CN102711818B - 抗rsv免疫原和免疫方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了作为疫苗成分的免疫原性多肽，所述免疫原性多肽对应于一种或多种RSV G糖蛋白或其类似物。本发明的组合物可用作预防和治疗RSV感染和相关的肺部疾病或其它疾病的预防剂和治疗剂。本发明的免疫原包括RSV G蛋白的区域，具体而言，包括RSV G A2蛋白的第164～176位氨基酸残基或其类似物。本发明的免疫原可以单独使用，或者与如RSV G蛋白的第155～206位氨基酸残基等其它多肽、或如活RSV疫苗等其它疫苗或灭活RSV疫苗或其免疫原性类似物一起组合使用。

Description

抗RSV免疫原和免疫方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年8月4日提交的美国临时申请第61/231,162号和于2010年5月11日提交的美国临时申请第61/333,496号的优先权，本文通过援引并入其全部内容。
技术领域
本发明大体上涉及多聚氨基酸免疫原。更具体而言，本发明涉及与在受试对象中诱导免疫响应的RSV-G糖蛋白有关的多肽。所述肽促进了对RSV感染的免疫并同时防止了受试对象中不需要的免疫学响应。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是全球婴幼儿严重下呼吸道疾病的最常见致因。在受试对象暴露于RSV后免疫保护是不完全的，从而在整个生命中发生反复感染并常常在老年和免疫缺陷(immune compromised)患者中伴随着严重的并发症。不幸的是，虽然已提出并研究了许多疫苗候选物，尚未有可利用的安全有效的疫苗，并且治疗选择很有限。
RSV展示两种主要的表面病毒蛋白，G糖蛋白(附着)和F糖蛋白(融合)。RSV F糖蛋白在动物模型系统中对于诱导保护性免疫要有效地多。因此，对于治疗和预防RSV感染的努力往往集中在抗RSV F蛋白抗体、影响F蛋白和活病毒的抗病毒药物、或基于F蛋白的疫苗上。例如，采用帕利珠单抗(一种中和性抗RSVF蛋白单克隆抗体)的预防性治疗减少高风险婴幼儿中的严重RSV诱导感染。帕利珠单抗对于治疗活性感染无效，因而其应用有限。类似地，用于治疗急性RSV感染的其他治疗方式也证明是无效或有效性最低。例如，抗病毒利巴韦林具有有限的疗效并且除了在治疗免疫缺陷患者中的感染以外很少使用。不受限于单一假设，现有RSV治疗的无效性的一种可能的解释是病毒诱导的宿主炎性响应对于疾病发病机理而言很重要，并且一旦感染建立，这种炎性响应仅部分地响应于抗病毒治疗。因此，有效治疗可能既需要抗炎成分也需要抗病毒成分。
RSV的G蛋白可能在诱导和调节宿主对感染的免疫响应中起作用。感染性病毒中的完整RSV G蛋白的表达与较低的IFNγ表达细胞的频率和较高的IL-4表达细胞的频率有关。此外RSV G蛋白还已经与在接种了福尔马林灭活的RSV疫苗的小鼠中进行RSV激发后的肺部嗜酸性粒细胞增多(eosinophilia)的增高、RSV激发的小鼠中物质P的肺部水平的增加以及对小鼠的施用相关的呼吸速率减慢相关联。
迄今制备安全有效的疫苗的努力尚未获得过成功。开发疫苗的一个问题在于以下事实：福尔马林灭活的疫苗在施用于幼儿时导致更严重的疾病和晚些的RSV感染，从而导致对任何灭活的RSV疫苗可能对于幼儿不安全的疑虑。现有技术的疫苗的另一个问题在于无法诱导高度有效的保护性免疫响应。天然感染对于再感染和疾病仅提供有限防护的事实突出了这一问题。
如此，需要安全有效的RSV疫苗。
发明内容
本发明提供了具有一种或多种与RSV G蛋白相关的分离免疫原的单成分或多成分疫苗。本发明的疫苗包含一种或多种对应于RSV G蛋白的片段的免疫原，所述蛋白片段包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的第164至第176号残基、第163至第190号残基和第155至第206号残基或其类似物。可选的是，所述免疫原是对应于SEQ ID NO：2～6或其类似物的一种或多种的氨基酸序列。所述免疫原在经免疫的受试对象中产生抗体或者产生免疫响应。一种或多种免疫原可选地包含辅助该免疫原的分离的标签。免疫原可选地为重组免疫原。
在多组分疫苗(即至少第一免疫原和第二免疫原)中，免疫原可选地通过连接子连接。连接可选地为共价连接。连接子可选地为可以被切割的中间体多肽片段。在某些实施方式中，多组分疫苗的免疫原是SEQ ID NO：3、4、5、6或其类似物的多肽。
本发明的疫苗可选地含有佐剂，列举性的佐剂如，二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)；单磷酰脂A(MPL)；LTK63、亲脂性季铵盐-DDA、DDA-MPL、铝盐、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾、Montanide ISA-51、ISA-720、微粒、免疫刺激复合物、脂质体、病毒体(virosome)、病毒样颗粒、CpG寡核苷酸、霍乱毒素、来自大肠杆菌的不耐热毒素、脂蛋白、树突细胞、IL-12、GM-CSF、列举性地包括磷酸钙纳米颗粒在内的纳米颗粒、用以形成纳米乳液的大豆油、乳化剂和乙醇的组合；AS04、ZADAXIN或其组合。
本发明的疫苗可选地含有乳化剂，列举性的乳化剂如超分子生物载体(SMBV)、纳米颗粒、脂质体或其组合。
本发明还提供了在受试对象中创建免疫响应的方法。可选地，所述方法包括对受试对象施用本发明的免疫原或多肽。施用通过本领域已知的任何有效方法进行，列举性的施用如皮下、肌内、鼻内、口腔、阴道内、静脉内、粘膜内或其组合。
可选地，对受试对象施用多于一种疫苗。可选地，将第二疫苗在施用第一疫苗之前、与其同时或之后施用。可以理解，第二疫苗可选地为对应于SEQ ID NO：1的第155位氨基酸～第206位氨基酸的氨基酸序列或其类似物；或对应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的第163位氨基酸～第190位氨基酸的氨基酸序列或其类似物；或者它们的组合。
可选地，本发明的施用通过诱导以下抗体而使另一种RSV疫苗更安全，所述抗体保护不受异常的或增强的由所述不同类型的RSV疫苗诱导的响应的影响。
此外，本发明还提供了一种药物包，所述药物包包含具有本发明的一种或多种免疫原的疫苗、乳化剂和佐剂。
附图说明
图1表示在用RSV激发的小鼠中的IL-4(A)或IFNγ(B)的相对水平，所述小鼠经与G蛋白结合的抗体治疗或未经治疗，所述抗体与本发明的免疫原所诱导的那些抗体相似，其中，黑色条表示经对照抗体治疗的小鼠，空心条表示经抗RSV G抗体治疗(低剂量或150μg)的小鼠，且灰色条表示经抗RSV G抗体治疗(高剂量或300μg)的小鼠；
图2表示用RSV激发的小鼠中病毒滴度的减少，所述小鼠经与G蛋白结合的抗体治疗或未经治疗，所述抗体与本发明的免疫原在RSV感染后所诱导的那些抗体相似，其中实心方块表示经对照抗体治疗的小鼠，空心三角表示经抗RSVG抗体治疗(低剂量)的小鼠，且空心方块表示经抗RSV G抗体治疗(高剂量)的小鼠；
图3表示在用与G蛋白结合的抗体进行或未进行预防性治疗后，用RSV激发的接种有福尔马林灭活RSVA2(FI-A2)疫苗的小鼠中的肺部嗜酸性粒细胞增多的减少，所述与G蛋白结合的抗体和在RSV激发后由本发明的免疫原所诱导的那些抗体相似；
图4表示在用FI-A2和来自RSVGA-CH17(SEQ ID NO：5)的疫苗免疫后，在用RSV激发的小鼠中的BAL液的总细胞含量(A)、BAL中的嗜酸性粒细胞水平(B)、BAL液中的IL-4含量(C)和体重损失；
图5表示在用FI-A2和源自RSVGA-A2(SEQ ID NO：4)的疫苗免疫后，在用RSV激发的小鼠中的BAL液的总细胞含量(A)、BAL中的嗜酸性粒细胞水平(B)、BAL液中的IL-4含量(C)和体重损失。
具体实施方式
通过参考以下对本发明的优选实施方式和本文所包括的实施例的详细描述可以更容易地理解本发明。
在公开和描述本发明的化合物和方法以前，应该理解，本发明不限于特定的蛋白、特定方法或特定核酸，因为这些蛋白、方法和核酸当然可能有所变化。此外还应理解，本文所用的术语是仅出于描述特定实施方式的目的而非旨在进行限制。
必须注意，如说明书和所附权利要求书中所用，除非另外明确指出，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个指代物。
本发明不仅产生有效的保护性免疫响应，而且不会具有与现有技术的福尔马林灭活呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗相似的诱导更严重疾病的倾向。如此，本发明具有作为针对RSV感染的免疫的免疫原和免疫方法的实用性。
本发明的一个方面提供了通过选择RSV G蛋白的区域而制备的非活性的RSV疫苗，或通过选择RSV G蛋白的区域而得到改善的非活性的RSV疫苗，从而在将所述疫苗施用于人类或动物时会产生更高滴度的抗体，所述抗体阻断后续感染性RSV病毒的G糖蛋白的多肽部分的生物活性，或促进病毒或受感染细胞的移除。
在本发明的另一方面，提供了下述疫苗，该疫苗在施用于人类或动物时诱导免疫响应，例如产生阻断或者改变后续感染性RSV病毒的G糖蛋白的生物功能的抗体。作为另一种选择，所述疫苗包含来自不同的具有上述能力的RSV毒株的一种或多种G糖蛋白肽或多肽或其类似物。RSV毒株列举性地包括表达RSVGA、RSVGA2、RSVGA_CH17或RSVB G糖蛋白的那些毒株。
此外，本发明还提供了用于改善或鉴定可以用于治疗RSV疾病和/或用作预防RSV疾病的疫苗的药物、抗体、肽、多肽或其它阻断分子的方法。
本发明采用包含RSV G蛋白的13个氨基酸的序列(RSV的A2毒株中的第164～176位氨基酸)或其免疫原性类似物的多肽、RSV G蛋白(第163～190位氨基酸，合成的RSVGA_CH17)、RSVB G蛋白序列RSVGB(合成的第155～206位氨基酸)或者两种各自是RSV A组和B组毒株的特异性保守区域的多肽(例如RSV A组毒株的第163～190位氨基酸和RSV B组毒株的第155～206位氨基酸)，它们可有效诱导受试对象中的免疫保护性抗体。另外，所述13个氨基酸的区域在各RSV毒株之间基本保守，并且A组和B组特异性区域的组合出现在所有毒株上从而本发明的疫苗提供了宽广范围的保护。
免疫原列举性地包括对应于SEQ ID NO：1的第164～176位氨基酸的氨基酸残基或其类似物。可选地，免疫原是SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在某些实施方式中，免疫原的类似物被用作免疫原。类似物可选地为具有一个或多个突变的免疫原，所述突变诸如相对于野生型蛋白增强、减弱或未改变蛋白在受试对象中引起免疫响应和/或与CX3CR1结合的能力的氨基酸取代、插入、改变、修饰或其它氨基酸变化。应该意识到CX3C基序是免疫调节性的。改变野生型免疫原中的基序的氨基酸或者该基序附近区域的变化会提高安全性同时仍旧产生可阻断免疫原与受体CX3CR1的结合的抗体。因此，还应该意识到，进行了氨基酸插入以便例如产生CX1C、CX2C、CX4C、CX5C、CX6C至CX10C内含物。可选地，对趋化因子基序CX3C中的一个或多个半胱氨酸残基进行改变，诸如缺失、取代或其它对半胱氨酸残基自身的修饰。应该意识到，可以考虑对野生型免疫原序列的变化进行任意组合。
类似地，几种翻译后修饰也被视作属于本发明的范围内，列举性地包括非天然存在氨基酸的引入、磷酸化、糖基化、侧基(pendent group)(如生物素化、荧光团、发光团、放射性基团、抗原或其它分子)的添加，以上所有均由术语类似物所涵盖。免疫原的类似物可选地为免疫原的片段。一种免疫原类似物是具有某种水平的诱导受试对象中针对RSV G糖蛋白的区域的免疫响应的活性的多肽。类似物可选地具有野生型免疫原的0.1％～200％的活性。免疫原类似物可选地为在至少一种性质上相对于野生型蛋白序列被改变的野生型RSV G糖蛋白序列。上述性质列举性地包括免疫原性、热稳定性、pH/稳定性特征、对于氧化的稳定性、溶解性或其组合。合成免疫原、修饰免疫原、测试免疫原活性或免疫原类似物的性质(列举性的如受体结合)或者表达免疫原或其类似物的方法可以通过本领域内惯常施行的方法来实现，例如“MolecularCloning：A Laboratory Manual”，第二版，第1～3卷，Sambrook等编著，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，1989；“Current Protocols in MolecularBiology”，Ausubel等编著，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定期更新)和“Short Protocols in Molecular Biology”，Ausubel等编著，第52版，Wiley-Interscience，New York，2002中所公开的方法，本文通过援引并入其内容。
免疫原列举性地包括对应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8的第163～190位氨基酸的氨基酸残基或其类似物。可选地，免疫原是SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
免疫原列举性地包括对应于SEQ ID NO：7的第155～206位氨基酸的氨基酸残基或其类似物。可选地，免疫原是SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
术语“多肽”或“蛋白”在本文中互换地使用，并且列举性地表示两个以上氨基酸残基的链。免疫原列举性地为具有某种水平的免疫原活性(即在生物体中诱导抗体产生)的多肽。在某些实施方式中，多肽是RSV G蛋白的氨基酸序列或其类似物，它们可单独使用或与其它肽或者免疫原序列或治疗剂组合使用。RSV G蛋白序列的列举性实例可见于GenBank登录号P03423和SEQ ID NO：1以及登录号P20896和SEQID NO：7和SEQ IDNO：8。
免疫原可选地为重组免疫原且通过本领域已知方法获得。例如，将核苷酸序列克隆至质粒中，将该质粒转染至大肠杆菌内并进行表达。为消除纯化步骤，所表达的多肽可选地包含标签。列举性实例包括多聚组氨酸、CBP、CYD(共价的可解离NorpD肽)、strep-2、FLAG、HPC或蛋白C肽标签的重链、或者GST和MBP蛋白融合标签系统。可以意识到，其它标签系统类似地也是可行的。在某些实施方式中，重组多肽被表达在大肠杆菌中，并使用亲和标签系统进行纯化，然后诸如通过引入Xa因子、凝血酶或所表达的多肽中的其它酶切割位点来进行标签的酶切割。标签切割方法是本领域内已知的，并且可以理解任何有效方法都可适用于本发明。
本发明提供了分离的RSV G蛋白免疫原或其类似物。可选地，本发明的RSV G蛋白具有由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8所示的序列或其类似物，例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其类似物。可选地，RSV G蛋白片段是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示序列或其类似物。可选地，RSV G蛋白具有SEQ ID NO：7所示序列或其类似物。
RSV G蛋白可选地为重组蛋白。然而，也可以考虑到，可以从其中通常可以发现野生型序列的样品材料的至少一部分中分离出天然存在的RSV G蛋白。从源自生物体的样品中纯化蛋白的方法是本领域内已知的且属于本领域技术水平范畴内。
应当认为，许多变异体、类似物或同源物都在本发明的范围内，包括提高、降低或未改变本发明的免疫原或疫苗的功能或免疫原性的氨基酸取代、改变、修饰其它氨基酸变化。此外，应当意识到，本发明的SEQ ID NO：1～8的序列可选地通过添加一种或多种下列物质而被修饰：氨基酸、糖、核苷酸、侧基、荧光团、发光团、放射性分子、脂质、脂肪酸、其衍生物或其它本领域内已知的基团。例如，本发明的免疫原与蛋白缀合。
免疫原可选地与促进免疫原的免疫原性的蛋白缀合，例如，钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)，或其修饰物，例如来自Thermo Scientific，Rockford，IL的BLUE CARRIER免疫原蛋白。天然或人工免疫原蛋白缀合物的其它来源是本领域已知的。可选地，免疫原与抗体缀合。可选地，免疫原与G蛋白的可能也含有表位或可能不含表位的其它区域缀合。
类似地，几种翻译后修饰也被认为属于本发明的范围之内，列举性地包括引入非天然存在的氨基酸、磷酸化、糖基化、硫酸化和添加侧基(诸如生物素化、荧光团、发光团、放射性基团、抗原或其它分子)。此类修饰也被认为涵盖在术语类似物中。
可以意识到，本发明的多肽、免疫原或本发明的疫苗是经过磷酸化的或未经磷酸化的。RSV G蛋白是天然经磷酸化和糖基化的蛋白。可选地，免疫原经二硫键键合。二硫键可以与所述序列内的氨基酸残基相连或者与第二多肽或分子相连。
取决于特定的氨基酸取代，RSV G蛋白片段可选地在其中具有一处或多处的磷酸化或其它翻译后修饰。表达和纯化天然或重组的磷蛋白或糖蛋白的方法是本领域内已知的。例如，将磷蛋白和糖蛋白重组表达在真核细胞中。示例性真核细胞包括酵母、HeLa细胞、293细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和许多其它本领域内已知的细胞类型。真核和原核表达系统和细胞均可获自例如Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA。可以意识到，类似地也可采用无细胞表达系统。
可选地，未进行糖基化或磷酸化而制得多肽。在一个非限制性实例中，多肽在大肠杆菌中合成，在本领域中认为大肠杆菌不能正确地对已表达的蛋白糖基化。可以意识到，其它不会使多肽糖基化的合成手段也类似地适用。因此，在该实施方式中，蛋白没有糖基化。
可以在作为本申请的主题的多肽的结构中进行修饰和变化，但仍可获得具有与野生型序列相似或改善的特性(例如，保守氨基酸取代)的分子。例如，序列中的某些氨基酸可以被取代为其它氨基酸而不会可感知地损失免疫原活性。由于正是多肽的相互作用的能力和性质限定了多肽的生物功能活性，因此可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列取代而仍然获得具有相似或改善的性质的多肽。可选地，使用具有与野生型序列相比具有更低或更高的免疫原活性的多肽。
在进行上述变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。在本领域中，对氨基酸亲水指数在赋予多肽上的相互作用的生物功能中的重要性有着普遍认识。已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的其它氨基酸所取代而仍然产生具有相似生物学活性的多肽。基于每种氨基酸的疏水性和电荷特性，对其指定了亲水指数。这些指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
据信，氨基酸的相对亲水性决定了所生成多肽的二级结构，而这反过来限定了多肽与其他分子如酶、底物、受体、抗体和抗原等的相互作用。在本领域中已知氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一种氨基酸所取代并仍然获得功能等价的多肽。在此类变化中，可选地采用其亲水指数在±2以内的氨基酸取代，可选地采用其亲水指数在±1以内的氨基酸取代，且可选地采用其亲水指数在±0.5以内的氨基酸取代。
相似氨基酸的取代还可以基于亲水性进行，特别是由此形成的生物功能性等价的多肽或肽计划用于免疫学实施方式中时。对氨基酸残基指定了以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解，氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一种氨基酸所取代而仍然获得生物学等价的、特别是免疫学等价的多肽。在此类变化中，可选地采用其亲水性值在±2以内的氨基酸取代，可选地采用其亲水性值在±1以内的氨基酸取代，且可选地采用其亲水性值在±0.5以内的氨基酸取代。
氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷和尺寸等。考虑到各种上述特性的示例性取代是本领域技术人员所公知的并且包括(初始残基：示例性取代)：(Ala：Gly，Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln，His)、(Asp：Glu，Cys，Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn，Gln)、(Ile：Leu，Val)、(Leu：Ile，Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu，Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Trp：Tyr)、(Tyr：Trp，Phe)和(Val：Ile，Leu)。因此，本公开的实施方式考虑到如上所述的多肽的功能等价物或生物学等价物。特别地，所述多肽的实施方式可以包括与所关注多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％和95％序列同一性的变异体。
本发明的某些实施方式是含有RSV G蛋白核酸的组合物，所述RSV G蛋白核酸可以表达为所编码的多肽或蛋白。可选地，核酸序列是编码SEQ ID NO：1～8的多肽的核酸序列。由于遗传密码是简并的并且本领域普通技术人员知道如何构建、分离或者鉴定在被表达时会产生特定多肽序列的核酸序列，因而任何会产生本发明的多肽的核酸序列属于本发明的范围内。可以通过重组表达领域内技术人员公知的技术来进行用于在原核或真核系统中表达的DNA片段的工程化。据信实际上任何表达系统都可用在所要求保护的核酸序列和氨基酸序列的表达中。示例性的编码RSV G蛋白的核酸序列可见于登录号P03423的基因序列中。本领域普通技术人员了解如何鉴定产生SEQ ID NO：1～4的多肽的P03423序列的部分。类似地，示例性的编码RSV G蛋白的核酸序列可见于登录号P20896的基因序列中。本领域普通技术人员了解如何鉴定产生SEQ ID NO：6～7的多肽的P20896序列的部分。
本文所用的核酸是指单链或双链分子，其可以为由核苷酸碱基A、T、C和G组成的DNA或由碱基A、U(T的替代物)、C和G组成的RNA。核酸可以表示编码链或其互补物。核酸可能在序列上与天然存在的序列相同或者可能包含编码与天然存在序列中所见氨基酸相同的氨基酸的替代性密码子。此外，核酸可以包含代表本领域所公知的保守性氨基酸取代的密码子。
如本文所用，术语“分离的核酸”是指与天然存在的生物体的其它组分(例如，通常发现与细胞环境中的核酸和/或其它核酸结合的细胞结构组分)的至少某一些相分离或基本游离的核酸。因此，核酸的分离可以通过以下技术实现，诸如细胞裂解，随后进行苯酚+氯仿萃取，随后进行核酸的乙醇沉淀。可以根据本领域已知的分离核酸的方法来从细胞分离本发明的核酸。作为另一种选择，可以根据文献中详述的合成核酸的标准方案来合成本发明的核酸。也考虑对本发明的核酸进行修饰，条件是所述核酸所编码的肽或多肽的根本结构和功能得到保持。
编码本发明的肽或多肽的核酸可以是重组核酸构建体的一部分，所述重组核酸构建体包含促进分子克隆和其他重组DNA操作的本领域公知的限制位点和/或功能元件的任意组合。因此，本发明还提供了包含编码本发明的肽和/或多肽的核酸的重组核酸构建体。
一般而言，可能更便利的是，采用多核苷酸的cDNA形式来作为重组多核苷酸。据信使用cDNA形式将提供以下优势：基因的尺寸通常比基因组基因要小得多并且更易于用来转染靶细胞，基因组基因通常比cDNA基因大多达一个数量级。然而，本发明人并未排除在需要时采用特定基因的基因组形式的可能性。
如本文所用，术语“工程化细胞”和“重组细胞”与“宿主细胞”同义，且意在指代其中导入有外源性DNA片段或基因(如cDNA或基因)的细胞。因此，工程化细胞可以与不含经重组导入的外源性DNA片段或基因的天然存在细胞相区分。宿主细胞可选地为用外源性DNA片段或基因转化的天然存在细胞或未经修饰的细胞。宿主细胞可选地不具有编码RSV G蛋白的天然存在基因。因此，工程化细胞是具有经人工导入的一个或多个基因的细胞。重组细胞包括具有导入的cDNA或基因组DNA的那些细胞，并且还包括位置与并非天然与所述特别导入的基因相关的启动子相邻的基因。
为表达本发明的重组物编码的多肽，可以列举性地制备包含受一个或多个启动子的控制的多核苷酸的表达载体。为使编码序列受启动子“控制”，通常将阅读框的翻译起始位点的5’末端置于所选启动子的“下游”(即其3’处)的1～50个核苷酸处。“上游”启动子刺激所插入的DNA的转录并促进所编码的重组蛋白的表达。这就是在本文所用的背景下“重组表达”的含义。
可采用许多标准技术来构建含有适当的核酸和转录/翻译控制序列的表达载体，以便在各种宿主表达系统中实现蛋白或肽的表达。可用于表达的细胞类型包括但不限于细菌，如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的大肠杆菌和枯草杆菌。
原核生物宿主的某些实例是大肠杆菌菌株RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌chi.1776(ATCC No.31537)以及大肠杆菌W3110(F-、λ-，原养型，ATCC No.273325)；如枯草杆菌等杆菌；和其它肠细菌，如鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和各种假单胞菌菌种。
一般而言，将含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主联合使用。载体通常载有复制位点，以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常使用pBR322转化，pBR322是源自大肠杆菌菌种的质粒。质粒pBR322含有用于氨苄青霉素和四环素抗性的基因，并因此提供了鉴定转化细胞的简易手段。pBR322质粒或其它微生物质粒或噬菌体还可以含有或者经修饰以含有可以被微生物体利用以表达其自身蛋白的启动子。
另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以与这些宿主联合用作转化载体。例如，噬菌体λ可以用在制备可用于转化宿主细胞(如大肠杆菌LE392)的重组噬菌体载体中。
其他可用载体包括pIN载体和pGEX载体，以用于产生谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白以用于后续的纯化和分离或切割。其他合适的融合蛋白是具有β-半乳糖苷酶或泛素等的那些蛋白。
在重组DNA构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。虽然这些是最常用的，但也已发现并利用其它微生物启动子，且已发表与其核苷酸序列有关的细节，从而使得本领域技术人员能够将它们与质粒载体功能性地连接。
为在酵母属中表达，通常使用例如质粒YRp7。该质粒含有trp1基因，其为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母菌突变菌株(例如，ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标记物。于是，作为酵母菌宿主细胞基因组的特性的trp1损伤的存在提供了通过在不存在色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。
酵母菌载体中的合适启动序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，所述糖酵解酶诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。在构建合适的表达质粒时，还将与这些基因相关的终止序列连接至表达载体的期望表达的序列的3’处，以提供对mRNA的多聚腺苷酸化和终止。
具有受生长条件控制的转录的额外优点的其他合适的启动子包括乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶以及上述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。
除微生物以外，还可将源自多细胞生物体的细胞培养物用作宿主。原则上，任何此类细胞培养物都是可行的，不论来自脊椎动物还是无脊椎动物培养物。除哺乳动物细胞以外，这些还包括受重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；和受重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有一个或多个编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统。
在可用的昆虫系统中，将苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体来表达外来基因。该病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。分离的核酸编码序列被克隆至病毒的非必需区(例如多角体基因)并被置于AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制下。编码序列的成功插入导致多角体基因的失活和未封闭重组病毒(即缺乏由多角体基因编码的蛋白质性外壳的病毒)的产生。这些重组病毒然后被用于感染其中表达有插入基因的草地贪夜蛾细胞(例如，美国专利第4,215,051号)。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Hep2、NIH3T3、RIN、Calu-3和MDCK细胞系。另外，可以选择以所需的特定方式调节所插入序列的表达或者修饰并加工基因产物的宿主细胞。对蛋白产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)可能对于所编码蛋白的功能是重要的。
不同宿主细胞对蛋白具有特征性和特异性的翻译后加工和修饰机理。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保对表达的外来蛋白进行正确修饰和加工。用在哺乳动物细胞中的表达载体通常包含复制起点(必要时)、位于待表达基因前方的启动子以及任何必须的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列。复制起点可以通过构建载体以包含外源性起点来提供(例如可以源自SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒、Adeno、VSV、BPV)来源)，或可通过宿主细胞染色体复制机制来提供。如果载体被整合至宿主细胞染色体内，则后者通常就足够。
启动子可以源自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。此外，有可能并且可能理想的是利用通常与所需基因序列相关的启动子或控制序列，条件是此类控制序列与宿主细胞系统相容。
可以利用许多基于病毒的表达系统，例如，常用启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、腺病毒5、巨细胞病毒和猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子均可使用，因为两者均易于从病毒作为还含有SV40病毒复制起点的片段获得。也可以使用更小或更大的SV40片段，条件是其中包含位于病毒复制起点中的从HindIII位点延伸至BglI位点的约250bp的序列。
在将腺病毒用作表达载体的情形中，可以将编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合物(例如，晚期启动子和三联体前导序列)连接。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如，E1或E3区)会产生有活力并且能够在受感染宿主中表达蛋白的重组病毒。
可能需要特定的起始信号来有效地翻译所要求保护的分离的核酸编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。另外，可能需要提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员易于能够确定这种需要并提供必需的信号。公知的是，起始密码子必需与所需编码序列的阅读框在同框架内(或相内(in-phase))以确保整个插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以具有各种来源，包括天然和合成的。表达效率可通过包括合适的转录增强元件或转录终止物来增强。
在真核表达中，在原始克隆的片段不含多聚腺苷酸化位点时，通常还可能希望将合适的多聚腺苷酸化位点并入转录单元内。通常，将聚A添加位点置于蛋白终止位点的“下游”的约30至2000个核苷酸处的在转录终止之前的位置。
为了长期高产率的进行重组蛋白的生产，优选稳定表达。例如，可能对稳定表达编码蛋白的构建体的细胞系进行工程化。可以用通过适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和选择性标记物控制的载体对宿主细胞进行转化，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在引入外来DNA后，可以让工程化的细胞在富集培养基中生长1～2天，然后更替为选择性培养基。重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抵抗性并使细胞能够稳定地将质粒整合至其染色体内并生长以形成病灶(foci)，其继而可被克隆至细胞系中并进行扩增。
可以使用许多选择系统，包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。此外，可以将抗代谢物抗性作为对于以下物质的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性。可以意识到，本领域内已知许多其他选择系统，其类似地可用在本发明中。
还可以将编码本发明的肽和多肽的核酸作为核酸疫苗施用。出于疫苗递送的目的，编码本发明的肽或多肽的核酸可以位于包含病毒核酸的表达载体中，所述病毒核酸包括但不限于牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒和/或腺相关病毒核酸。本发明的核酸或载体还可以位于脂质体或递送载体中，所述脂质体或递送载体可以被细胞通过受体介导的胞吞作用或其它类型的胞吞作用摄取。本发明的核酸疫苗可以位于药学上可接受的载剂中或与佐剂一同施用。编码本发明的肽和多肽的核酸还可以在体内或离体施用至细胞。
可以考虑将本公开的分离核酸或多肽“过表达”，即以相对于其在其原产生物体的细胞中的自然表达或者相对于在重组宿主细胞中的其他蛋白的表达更高的水平表达。所述过表达可以通过包括放射标记和/或蛋白纯化的各种方法进行评估。然而，优选简单直接的方法，例如，涉及SDS/PAGE和蛋白染色或免疫印迹及后续的定量分析(如对所得凝胶或印迹的光密度扫描)的那些方法。重组蛋白或肽的水平相对于转染细胞中的天然水平的的特定增加指示着过表达，同样特定蛋白相对于由宿主细胞产生的其它蛋白和例如在凝胶上可见的相对丰度也指示过表达。
本公开的其它方面涉及分离，如所编码的分离多肽或免疫原的纯化、在某些实施方式中为基本纯化。本文所用术语肽或蛋白与多肽或免疫原同义。本文所用术语“纯化的”或“分离的”多肽、肽或蛋白意在指代可与其它成分相分离的组合物，其中所述蛋白或肽相对于其天然可获取状态或其在细胞中表达的状态(即在本情形中，相对于其在细胞内的纯度)被纯化至任何程度。因此，分离的蛋白或肽也指从其可能天然存在的环境游离的蛋白或肽。
通常，“纯化的”或“分离的”是指已进行分级以除去其他成分的蛋白或肽组合物，且该组合物基本保留其表达的生物活性。当使用术语“基本”纯化时，这一称谓是指其中蛋白或肽形成组合物的主要成分，例如构成该组合物中蛋白的约50％以上。
根据本公开并基于本领域的常识，对蛋白或肽的分离程度进行定量的各种方法是本领域技术人员所已知的。这些方法包括例如，确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估某级分内的多肽数量。评估级分纯度可选方法是，计算该组分的特异性活性，将其与初始提取物的比活性相比较，并因此计算纯度，本文通过“-倍纯化数”进行评估。当然，用来表示纯化量的实际单位将取决于选用与跟踪纯化的特定测试技术以及所表达的蛋白或肽是否展示出可检测的活性或者可以由如ELISA测试等识别。
适用于蛋白分离的各种技术是本领域技术人员所公知的。这些技术包括例如，采用硫酸铵、聚乙二醇和抗体等或通过加热变性进行沉淀然后离心；色谱步骤，如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、羟基磷灰石色谱和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术与其它技术的组合。如本领域所公知，据信可以改变不同纯化步骤的进行顺序，或可以省略某些步骤，而仍然产生合适的用于制备基本分离的蛋白或肽的方法。
并没有一般性地要求蛋白或肽总是以其最佳分离的状态提供。实际上，据考虑基本分离度更低的产品在某些实施方式中具有功用。部分分离可以通过使用更少的纯化步骤组合或通过利用相同一般性纯化方案的不同形式来完成。例如，可以意识到，与利用低压色谱系统的相同技术相比，利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱通常会产生更大倍数的纯化。展现出更低的相对分离度的方法可能在蛋白产物的总回收率或在维持表达的蛋白的活性方面具有优势。
已知在不同SDS/PAGE条件下，多肽的迁移可能有所不同，有时显著不同(Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76：425，1977)。因此，可以意识到，在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可能有所不同。
本发明的方法还列举性地包括从宿主细胞或宿主细胞培养基分离本发明的多肽。蛋白分离方法列举性地包括柱色谱、亲和色谱、凝胶电泳、过滤或其它本领域已知方法。可选地，将免疫原与亲和纯化可操作的标签一同表达。标签可选的是6×His标签。带6×His标签的本发明的免疫原列举性地通过Ni-NTA柱色谱或使用与固相基体融合的抗6×His标签抗体(Geneway Biogech，San Diego，CA)来分离。同样可采用其它标签和纯化系统。
可以意识到，免疫原可选地不具有标签。在某些实施方式中，分离可选地通过本领域已知方法实现，所述方法列举性地包括离子交换色谱、亲和色谱、盐沉淀(如采用硫酸铵、硫酸链霉素或硫酸鱼精蛋白)、反向色谱、尺寸排阻色谱(如凝胶排阻色谱)、HPLC、固定化金属螯合物色谱或本领域已知的其它方法。在不背离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以选择最合适的分离和纯化技术。
免疫原及其类似物可选地通过化学合成。化学合成法已经产生了长度大于600个氨基酸的含有或不含有修饰(如糖基化和磷酸化)的蛋白。化学蛋白和肽合成的方法列举性地包括固相蛋白化学合成和溶液相肽合成，或通过Hackeng，TM等，Proc NatlAcad Sci U S A，1997；94(15)：7845-7850(本文通过援引并入其内容)的方法进行。列举性的化学蛋白合成方法由Miranda，LP，Peptide Science，2000，55：217-226和Kochendoerfer GG，Curr Opin Drug Discov Devel.2001；4(2)：205-214进行了综述，本文通过援引并入其内容。
免疫原可选地通过以下测定来表征，所述测定包括但不限于蛋白印迹、通过生物物理测定的大分子质量测定、SDS-PAGE/染色、HPLC、ELISA、质谱、抗体识别测试、细胞活力测试、凋亡测试以及通过细胞、蛋白或抗体的过继转移来推断免疫保护或免疫病理学的测试。
可选地，对免疫原进行修饰以增加其免疫原性。在非限制性实施例中，免疫原与化合物或免疫原性载剂偶联，条件是该偶联不会干扰抗原或载剂的所需生物活性。偶联可选地通过共价连接进行。对于偶联策略中的某些一般性考虑的综述参见“Antibodies，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，E.Harlow和D.Lane编著(1988)，本文通过援引并入其全部内容。本领域中已知的可用免疫原性载剂包括但不限于钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、PPD(结核菌素的纯化蛋白衍生物)、红细胞、破伤风类毒素、霍乱类毒素、琼脂糖珠、活性炭或膨润土。可用于偶联的化合物包括但不限于二硝基酚类和氨苯砷酸(arsonilic acid)。
免疫原还可通过其它技术进行修饰，列举性地包括利用热和/或SDS的变性。
本发明的免疫原还可以以药学上可接受的盐的形式使用。合适的能与本发明的免疫原形成盐的酸和碱是本领域技术人员所公知的，并且包括无机酸和有机酸以及无机碱和有机碱。
在另一方面，本发明提供了多组分疫苗。可选地，多组分疫苗含有多于一种抗原。本发明的疫苗可选地在单一疫苗中含有2、3、4、5、6、7、8、9、10种或多于10种免疫原。可选地，第一免疫原是对应于SEQ ID NO：1(RSVA2毒株)的第164位氨基酸～第176位氨基酸或其类似物的多肽。可选地，第一免疫原是对应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7(RSV B_18537)、SEQ ID NO：8(RSVGA_CH17)的第163位氨基酸～第190位氨基酸或其类似物的多肽。可以意识到，本文所描述或本领域已知的任何上述修饰、突变或变化对于本发明的创造性免疫原而言都是可行的。可选地，第一免疫原是SEQ ID NO：2(RSVGA_A2)的多肽。
可选的第二免疫原是对应于SEQ ID NO：1的第155位氨基酸～第206位氨基酸或其类似物的多肽，或对应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的第163位氨基酸～第190位氨基酸或其类似物的多肽。可选地，第一免疫原和第二免疫原的差异为至少一个原子。可选地，第二免疫原是比第一免疫原更长或更短的肽。可选地，第一免疫原和第二免疫原赋予独特的但可能重叠的免疫原特性。
可选地，第二免疫原是SEQ ID NO：3(RSVGA_A2)、SEQ ID NO：4(RSVGA_A2)、SEQ ID NO：5(RSVGA_CH17)或SEQ ID NO：6(RSVGB)的多肽。作为另一种选择，第二免疫原是SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的类似物。
本发明的疫苗可选地为具有两种免疫原的多组分疫苗，所述免疫原诸如作为SEQID NO：1或SEQ ID NO：7的第163位氨基酸～第190位氨基酸或其类似物的免疫原和对应于SEQ ID NO：1的第155位氨基酸～第206位氨基酸或其类似物的第二免疫原。
此外还可意识到的是，本发明的第一免疫原和/或第二免疫原或其它多肽可选地位于含有其它免疫原的疫苗中。例如，其它免疫原包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或RSV F蛋白或其类似物的免疫原。不必存在整个RSV F蛋白序列。可用于诱导免疫响应的RSV F蛋白片段作为多组分疫苗的组分是可行的。可以意识到，与F蛋白序列相关的免疫原可能是其类似物。可以意识到，在某些实施方式中，疫苗不含RSV F蛋白或其衍生物，例如，可选地疫苗中不存在RSVF蛋白或其衍生物。
第一免疫原和第二免疫原可选地被分开表达、分离和作为单独多肽配制，并随后合并以形成单一疫苗以用于通过单次剂量或可用于在受试对象中诱导保护性免疫响应的其它给药计划来施用。作为另一种选择，第一免疫原和第二免疫原在同一宿主细胞中共表达。共表达可选地通过在相同或不同表达载体上表达各个多肽序列而进行。多肽可选地通过在宿主细胞中同时表达来共表达，或通过将宿主细胞暴露于不同条件以表达一种多肽同时使另一种多肽的编码序列保持在非表达性状态中来差异性表达。同时或差异性地将产生的表达多肽纯化或使其适于施用。
可选地，第一免疫原和第二免疫原存在于同一表达系统中。第一免疫原和第二免疫原可选地与连接子结合。连接子可选地为中间体多肽片段。可选地，编码第一免疫原和第二免疫原的核酸序列通过核糖体结合位点连接。如此，每个基因可能存在于单独的质粒或其它表达系统上，并同时或差异性地得到表达。
当第一免疫原和第二免疫原由作为多肽序列或部分多肽序列的连接子连接时，该中间体序列可选地是可切除的。中间或末端蛋白或肽切除通过本领域已知方法进行。例如，切除通过蛋白酶切割进行。蛋白酶可选地为Xa因子、凝血酶或其它本领域已知的基本特异性蛋白酶。蛋白酶可选地识别连接子内的一个或两个位点。
可选地，本发明的疫苗含有佐剂。合适的佐剂列举性地包括二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)；单磷酰脂A(MPL)；LTK63、亲脂性季铵盐-DDA、DDA-MPL、铝盐、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾、Montanide ISA-51、ISA-720、微粒、免疫刺激复合物、脂质体、病毒体、病毒样颗粒、CpG寡核苷酸、霍乱毒素、来自大肠杆菌的不耐热毒素、脂蛋白、树突细胞、IL-12、GM-CSF、列举性地包括磷酸钙纳米颗粒在内的纳米颗粒、用以形成纳米乳液的大豆油、乳化剂和乙醇的组合；AS04、ZADAXIN或其组合。
免疫原可选地作为裸多肽、裸核苷酸、在水溶液中、在乳化液中或在其它合适的递送组合物中进行递送。在某些实施方式中，免疫原作为疫苗或作为药物包的疫苗组分而递送。可选地，疫苗(或多种疫苗)存在于由合适的乳化剂构成的乳化液中。可选地，多组分疫苗是经乳化的。可选地，单亚基疫苗是经乳化的。合适的乳化剂列举性地包括超分子生物载体(SMBV)、纳米颗粒，如Major，M等，Biochim.Biophys.Acta，1997，1327：32-40；De Migel，I等，Pharm.Res.，2000，17：817-824；美国专利第6,017,513、7,097,849、7,041,705、6,979,456、6,846,917、6,663,861、6,544,646、6,541,030、6,368,602号；Castignolles，N.等，Vaccine，1996，14：1353-1360；Prieur，E.等，Vaccine，1996，14：511-520；Baudner B等，Infect Immun，2002，70：4785-4790中所述；脂质体，如El Guink等，Vaccine，1989，7：147-151和美国专利第4,196,191号中所述；或本领域中已知的其它试剂。适合使用的试剂通常可获自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO。乳化剂可选地为二甲基二(十八烷基)溴化铵。可选地，佐剂为单磷酰脂A。
单独或与其它抗原、抗体或核酸序列组合的本发明的蛋白和核酸序列还可以用在治疗性组合物中和用在用于治疗受RSV感染的人类和/或动物的方法中。例如，可以将一种此类治疗性组合物配制为含有载剂或稀释剂以及一种或多于一种的本发明的RSV抗原。治疗性组合物列举性地含有本发明的RSV蛋白、本文所述的核酸序列或其类似物和合适的药物载剂。可选地，治疗性组合物含有SEQ ID NO：1～7的RSV G蛋白片段。可选地，治疗性组合物是多组分疫苗。多组分疫苗可选地含有多肽序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的的免疫原和多肽序列为SEQ ID NO：3的第二免疫原。
合适的药学上可接受的载剂协助蛋白的施用，但其是生理学惰性和/或无害的。载剂可以由本领域技术人员选择。示例性载剂包括无菌水或盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋葡萄糖苷、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、芝麻油和水。另外，载剂或稀释剂可以包括延时材料，如单独或带有蜡的甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。另外，可以使用缓释聚合物制剂。
可选地，本发明的组合物含有常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。可用于本文的合适成分包括例如，酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、二磷酸单钾(monopotassium diphosphate)、乳糖、乳清蛋白水解物和奶粉。
作为另一种选择，或除本发明的RSV免疫原以外，可用于治疗RSV感染的其它试剂(例如，抗病毒剂或免疫刺激剂)可预期用于减少或消除疾病症状。本文可用的试剂可选地起到辅助受感染的人或动物的天然免疫的作用。因此，此类试剂可以与本发明的治疗性组合物协同作用。含有这些试剂的治疗性组合物的开发属于本领域技术人员在本发明的教导下所具有的技术。
含有本文所述免疫原的免疫组合物和其它药物组合物包括在本发明的范围之内。使用疫苗领域技术人员已知的方法和材料，可以单独或组合配置和包装一种或多种上述组合物。免疫响应可能是治疗性或预防性的，并且可以提供抗体免疫或细胞免疫，诸如T淋巴细胞(如细胞毒性T淋巴细胞或CD4+T淋巴细胞)产生的免疫。
为提高免疫原性，可以将本发明的疫苗或免疫原与载剂分子缀合。合适的免疫原性载剂包括蛋白、多肽或肽，诸如白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白及其衍生物，特别是牛血清白蛋白(BSA)和钥孔戚血蓝蛋白(KLH)、多糖、糖类、聚合物和固相。其它衍生自蛋白或衍生自非蛋白的物质是本领域技术人员已知的。免疫原性载剂通常分子量为至少1,000道尔顿，并且可选地为大于10,000道尔顿。载剂分子通常含有促进与半抗原共价缀合的反应性基团。氨基酸的羧基或氨基或者糖蛋白的糖基通常以此方式使用。缺乏此类基团的载剂通常可以与适当的化学剂反应以产生这些基团。可选地，在将免疫原注入动物时产生免疫响应，所述动物诸如人类、灵长类、小鼠、兔、大鼠、山羊、绵羊、豚鼠、鸡和其它动物，可选地为小鼠和人类。作为另一种选择，包含抗原或者抗原学或免疫学等价的抗原的多个拷贝的多抗原肽可能具有足以在不使用载剂时改善免疫原性的抗原性。
本发明的疫苗和免疫原可选地与佐剂一同施用。可选地，佐剂是明矾(磷酸铝或氢氧化铝)。此外，本发明还可采用经化学限定的制剂，诸如胞壁酰二肽、单磷酰脂A、磷脂缀合物、该缀合物在脂蛋白体内的包封以及该蛋白在脂质囊泡中的包封。
本发明还提供了用于通过施用本文所述的组合物来治疗经诊断患有RSV疾病和与RSV感染相关的病况(诸如细支气管炎、上呼吸道感染和下呼吸道感染)的个体的方法。
此外，本发明还提供了在受试对象中创建免疫响应的方法或者治疗或预防受试对象中的RSV感染的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的本发明的疫苗、免疫原、分子、抗体或编码肽的核酸。可选地，疫苗包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的免疫原或者SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的多种多肽的组合。
如本文所用，术语“免疫响应”是指受试对象中对于抗原的生理学响应的提高或降低。列举性的免疫响应包括但不限于白细胞运输的降低；T细胞激活细胞毒性T淋巴细胞激活CD4+细胞、CD11b+细胞、NK细胞、DX5+细胞、B220+细胞或RB6-8C5+PMN细胞的群调节；病毒清除速率改变；白细胞运输改变；干扰素γ(IFN-γ)生产的改变；病毒复制速率减低或本领域认可的其它免疫响应。如果任何免疫响应防止RSV感染、提供RSV清除、防止RSV进入细胞或本领域认可的其它预防，则免疫响应是保护性免疫响应。
本发明的方法还提供了对第二疫苗的使用。第二疫苗可选地包含对应于SEQ IDNO：1的第155位氨基酸～第206位氨基酸或其类似物的多肽。可选地，第二疫苗包含具有SEQ ID NO：2～6的氨基酸序列的免疫原。可选地，第二疫苗是具有两种或多于两种免疫原的多组分疫苗。可选地，第二疫苗包含SEQ ID NO：3～6的任一种的免疫原。可选地，第一疫苗或第二疫苗是RSV。可选地，第一疫苗或第二疫苗是福尔马林灭活的RSVA2或其它灭活毒株。可选地，第一疫苗或第二疫苗或免疫原不是病毒。
第二疫苗可选地与第一疫苗同时施用。可选地，第二疫苗在第一疫苗之前或之后施用。
现有的RSV疫苗遭受多种不良副作用，包括在幼儿中施用福尔马林失活的疫苗后RSV相关疾病的严重性增加。与现有减毒RSV疫苗施用后的疾病增强有关的是肺组织中嗜酸性粒细胞的增加(Haynes，L.等，J Virol，2003；77：9831-9844)。针对RSV G蛋白中的表位区或在用本发明的疫苗接种后发展出的抗体降低了受试对象中RSV感染后肺部嗜酸性粒细胞增多，从而表明在与传统福尔马林减毒RSV疫苗组合时得到改善的安全性和效力(例如，图4或图5)。因此，在本发明的某些实施方式中，本发明的疫苗在其他RSV疫苗之前、同时或之后施用。
本发明可选地与抗病毒组合物一同递送、在其之前递送或在其之后递送。抗病毒组合物列举性地包括RSV复制和感染的药物样小分子抑制剂、核苷类似物，如利巴韦林、EICAR、吡唑呋喃菌素、3-脱氮鸟嘌呤、GR92938X和LY253963。这些抑制剂靶向抑制肌酐单磷酸脱氢酶(IMPDH)。在本文中也可采用针对抑制病毒吸附和进入的抑制剂。列举性地，此类抑制剂如多金属氧酸盐(polyoxometalate)和CL387626(Wyeth-Ayerst，Pearl River，NY)。多金属氧酸盐的其它实例有T118、Trimeris的苯并蒽酮、BABIM和RD30028。也可采用RSV的反义核苷酸抑制剂，如V590，一种靶向RSV NS1/NS2基因中的残基的抑制剂。
可选地，将免疫原加入药物载剂，如盐水、右旋葡萄糖、水、甘油、乙醇、其它治疗性化合物及其组合。所述制剂应该适于施用模式并且包含如肝素等其它免疫修饰剂。组合物还可含有其它额外的生物学惰性成分，如香料、填料等。
合适的施用方法包括但不限于肌内、静脉内、鼻内、粘膜、口腔、胃肠外、阴道内、透皮、经由气溶胶递送或产生所需生物效应或免疫响应的任何途径。
本发明的疫苗可选地以用于经胃肠外(即，肌内、皮内或皮下)施用或鼻咽(即，鼻内)施用进行免疫的单剂量包装。疫苗可选地通过吸入递送。疫苗可选地与药学上可接受的载剂组合以促进施用。载剂通常为带有或不带防腐剂的水或缓冲盐水。可以将疫苗冻干以便在施用时重悬浮于溶液中。
对本发明的疫苗进行可选的微胶囊化还可提供受控释放。许多因素有助于选择特定的微胶囊化用聚合物。聚合物合成和微胶囊化过程的重现性、微胶囊化材料和加工的成本、毒理学概况、不同释放动力学的要求以及聚合物和抗原的物化相容性都是可以考虑的因素。可用聚合物的实例列举性地包括聚碳酸酯、聚酯、聚氨酯、聚原酸酯、聚酰胺、d，l-丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)和其它生物可降解聚合物。
本发明的疫苗可以额外含有稳定剂，如硫柳汞(乙基(2-巯基苯甲酸-S)汞钠盐(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)或生理学上可接受的防腐剂。
根据本发明的方法，可以通过施用有效量的本发明疫苗来治疗人类或动物的RSV、其它病毒感染或细菌感染。可选地，将疫苗预防性地施用。“有效量”是会在受试对象中引起免疫响应的量。例如，本发明的组合物的有效量对于幼儿和成年在纳克/kg～毫克/kg的量的范围内。对于更轻或更重的体重的等效量可以容易地确定。应该调整剂量以适应对其施用组合物的个体，并且剂量会随个体的年龄、体重和代谢而不同。所需的组合物的确切量会在不同受试对象之间有所不同，这取决于受试对象的物种、年龄、体重和一般状况、所用的具体肽或多肽和其施用模式等。适当的量可由本领域普通技术人员仅使用本文的教导所给出的常规实验来确定。本领域技术人员会认识到，剂量最好由从业医师或兽医师来进行优化，并且用于确定剂量和方案以及制备剂型的方法描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，(Martin，E.W.编著，最新版)，Mack Publishing Co.，Easton，PA中。可选地，单次施对于诱导免疫响应是可行的。
本文描述了涉及常规生物技术的方法。此类方法是本领域公知的并且在以下方法学专著中详细描述，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，第1-3卷，Sambrook等编著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1992(定期更新)；和Short Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编著，第52版，Wiley-Interscience，New York，2002。免疫学方法(例如，抗原-特异性抗体的制备、免疫沉淀和免疫印迹)在例如Current Protocols in Immunology，Coligan等编著，John Wiley & Sons，New York，1991；和Methods of ImmunologicalAnalysis，Masseyeff等编著，John Wiley & Sons，New York，1992中有所描述。
额外的规程(如PCR规程)可见于A Guide to Methods and Applications AcademicPress，NY。蛋白纯化的方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱色谱、电泳、离心和结晶等方法，参见例如Ausubel等(1987和定期增补)；Deutscher(1990)“Guide to ProteinPurification，”Methods in Enzymology第182卷和该丛书的其它卷；Current Protocols inProtein Science，John Wiley and Sons，New York，NY；以及利用本领域技术人员已知的蛋白纯化产物的制造商文献。
神经细胞生物活性用测试描述于例如Wouterlood(1995编著)NeuroscienceProtocols modules 10，Elsevier；Methods in Neurosciences Academic Press；和Neuromethods Humana Press，Totowa，NJ中。
FACS分析列举性地描述于Melamed等，(1990)Flow Cytometry and SortingWiley-Liss，Inc.，New York，NY；Shapiro(1988)Practical Flow Cytometry Liss，New York，NY；和Robinson等(1993)Handbook of Flow Cytometry Methods Wiley-Liss，New York，NY中。
通过以下非限制性实施例对本发明的各个方面进行说明。所述实施例出于列举性目的而非对本发明的任何实践的限制。可以理解，在不背离本发明的主旨和范围时，可以进行变化和修改。虽然所述实施例通常针对哺乳动物组织、具体而言对小鼠组织的分析，本领域普通技术人员了解相似技术和本领域中已知的其它技术易于将所述实施例转化至其它哺乳动物，如人类。本文所示的试剂通常在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，或者具有相似性质的替代性试剂可商购获得，且本领域普通技术人员易于了解这些试剂可以从何处获得。在本发明的概念内的变化对于本领域技术人员是显而易见的。额外的试剂以及如免疫原等蛋白、细胞等的制备列举性地可见于WO97/27299和美国公开第2006-0018925号中，本文通过援引并入其内容。
实施例1.免疫原的制备
RSV G蛋白免疫原作为具有药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物而制备。例如，在用IPTG诱导后，本文所述且由经修饰的pET-32-LIC质粒中所含核酸所编码的RSV G蛋白序列，作为硫氧还蛋白(Trx)-融合蛋白表达在用IPTG诱导后的经转化的大肠杆菌BL21/DE3细胞中。通过用8M尿素萃取来从转化细胞的球团(pellet)中回收所有Trx-融合蛋白，然后使用TALON(Clontech，Palo Alto，加州)进行亲和纯化并相对于PBS进行透析。通过用多粘菌素B珠(BioRad，Hercules，CA)处理来使纯化的Trx-RSV G多肽免受内毒素污染。这一过程的细节和更改是本领域普通技术人员公知的。在用于免疫时，将免疫原进而与佐剂(如明矾或基于蛋白体的佐剂)合并或组合。
作为另一种选择，使用同时多固相肽合成法在肽合成仪(Perkin-Elmer AppliedBiosystems，Berkeley，CA)上合成免疫原，并通过反相液相色谱和毛细管电泳来检测同质性。
通过确定细胞粘附来对免疫原的与CX3C受体类型结合的能力进行测试。将含有CX3CR1基因和新霉素抗性基因的pcDNA 3.1质粒稳定转染至人胚胎肾(HEK)细胞。新霉素抗性用于选择和维护人胚胎肾细胞的质粒转染。为证实转染，在蛋白印迹分析中用抗CX3CR1抗体对CX3CR1转染的HEK细胞的裂解物进行染色或将完整转染细胞通过流式细胞仪进行检查。基本如Combadiere，C.等，J.Biol.Chem.，1998，273：23799-23804(本文通过援引并入其内容)中所述检查经纯化的125I-G糖蛋白与293-CX3CR1细胞的结合。将处在结合缓冲液(具有1mg/ml牛血清白蛋白和0.01％叠氮化物的Hanks缓冲盐水溶液，pH 7.4，最终体积200μl)中的纯化125I-G糖蛋白与106个CX3CR1转染的HEK细胞在不存在或存在不同浓度的未标记免疫原(野生型序列或类似物序列)时温育。在室温温育2小时后，用1ml结合培养基洗涤细胞。如洗涤后来自细胞球团的γ发射的减少所揭示，野生型G-糖蛋白免疫原序列的存在有效地与125I-G糖蛋白竞争对细胞的结合。类似物序列的存在显示出改变的竞争，表明类似物相对于野生型序列的CX3C受体结合的改变。
实施例2.RSV的制备
基本如Tripp，RA等，J.Virol.1999，73：7099-107中所述，在Vero细胞(ATCC CCL881)中繁殖RSV的A2毒株。简言之，将Vero细胞维持在补充有2％热失活(56℃)胎牛血清(FBS；HyClone Laboratories，Salt Lake City，Utah)、1％L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌素(均来自GIBCO)的DMEM(GIBCO Laboratories，Grand Island，N.Y.)(TCM)中。在出现可检测的细胞病理效应后，倾去TCM并更换为最小体积的Dulbecco氏改性磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)然后在-70℃冷冻。将烧瓶解冻，用细胞刮刀(Costar，Cambridge，马萨诸塞州)将松散粘附的细胞单层刮下并收集。将细胞与上清液在-70℃冷冻、解冻然后于-4℃在2,000×g离心15分钟。通过对Vero细胞进行甲基纤维素菌斑测试来确定病毒滴度。
实施例3.进行抗RSV G单克隆抗体处理
将8至10周龄的无特异性病原体的雌性BALB/c小鼠(The Jackson Laboratories)用作研究对象。将小鼠圈养在微型隔离笼(micro-isolator cage)中并饲以无菌水和随意食物。所有研究均根据公共动物护理和使用委员会的准则进行。
通过腹膜内(i.p.)施用阿佛丁(2％ 2，2，2-三溴乙醇、2％叔戊醇，180mg/kg～250mg/kg)来将小鼠麻醉，并用处于无血清DMEM(50μl体积)中的106PFU的RSV进行鼻内(i.n.)激发。通过腹膜内施用对感染后(p.i.)3日的小鼠给予150μg/小鼠(低剂量)～300μg/小鼠(高剂量)的抗G糖蛋白(131-2G，内毒素＜5EU/mg)单克隆抗体或对照正常小鼠IgG(Pierce)。每个时间点检测不少于3只小鼠/个处理。
实施例4.抗RSV G mAb处理减少了肺白细胞浸润
如Haynes LM等，J.Infec.Dis.，2009，200(3)：439-447所述，对用对照正常小鼠IgG或抗RSV G单克隆抗体处理的RSV感染小鼠进行肺白细胞运输分析。简言之，将小鼠用阿佛丁(2，2，2-三溴乙醇)麻醉并通过切断右肱动脉放血。通过用1mL Dulbecco氏PBS灌洗肺3次来收获支气管肺泡白细胞。将BAL细胞在含1％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的Dulbecco PBS(GIBCO)中洗涤，然后用适当的异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的、别藻蓝蛋白(APC)缀合的或藻红蛋白(PE)缀合的抗CD3ε(145-2C11)、抗CD45R/B220(RA3-6B2)、抗CD8(Ly-2)、抗嗜中性粒细胞(PMN)(RB6-8C5)、抗CD11b(M1/70)抗体或同种型抗体对照(BDBiosciences，Inc.)的稀释液染色(4℃，30分钟)。
与对照处理的小鼠相比，到感染后5日时，抗G抗体处理与肺白细胞运输和肺中病毒滴度的显著减少相关。到感染后7日，受处理小鼠的肺浸润水平继续展示出显著减少的肺细胞浸润。
在处理后的几个时间点确定受抗G单克隆抗体处理影响的肺泡炎性细胞类型以及支气管肺泡灌洗(BAL)细胞亚群(表1)。免疫与感染后5日时CD4+和CD11b+细胞运输的显著减少以及BAL细胞群体中的CD8+、DX5+NK和RB6-8C5+PMN细胞的中度减少相关。到感染后7日，免疫减少了所检验的所有细胞亚群的数目。
表1.nIg表示经对照正常小鼠IgG处理的小鼠，抗G表示用抗RSV G抗体处理的小鼠，p.i.表示感染后天数
(Day p.i.：感染后天数；Phenotype：表型；anti-G：抗G；％Reduction：减少％)
实施例5.抗G抗体处理减少了肺中感染后IFNγ水平
使用捕获酶联免疫测试试剂盒根据制造商说明(eBiosciences，San Diego，CA)对小鼠肺分析无细胞支气管肺泡灌洗(BAL)液中的IL-4和IFNγ水平。抗体处理与低水平IL-4处的差异无关(图1A)。相反，抗体处理显著减少了无细胞BAL上清液中的IFNγ水平(图1B)。
实施例6.RSV感染后给予的抗体使RSV水平降低
在两次皮下施用处在明矾中的免疫原的第二次后14天，收集来自个体小鼠的血清，如实施例3所述。将预先滴定的RSV的等分试样与个体小鼠血清的系列稀释样品混合，并在室温温育1小时并通过菌斑减少测试来检测RSV中和抗体。一式两份地将混合物应用于含有60％～80％汇流的HEp-2或Vero细胞单层的24孔板，在4℃吸附90分钟，随后洗涤并在1ml补充有1％胎牛血清的RPMI培养基中于37℃使所述板温育40小时。温育后，将单层用15％甲醛或80∶20的丙酮∶PBS固定并用0.01％结晶紫染色或免疫染色以使病毒斑块可见。斑块减少以斑块减少中和滴度50(PRNT50)来计算，其为中和亚汇流(sub-confluent)HEp-2或Vero细胞单层上的50％RSV斑块所需的血清稀释度的倒数。采用164～176RSV G区多肽或引入163～190RSV G区多肽以及155～206RSV G区多肽的多组分疫苗进行的免疫，展示出较强的中和抗体响应。
实施例7.抗体处理的小鼠中RSV滴度减少
如之前Sullender，W，Virology，1995；209：70-79所述，确定RSV感染的小鼠的肺中的病毒滴度。简言之，在感染后3、5、7或11日从每组3～4只小鼠中将肺无菌去除并在测试前储存于-70℃。对肺进行称重，并将各个肺样品在1ml冷的无菌Dulbecco氏PBS(GIBCO)中均质化，并将肺均质液的10倍系列稀释液(在无血清DMEM中)添加至24孔板中汇流的Vero细胞单层。在37℃吸附2小时后，在细胞单层上覆盖含有10％FBS(Hyclone，Logan，UT)的组织培养基DMEM(GIBCO)，于37℃温育3～4天，然后通过用针对G和F蛋白的单克隆抗体进行免疫染色来计数(分别为232-1F、130-6D和131-2A)。
在感染后5日(对应于该模型中病毒复制的峰值期)，经免疫的小鼠中的病毒滴度显著减少(P＜0.016)，且到第7日，病毒水平低于检出限(图2)。
实施例8.经抗RSV G单克隆抗体处理的FI-A2免疫的小鼠中的肺嗜酸性粒细胞增多的减少
用106PFU当量的福尔马林灭活RSV/A2(FI-A2)对小鼠(6～8周龄)在浅表臀肌中进行免疫，并静息4周。在用106PFU活RSV激发前1日，通过腹膜内施用给予小鼠300μg/小鼠的抗G糖蛋白(131-2G，内毒素＜5EU/mg)单克隆抗体或对照正常小鼠IgG(Pierce)(如实施例3所述)。根据Mader等，Vaccine 18：1110，2000所述程序确定嗜酸性粒细胞增多的诱导。用抗RSV G单克隆抗体(131-2G)进行的处理保护小鼠不受RSV激发影响。令人感兴趣的是，在炎症峰值期(感染后5日)，与对照抗体处理的小鼠相比，肺嗜酸性粒细胞增多的水平明显减少(图3)。
实施例9.G蛋白免疫防止了FI-A2诱导的毒性
将8至10周龄的无特异性病原体的雌性BALB/c小鼠(The Jackson Laboratories)用作免疫对象。将小鼠圈养在微型隔离笼中并饲以无菌水和随意食物。所有研究均根据公共动物护理和使用委员会的准则进行。
采用该G多肽的免疫会诱导与实施例3所述的抗G单克隆抗体起到类似作用的抗G抗体并且抑制与FI-RSV免疫相关的肺部疾病。将小鼠(6至8周龄)1)用106PFU当量的福尔马林灭活RSV/A2(FI-A2)在浅表臀肌中进行免疫并静息24小时，然后1)用KLH缀合的RSV CH17肽(aa163～190；SEQ ID NO.5)(FI-A2+KLH-CH17-1日)(10μg蛋白，在50μl体积的PBS/Titermax中)在后肢上进行皮下免疫；2)静息4周然后用KLH缀合的RSV CH17肽(FI-A2+KLH-CH17-4周)(10μg蛋白，在50μl体积的PBS/Titermax中)免疫；或3)用PBS对照(50μL)在相当的时间进行加强免疫。肽免疫2～3周后，用KLH-CH17的PBS溶液对两组经肽加强免疫的小组进行腹膜内加强免疫。
第二次肽加强免疫两周后，用无血清DMEM(50μl体积)中的106PFU活RSV A2进行鼻内激发，并确定总支气管肺泡灌洗(BAL)细胞(图4A)、嗜酸性粒细胞浸润(图4B)、IL-4细胞因子产生(图4C)和体重(图4D)。在每个时间点每个处理检验不少于3只小鼠。
在用F1-A2免疫后1日或4周加强免疫的小鼠在RSV激发后3、5、7日显示出灌洗液中的总细胞计数显著下降(图4A)。相应地，在所有3个分析日，嗜酸性粒细胞增多统计学上显著减少(图4B)。在4周加强免疫组中在第5日观察，IL-4水平趋于降低水平，具有统计学显著性(图4C)。在图4D中观察到疾病严重性的重要标记物，在该图中FI-A2单独免疫的小鼠在激发后5日展示出多达10％的体重损失。在FI-A2后1日或4周进行加强免疫防止了在相同时间段的体重损失。
实施例10.第二G蛋白序列防止了FI-A2诱导的毒性
将小鼠(6至8周龄)1)用106PFU当量的福尔马林灭活RSV/A2(FI-A2)在浅表臀肌中进行免疫并静息24小时，然后1)用KLH缀合的RSV A2肽(SEQ ID NO：4)(FI-A2+KLH-A2-1日)(10μg蛋白，在50μl体积的PBS/明矾中)在后肢上进行皮下免疫；2)静息4周然后用KLH缀合的RSVA2肽(FI-A2+KLH-A2-4周)(10μg蛋白，在50μl体积的PBS/明矾中)免疫；或3)用PBS对照(50μL)在相当的时间进行加强免疫。肽免疫2～3周后，用KLH-A2的PBS溶液对两组经肽加强免疫的小组进行腹膜内加强免疫。
第二次肽加强免疫两周后，用无血清DMEM(50μl体积)中的106PFU活RSV A2进行鼻内激发，并确定总支气管肺泡灌洗(BAL)细胞(图4A)、嗜酸性粒细胞浸润(图4B)、IL-4细胞因子产生(图4C)和体重(图4D)。在每个时间点每个处理检验不少于3只小鼠。
与实施例9中用CH17(SEQ ID NO：5)加强免疫后观察到的结果相似，在用F1-A2免疫后1日或4周用KLH-A2(SEQ ID NO：4)加强免疫的小鼠显示出RSV激发后3日和5日在灌洗液中的总细胞计数的显著减少(图5A)。相应地，在所有3个分析日，嗜酸性粒细胞增多统计学上显著减少(图5B)。IL-4水平趋于降低水平(图5C)。相对于在F1-A2免疫组中观察到的体重损失而言生物体疾病严重性下降，其中在FI-A2后4周加强免疫在3至7日未产生体重损失。在第1日加强免疫的小鼠在第3日显示出轻度体重损失，并到第7日时逆转为中度体重增长，从而表明更快的恢复。
实施例11.用RSV B毒株G蛋白肽aa155-206进行免疫诱导了疾病严重性降低和F1-A2诱导的毒性的降低
将小鼠如实施例9用B毒株G蛋白肽aa155-206(SEQ ID NO：6)进行免疫并如实施例4用RSV-A2毒株激发或用RSV-B1毒株激发。虽然RSV B G蛋白相对于A毒株具有独特的序列，但用SEQ ID NO：6的肽进行免疫展示出肺嗜酸性粒细胞增多的水平与此前用替代性疫苗进行的免疫尝试相比降低。在如实施例8和9进行疾病严重性测定时，采用SEQ ID NO：6进行免疫还相对于对照小鼠而言减少了体重损失和IL-4水平。此外，与用SEQ ID NO：4免疫相似，用对应于B毒株的肽(SEQ ID NO：6)免疫的小鼠，展示出在处理后的几个时间点确定的炎性支气管肺泡灌洗(BAL)细胞亚群的相似减少。免疫与感染后5日时CD4+和CD11b+细胞运输的显著减少以及BAL细胞群体中的CD8+、DX5+NK和RB6-8C5+PMN细胞的中度减少相关。到感染后7日，免疫减少了所检验的所有细胞亚群的数目。
实施例12.用RSV B G蛋白片段进行加强免疫保护免受F1-A2诱导的毒性
将小鼠如实施例9进行免疫并在免疫后1日或免疫后4周用KLH缀合肽SEQ IDNO：6进行加强免疫。采用SEQ ID NO：6观察到了与A2和CH17肽的结果相似的结果。在用F1-A2免疫后1日或4周加强免疫的小鼠显示出在RSV激发后3、5和7日在灌洗液中的总细胞计数的减少。相应地，嗜中性粒细胞在所有三个分析日均减少。IL-4水平趋于水平下降。最后，在第1日或4周用SEQ ID NO：6加强免疫小鼠在相同的时段没有产生激发后体重损失。
实施例13.免疫后产生的抗体使RSV水平下降
在两次皮下施用处在明矾中的免疫原的第二次后14天，收集来自个体小鼠的血清，如实施例3所述。将预先滴定的RSV的等分试样与个体小鼠血清的系列稀释样品混合，并在室温温育1小时并通过菌斑减少测试来检测RSV中和抗体。一式两份地将混合物应用于含有60％～80％汇流的Vero细胞单层的24孔板，在4℃吸附90分钟，随后洗涤并在1ml补充有1％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃温育40小时。温育养后，将单层用丙酮-甲醇混合物固定并通过采用单克隆抗RSV抗体的免疫染色来对斑块进行计数。斑块减少以斑块减少中和滴度50(PRNT50)来计算，其为中和亚汇流Vero细胞单层上的50％RSV斑块所需的血清稀释度的倒数。采用肽SEQ IDNO：4～6或引入163～190RSV G A区多肽以及155～206RSV G B区多肽的多组分疫苗进行的免疫，展示出较强的中和抗体响应。
本说明书中提及的专利和公开表示本发明所属领域的技术人员的水平。这些专利和公开通过援引被并入本文，其程度如同在本文中详细明确地将每篇单独申请或公开具体和单独地进行了表述。
前述描述对本发明的具体实施方式进行了说明，但并非意在限制其实施。后附权利要求、包括其所有等价方式均旨在限定本发明的范围。

Claims (12)

1.一种呼吸道合胞病毒疫苗，所述疫苗包含引起保护性免疫响应的分离免疫原，所述免疫原由如下的氨基酸序列组成：
(i)SEQ ID NO:1的第163位氨基酸～第190位氨基酸、SEQ ID NO:7的第163位氨基酸～第190位氨基酸或SEQ ID NO:8的第163位氨基酸～第190位氨基酸；或
(ii)SEQ ID NO:1的第155位氨基酸～第206位氨基酸。
2.如权利要求1所述的疫苗，其中所述免疫原由氨基酸序列SEQ ID NO:4、SEQID NO:5或SEQ ID NO:6组成。
3.一种包含第一免疫原和第二免疫原的疫苗，
所述第一免疫原为由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的第163位氨基酸～第190位氨基酸组成的分离氨基酸序列；且
所述第二免疫原为由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的第155位氨基酸～第206位氨基酸组成的分离氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的疫苗，其中所述第一免疫原和所述第二免疫原通过连接子共价连接。
5.如权利要求4所述的疫苗，其中所述连接子是可切割性中间体多肽片段。
6.如权利要求3～5中任一项所述的疫苗，其中所述第一免疫原由SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的多肽组成。
7.如权利要求3～5中任一项所述的疫苗，其中所述第二免疫原由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6的多肽组成。
8.如权利要求1～5中任一项所述的疫苗，所述疫苗还包含乳化剂。
9.第一疫苗在制造用于在受试对象中创建免疫响应的药物中的应用，其中所述第一疫苗包含权利要求1～5中任一项所述的疫苗中的免疫原。
10.第一疫苗与第二疫苗的组合在制造用于在受试对象中创建免疫响应的药物中的应用，其中所述第一疫苗包含权利要求1～5中任一项所述的免疫原。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述第二疫苗是SEQ ID NO:1的第155位氨基酸～第206位氨基酸的氨基酸序列；或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的第163位氨基酸～第190位氨基酸的氨基酸序列；或者它们的组合。
12.一种药物包，所述药物包包含：
选自由权利要求1～2中任一项所述的疫苗中的免疫原、权利要求3～5中任一项所述的疫苗组成的组中的免疫原或疫苗；
乳化剂；和
佐剂。
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