤3）所得固体中加入哌啶水溶液脱除三氟乙酰基得到格拉替雷粗产品溶液，纯化制得醋酸格拉替雷；
步骤1）所述丙氨酸、ξ-三氟乙酰基赖氨酸、γ-苄基谷氨酸与酪氨酸的羧基内酸酐的摩尔比为0.9:0.7:0.3:0.2；
步骤3）所述乙醚洗涤为加入乙醚洗涤三次，每次搅拌25min；
步骤4）所述纯化为超滤、透析或凝胶过滤；
所述超滤为用格拉替雷粗产品溶液截留量为2KDa超滤膜纯化至溶液pH值为5.0-6.5后冻干；
所述透析为将格拉替雷粗产品溶液置于截留量为5KDa透析袋中，用0.3v/v%乙酸溶液透析至pH值为5.0-6.0后冻干；
所述凝胶过滤为格拉替雷粗产品溶液用SEPHADEX G25或SEPHADEX G50凝胶柱，以0.01-2.0M醋酸铵水溶液为流动相过滤，收集分子量为7-8KDa的组分，浓缩后冻干。
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