CN102703384A - Hpmc水凝胶用于促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HPMC水凝胶用于促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞的用途以及一种HPMC和脂肪干细胞的凝胶细胞混合物的制备方法。本发明的凝胶细胞混合物注射入裸鼠背部皮下组织后，可以诱导淋巴结的产生。本发明的凝胶细胞混合物与机体相容性很好，不诱发免疫排斥反应，具有安全无毒的特性。

Description

HPMC水凝胶用于促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞的用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种HPMC水凝胶用于促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞的用途。 

背景技术

2001年Zuk等^[1]第一次从人抽脂术中的脂肪悬液中分离获得了多向分化干细胞，随着研究的深入，证实其具有干细胞的生物学特性及多向分化潜能，因此被正式命名为脂肪组织来源的干细胞(ADSCs)。由于取材容易，且可把过去抽脂术中弃掉的脂肪悬液变为人干细胞库的重要来源，因此虽然发现较晚，但研究非常迅速深入，现已证实ADSCs具有多分化潜能，能向骨细胞、软骨细胞及肌肉等细胞定向诱导转化，因此有可能成为一种理想的新型的组织工程种子细胞，其有着非常重要的研究和应用价值，这也为各种组织的创伤修复治疗开辟了新的途径^[2-5]。 

脂肪干细胞作为组织工程种子细胞具有其独特的优越性：现今组织工程技术中研究较多的作为种子细胞的干细胞主要有：胚胎干细胞、骨髓基质干细胞和脂肪基质干细胞(ADSCs)等。胚胎干细胞具有向三个胚层组织细胞分化的全能性，但存在论理学、取材来源等方面的限制。ADSCs与骨髓基质干细胞在适宜条件下可都分化为软骨、肌肉、神经和血管等多种组织，ADSCs表型与骨髓基质干细胞类似，其干细胞表面抗原CD29、CD44均为阳性，而CD34、CD45、HLA-DR等造血谱系标记呈阴性^[6]。但与骨髓基质干细胞等相比，ADSCs具有取材容易、取材量大、可多部位反复取材、损伤小、体外增殖快及不必进行永生化处理就能获得足够量的细胞用于损伤修复等优点。而且脂肪细胞分泌的许多脂肪因子，在创伤修复中的各个阶段都发挥着重要作用。此外，ADSCs易于外源基因的导入和表达，以其作为组织工程的种子细胞，不仅可获得预定形态的组织，而且有望获得具有生理功能(如分泌功能)的组织，所以ADSCs展现了广泛的应用前景，有望成为优秀的组织工程种子细胞。 

脂肪基质干细胞与另一类同样起源于中胚层的成体干细胞——骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)不但具有非常相似的生物学特性，而且在细胞表面标志谱的表达方面也非常接近。免疫学研究表明，正常状态下BMSCs不表达HLA II类抗原、B7-1、B7-2、CIMO、CD40L等免疫调节分子。近来研究发现，MSCs具有调节免疫反应的能力，其可不被同种异体的T细胞和自然杀伤细胞识别^[7]。它们仅表达极低水平的II型主要组织相容性复合物(MHC)和中级 水平的I型主要组织相容性复合物分子，而不表达如B7-1，B7-2，CD40，或CD40等共刺激分子^[8]。此外，MSCs似乎具有天然的免疫抑制能力，在体外可抑制幼稚的和记忆T细胞的增殖与免疫反应功能^[9-11]，而bFGF不仅可以促进MSCs的增殖和分化，而且可以在体内提高其免疫抑制潜能。而针对脂肪干细胞的免疫学研究表明，骨髓经放射线照射灭活的小鼠体内输注脂肪干细胞后，其造血与淋巴细胞可在体内重新生成，表明脂肪干细胞在特定体内环境下可促进淋巴细胞的发生 ^[12]。曹谊林等^[13]通过体外实验发现，在正常状态下脂肪干细胞表达HLA I类分子，体外培养第2代的脂肪干细胞未见HLA II类分子明显表达。在IFN一γ刺激后，HLA II类分子表达明显升高，但淋巴细胞未见明显增殖。这一结果与BMSCs的报道非常相符，提示脂肪干细胞可能具有与BMSCs相似的调节淋巴细胞反应的免疫调节功能，因此认为，脂肪干细胞具有与BMSCs相近的低免疫原性，同时具有一定的调节免疫反应的能力，可抑制混合淋巴细胞的体外增殖反应。曾秋棠等^[11]同样发现，hMSCs呈剂量依赖性抑制同种异体淋巴细胞增殖，其机制可能与hMSCs通过分泌TGF-β、L-10促进CD4⁺CD25^-T细胞向表达Foxp3的CD4+CD25+调节T细胞转化，进而发挥免疫抑制作用有关。Panagiota^[15]等观察到，bFGF在体外可以提高MSCs的增殖和分化能力，使MSCs细胞形态和表型也发生了明显的变化，细胞变短失去梭形形态。重要的是，bFGF可上调I型HLA的表达，在体内可以提高其免疫抑制能力，与外周单个核细胞相比仅引起轻度异体免疫反应。FGF还可下调CD44的表达，从而减轻MSCs移植后的植入反应。 

羟丙基甲基纤维素(HPMC)为一种对温度变化敏感的材料，其特点是在转入人或动物体作用部位之前(如25℃室温)或在贮藏温度(4℃)，为粘度很低的流体状态，当注射入人或动物体在局部体温(＞33℃)作用下，粘度迅速上升，可形成凝固态的凝胶。HPMC最大的优点是其水溶性，不需有机溶剂，操作安全、方便，其商品化产品已在临床上作为滴眼剂的增稠剂及药物的缓释剂等广泛应用，足以说明其安全性和无细胞毒性。实践证明，HPMC与机体相容性很好，不诱发免疫排斥反应，在组织修复后于体内逐渐降解吸收，并通过肾脏排泄，降解时间约为6周左右，其降解速度适当，与组织生长速度相匹配。因此，不失为一种理想的组织工程生物支架材料。由于其可注射性及温度敏感性，为创伤修复治疗和重建手术的应用提供了一种新的思路，根据申请人进行的资料检索，还没有将HPMC作为可注射性生物支架材料用于构建工程化淋巴结组织的相关报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞的方法。 

本发明的技术方案如下： 

HPMC在促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞中的应用。 

一种HPMC和脂肪干细胞的凝胶细胞混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 

(1)原代脂肪干细胞培养24h后，吸除培养基，PBS冲洗2次，除去未贴壁的细胞及细胞碎片，在培养瓶中加入细胞因子分化培养基继续传代培养，每2-3天更换培养液一次，细胞因子分化培养基制备方法如下：在DMEM培养基的基础上加入FBS、TGF-β1、bFGF、地塞米松，使得培养基中FBS、TGF-β1、bFGF、地塞米松终浓度分别为10％、10-20μg/L、25μg/L、10^-7mol/L； 

(2)培养瓶中细胞贴壁率达85％时消化传代：PBS冲洗1-2次后，用0.05％胰酶37℃孵育10min，用上述细胞因子分化培养基将细胞吹匀重悬，移入培养瓶培养，隔日换液； 

(3)重复上述传代步骤，将上述传代培养第6代的细胞，按5×10⁶/ml浓度与HPMC搅拌混合制成凝胶悬液，混匀后移入37℃孵箱中培养24h即得到凝胶细胞混合物。优选的，TGF-β1终浓度为15μg/L。 

优选的，凝胶悬液中HPMC粘度系数为50mpa·s、浓度为13％。 

将本发明制备的凝胶细胞混合物注射入裸鼠背部皮下组织后，可以诱导淋巴结的产生。本发明的凝胶细胞混合物与机体相容性很好，不诱发免疫排斥反应，具有安全无毒的特性。并且本发明还详细的研究了HPMC和细胞因子的浓度对最终淋巴结产生的影响，并且获得了最适于产生淋巴结的HPMC以及细胞因子的浓度。 

附图说明

图1不同培养基中ADSCs生长情况图。A为DMEM培养基B为含细胞因子培养基 

图2为不同培养基中ADSCs生长曲线。 

图3为裸鼠皮下组织中淋巴结样组织形成(箭头所示)。 

图4为分化培养ADSCs移植后裸鼠体内所形成淋巴结(HE×100)。 

图5为裸鼠皮下淋巴结组织免疫组织化学染色结果(SP法)。 

图6为10％HPMC扫描电镜照片。 

图7为13％HPMC扫描电镜照片。 

图8为20％HPMC扫描电镜照片。 

具体实施方式

实验内容： 

实验一、人脂肪干细胞的分离培养 

1.组织来源 

实验所用的人脂肪组织来自于第四军医大学唐都医院整形科健康成人超声 乳化后的脂肪组织溶液。 

2实验方法 

2.1人脂肪干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)的体外分离和培养 

2.1.1原代脂肪干细胞的分离培养 

1)取超声乳化后的新鲜脂肪组织乳液约80ml放入广口瓶中； 

2)加入II型胶原酶(1mg/ml，体积比为1∶1)，密封，37℃恒温水平摇床中持续摇动30min； 

3)取出脂肪乳液，用100μm的不锈钢滤网过滤，放入50ml离心管中； 

4)室温3000rpm离心10min； 

5)吸除上层脂肪及上清，仅留0.5ml液体和沉淀； 

6)用吸管重悬沉淀(可将多管合并成1-2管)； 

7)加入约20ml红细胞裂解液，室温静置10min； 

8)250μm的不锈钢滤网重新过滤，滤入干净的离心管中，1800rpm离心10min(去除污染的内皮细胞)； 

9)吸除上清，20ml PBS清洗沉淀； 

10)含10％胎牛血清的DMEM重悬沉淀，移入适当的培养瓶中； 

11)37℃，5％CO₂孵箱中培养。 

2.1.2脂肪干细胞的传代培养 

1)原代细胞培养24h后，吸除培养基，PBS冲洗2次后除去未贴壁的细胞及细胞碎片，更换新的细胞培养基继续培养。在细胞中分别加入如下培养基： 

A)DMEM基础培养液；B)含细胞因子培养基(DMEM、FBS100mL/L、TGF-β1 10μg/L、bFGF 25μg/L、地塞米松10^-7mol/L、青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)。 

2)每2-3d更换培养液一次； 

3)培养瓶中细胞贴壁率达85％左右时消化传代； 

4)消化细胞：PBS冲洗1-2次后，用0.05％胰酶37℃孵育10min； 

5)用上述两种培养基分别将ADSCs吹匀重悬，移入培养瓶培养； 

6)20h后首次换液，去掉未贴壁细胞和杂质，随后隔日换液。 

2.2细胞增值状况分析 

做第二代培养细胞的生长曲线，观察两种培养液培养细胞生长情况。方法如下：用2.5g/L胰蛋白酶消化单层细胞，分别用上述两种培养基将培养ADSCs配成单个细胞悬液，调整细胞浓度为3×10⁴～5×10⁴，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl。37℃培养7d。从第2天开始，每天取出一个培养板，每孔加入MTT溶液(5μg/L)20μL，37℃继续孵育4h后终止培养，吸弃上清，每孔加入 150μL DMSO，在酶标仪中以490nm波长，振荡5min测定OD值，以MTT比色法测定生长曲线。取各时相点吸光度的平均值，以时间(d)为横坐标，吸光度(表示细胞相对数量)为纵坐标，绘制生长曲线。 

2.3流式细胞仪脂肪干细胞表型的鉴定 

2.3.1人脂肪干细胞分离培养 

按照上述步骤和方法进行分离和培养两种不同培养液培养的ADSCs 

2.3.2流式细胞仪分析脂肪干细胞表面标志物及其鉴定 

选取第6代ADSCs进行流式细胞仪检测，培养细胞表面标志物。所有抗体为鼠抗人单克隆抗体CD14-FITC、CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD49d-PE、CD56-PE、CD105-FITC、CD106-PE。 

1)取对数生长期两种不同培养液培养的第6代ADSCs，用0.05％胰酶0.53mMEDTA消化贴壁细胞(室温，10min左右)。 

2)10％FBS的DMEM制成单细胞悬液。 

3)份取100μl单细胞悬液(细胞密度为5×105～1×106个细胞)，加入10μl鼠抗人单克隆抗体与单细胞悬液充分混匀，室温(25℃左右)避光染色15～30min， 

4)BS洗涤液洗2次，每次加洗液2.5ml左右。1000rpm×5min离心，弃上清。 

5)加入终浓度2％的多聚甲醛固定液500μl重悬细胞，FCM分析。 

3实验结果 

3.1人脂肪干细胞在不同培养液中生长增值情况 

原代ADSCs接种后24h内贴壁，长梭形，胞核椭圆，培养7d左右贴壁率达70-80％，呈漩涡状排列(图1A).第3天进入指数增长期，群体倍增时间为55h左右，细胞在第4d进入平台期，经体外传代培养9代后，细胞增殖速度减慢，开始出现衰老征象(图2)。而添加细胞因子TGF-β1 10μg/L和bFGF 25μg/L细胞增殖速度显著增快，随培养时间的延长，细胞体积明显增大，形态由长梭形变为宽大、多伪足的多角形，胞核亦变大，核仁明显(图1B)。培养细胞第2d进入指数增长期，群体倍增时间为30h左右，细胞增殖迅速，生长旺盛，在第8d开始进入平台期，经体外传代培养15代后，细胞增殖速度减慢，开始出现衰老征象(图2)。 

3.2流式细胞仪脂肪基质细胞的表型鉴定 

检测结果见，ADSCs对造血系统来源的特异抗原CD31，CD34，CD45以及CD106表达很低，CD14，CD56和CD105均呈较低表达，而ADSCs所特有的细胞标志CD49d却有较强的表达，这是造血系统来源细胞所不表达的(表1)。由此可以确定所 分离培养的细胞为脂肪基质细胞(ADSCs)。 

表1流式细胞仪检测ADSCs的CD系列抗原标记的表达 

实验二、人脂肪干细胞在裸鼠体内分化为淋巴细胞并构建淋巴结组织 

1实验材料 

1.1细胞来源 

原代脂肪干细胞(ADSCs)获取方法同实验一。 

1.2支架材料 

羟丙甲基纤维素(HPMC) 

2实验方法 

2.1脂肪干细胞的传代培养 

1)原代细胞培养24h后，吸除培养基，PBS冲洗2次，除去未贴壁的细胞及细胞碎片，在培养瓶中分别加入如下培养基继续传代培养：A)DMEM基础培养基；B)细胞因子分化培养基(组成DMEM、10％FBS、TGF-β1 10μg/L、bFGF 25μg/L、地塞米松10^-7mol/L) 

2)每2-3d更换培养液一次 

3)培养瓶中细胞贴壁率达85％左右时消化传代 

4)消化细胞：PBS冲洗1-2次后，用0.05％胰酶37℃孵育10min 

5)用上述两种培养基分别将细胞吹匀重悬，移入培养瓶培养 

6)隔日换液 

2.2制备HPMC和脂肪干细胞的凝胶混合物 

1)将HPMC粉末分别置于六孔板各孔中 

2)用上述两种不同培养液培养的第6代细胞，按5×10⁶/ml浓度与HPMC搅拌混 合制成凝胶悬液，混匀后移入37℃孵箱中培养 

3)另设对照孔一个，用不含细胞的细胞因子分化培养基混合HPMC，亦置入37℃孵箱中 

4)培养24h后备用 

2.3凝胶-细胞混合物的移植 

自第四军医大学动物实验中心购买BALB/C裸鼠8只(4-6w，雌雄不限)，将制备好的如下各组凝胶混合物分别注入裸鼠背部皮下组织中，每组混合物在背部中线两侧对称部位各注射两点，常规饲养观察。具体实验分组如下：①细胞因子分化培养基培养ADSCs与HPMC凝胶混合物；②DMEM基础培养液培养ADSCs与HPMC凝胶混合物；③细胞因子分化培养基与HPMC凝胶对照组。于移植后7w处死裸鼠取材，一半标本用中性甲醛固定，石蜡包埋切片，行组织学和免疫组织化学观察。另一半标本置液氮保存备用。 

2.4组织学及免疫组织化学检测 

石蜡切片分别进行HE染色和免疫组织化学检测，观察两种培养液培养的人ADSCs在裸鼠体内分化情况。 

免疫组织化学所用抗体：鼠抗人CD3、CD20、CD45ro、CD79a单克隆抗体(DAKOA/S，Glostrup，Denmark)。具体步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水，30ml/L H₂O₂，37℃ 10min，羊血清封闭30min，SP法按1∶50浓度稀释抗体(一抗)湿盒中4℃过夜。37℃复温30min，加生物素标记二抗，37℃ 30min，DAB显色，苏木精复染，流水冲洗，梯度酒精及II甲苯脱水，中性树胶封片，光镜下观察。以人淋巴结和脾石蜡切片组织作阳性对照，由于对照组裸鼠体内不易找到淋巴结因此用裸鼠自身脾石蜡切片组织作内对照，PBS代替一抗作为阴性对照。 

免疫组化结果判定：结果按染色范围和强度进行评分。染色强度评分为0～3分：其中0分为阴性，1分为弱阳性，2分为中等强度，3分为强阳性。染色阳性细胞范围评分为0～4分：0为阴性，1分为1-25％，2分为26-50％，3分为51-75％，4分为76-100％。综合两者结果评判最终结果：0为≤2；1为3分；2为4-5分，3为6-7。 

2.5统计学分析 

实验数据采用单因素方差分析和Student t检验进行组间比较，以SPSS统计软件分析结果，P＜0.05具有统计学意义。 

3实验结果 

3.1 ADSCs体内移植后组织学及免疫组织化学结果观察 

取材见裸鼠背部注射部位局部组织轻度慢性充血，与周围组织分界较清，注 射bFGF等细胞因子培养的ADSCs处皮下组织中可见10处有淋巴结样组织形成，小约2-3mm(图3)；不加细胞因子的普通培养液培养的ADSCs仅有3处淋巴结形成，而注射细胞因子分化培养基与HPMC凝胶对照组处未见淋巴结形成。淋巴结发现数量细胞因子分化培养ADSCs与HPMC凝胶组与其他两组间两两比较差异有统计学意义(p值＝0.004，P＜0.05)，而其他两组间相比亦有统计学差异(P＜0.05＝(表3-1)。 

表2 成人ADSCs裸鼠体内移植形成淋巴结情况 

组1-细胞因子分化培养液培养的ADSCs与HPMC凝胶混合物 

组2-DMEM基础培养液培养ADSCs与HPMC凝胶混合物 

组3-细胞因子分化培养基与HPMC凝胶对照组 

*P＜0.05 

3.1.1石蜡切片HE染色结果 

在裸鼠皮下组织与肌肉组织间有成熟的淋巴结形成，淋巴结有皮质和髓质，并有淋巴滤泡生发中心形成，淋巴结周围有成熟和不成熟棕色脂肪组织包绕，淋巴结内可见各期淋巴细胞(图4)。 

3.1.2石蜡切片免疫组织化学染色结果 

免疫组化结果显示，裸鼠体内形成的淋巴结组织中淋巴细胞CD3和CD45ro阳性表达(3分)，CD20和CD79a部分弱阳性表达(1分)，阳性表达的棕黄色颗粒定位于胞浆和细胞膜，淋巴结髓质区和皮质区均有阳性表达细胞，但主要分布于髓质区。人淋巴结及脾组织CD3、CD20、CD45ro和CD79a均强阳性表达(3分)，而裸鼠自身脾组织各抗体免疫组化均未表达，呈阴性反应(0分)(图5)。 

实验三、不同粘度系数、不同浓度的HPMC凝胶以及不同浓度TGF-β对脂肪干细胞分化为淋巴细胞的影响 

我们对不同浓度HPMC凝胶的物理性状进行了进一步研究。 

从图6-8可以看出，浓度10％HPMC在扫描电镜下呈蜂窝状，没有明显的三维空隙结构形成；13％HPMC显示出清楚的三维筛孔样结构，孔隙率适宜于细胞粘附，并有利于其进行营养成分的交换及增殖和分化；15％HPMC主要形成板层样结构，缺乏良好的三维空隙结构。故与10％和15％浓度的HPMC相比较，13％ 的HPMC凝胶更适合于充当构建淋巴结组织的工程支架材料。 

研究发现，不同粘度系数、不同浓度的HPMC凝胶其作为组织工程支架材料的性能不同，最终形成淋巴结组织的数量和比例也不同。经过筛选我们发现粘度系数为50mpa·s，浓度为13％的HPMC凝胶是作为支架材料的最佳条件。当细胞因子TGF-β1的浓度自原来的10μg/L提高至15μg/L时可明显促进脂肪干细胞向淋巴细胞分化，而非向其他组织细胞分化。而其他粘度系数的HPMC有的不能形成凝胶，或形成的凝胶其空间三维结构孔隙率较差，不适合干细胞的贴附、生长和分化。 

将含15μg/L TGF-β1的DMEM溶液预先与粘度系数为50mpa·s的HPMC干粉配制成13％的HPMC凝胶，然后再将体外诱导的脂肪干细胞与凝胶混合，孵箱中培养24小时后再注射入动物体内，其构建的淋巴结组织数量较高，而且形成的淋巴结接近成熟淋巴结组织。总之，粘度系数为50mpa·s、浓度为13％的HPMC凝胶与细胞因子TGF-β1浓度为15μg/L时是HPMC支架材料与脂肪干细胞构建淋巴结组织的最佳点。 

表3.不同浓度HPMC和细胞因子浓度构建淋巴结组织 

Mixture1：粘度系数50mpa·s浓度为13％HPMC，TGF-β1浓度为15μg/L 

Mixture2：粘度系数50mpa·s浓度为13％HPMC，TGF-β1浓度为10μg/L 

Mixture3：粘度系数50mpa·s浓度为13％HPMC，TGF-β1浓度为20μg/L 

Mixture4：粘度系数50mpa·s浓度为10％HPMC，TGF-β1浓度为10μg/L 

Mixture5：粘度系数50mpa·s浓度为10％HPMC，TGF-β1浓度为15μg/L 

Mixture6：粘度系数50mpa·s浓度为10％HPMC，TGF-β1浓度为20μg/L 

Mixture7：粘度系数50mpa·s浓度为15％HPMC，TGF-β1浓度为10μg/L 

Mixture8：粘度系数50mpa·s浓度为15％HPMC，TGF-β1浓度为15μg/L 

Mixture9：粘度系数50mpa·s浓度为15％HPMC，TGF-β1浓度为20μg/L 

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Claims (4)

1.HPMC在促使脂肪干细胞分化为淋巴细胞中的应用。

2.一种HPMC和脂肪干细胞的凝胶混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)原代脂肪干细胞培养24h后，吸除培养基，PBS冲洗2次，除去未贴壁的细胞及细胞碎片，在培养瓶中加入细胞因子分化培养基继续传代培养，每2-3天更换培养液一次，细胞因子分化培养基制备方法如下：在DMEM培养基的基础上加入FBS、TGF-β1、bFGF、地塞米松，使得培养基中FBS、TGF-β1、bFGF、地塞米松终浓度分别为10％、10-20μg/L、25μg/L、10^-7mol/L；

(2)培养瓶中细胞贴壁率达85％时消化传代：PBS冲洗1-2次后，用0.05％胰酶37℃孵育10min，用上述细胞因子分化培养基将细胞吹匀重悬，移入培养瓶培养，隔日换液；

(3)重复上述传代步骤，将上述传代培养第6代的细胞，按5×10⁶/ml浓度与HPMC搅拌混合制成凝胶悬液，混匀后移入37℃孵箱中培养24h即得到凝胶细胞混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：TGF-β1终浓度为15μg/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：凝胶悬液中HPMC粘度系数为50mpa·s、浓度为13％。

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