CN102703346B - 一株产蓝色素菌株及色素提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的菌株是从海滨盐土中分离纯化获得一株产天然蓝色素的细菌NJYS-02，通过形态学、生理生化实验和16SrRNA分子鉴定，为假单胞菌（Pseudomonadaceae.sp），菌株于2012年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6071。将菌株按2%接种量接种到以20%的马铃薯汁添加1.5%的葡萄糖的培养基中，pH6.0时，28℃静置培养3天后，发酵液4000rpm离心15分钟后弃上清，菌体用超声波破碎细胞，乙醇提取后，旋转蒸发浓缩后得到纯化的蓝色素，小鼠灌胃急性毒性试验证明该菌株所产蓝色素为实际无毒类。本发明可解决天然蓝色素来源狭窄，产量低的问题，而且生产工艺简单，可大规模工业发酵，所得蓝色素可用于医疗、食品、化妆品和纺织等领域。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一株分离自盐城大丰市金海农场的假单胞菌NJYS-02（Pseudomonadaceae sp.NJYS-02）及该菌株发酵和提取蓝色素的方法。
背景技术
色素是指能够使被媒染物着色的物质，也称为着色剂，可用于改善物品和食品色泽的物质，被广泛的应用在纺织、建筑、食品、生物、医药卫生、化妆品、日用工业品、饲料等行业领域，
色素通常分为合成色素和天然色素两大类。随着社会的发展，人们对生活质量要求的不断提高，色素安全问题也日益受到重视。由于化学合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、性质稳定和价格低廉，被广泛应用。但化学合成色素，很多是从煤焦油中提取或以苯、甲苯、萘、苯胺等芳烃类化合物为原料进行合成，都有程度不同的毒性，特别是偶氮型色素，有可能在体内通过代谢成为致癌物质，还有一些色素合成的过程中，可能被一些重金属及其他有害物质污染。因此，近年来合成色素的安全性问题被世界各国关注。与之相比，天然色素安全性高，还有一定的营养价值、药理作用，在世界范围内受到积极开发。
由于蓝色是三原色之一，它可用于多种色调的调配。但由于红、黄品系的天然色素来源较多，而蓝色素稀少，使得天然蓝色素在国内外市场上均供不应求，因此研究开发天然蓝色素在色素相关领域中具有极大的现实意义和诱人的市场前景。
天然蓝色素的自然来源也非常有限，无机天然蓝色素主要来源于自然蓝矾矿，有机天然蓝色素则主要来源于植物和微生物材料。动植物材料为原料的蓝色素制取，容易受到季节、气候、产地等因素的制约，从而使得天然蓝色素的产量非常有限，因而价格昂贵，难以普及应用。而自然界中微生物产色素种类繁多，且微生物生长快、易培养、便于工业化生产，不受资源、环境、时间和空间的限制，因而具有利用动植物来源的材料生产天然色素所无法比拟的优越性，，因此利用微生物生产天然色素的技术具有广阔的应用前景。
已报告的能产蓝色素的微生物如链霉菌（Streptomyces sp.）、假单胞菌（Pseudomonadaceae sp.）、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）、杜檊氏菌（Duganella sp.）、出芽短梗霉（Aureobasidium sp.）、紫色非硫细菌等可利用培养基质在生长过程中产生各不相同的蓝色素，另有一些基因工程菌株可以产生靛蓝色素。但目前国内有报告微生物产蓝色素的菌株主要是链霉菌，培养基配方较复杂，且需用大型发酵设备。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成色素的诸多问题和天然色素供应的不足，提供一种可产蓝色素的假单胞菌NJYS-02（Pseudomonadaceae sp.NJYS-02）及该菌株发酵液和提取蓝色素的方法和应用。
本发明所涉及的菌株是自盐城大丰市金海农场的假单胞菌NJYS-02（Pseudomonadaceae sp.NJYS-02），菌株于2012年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCG No.6071。保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明还公开了如上所述的假单胞菌NJYS-02产蓝色素的方法，将假单胞菌NJYS-02（Pseudomonadaceae sp.NJYS-02）按2%接种量接种到以20%的马铃薯汁添加1.5%的葡萄糖的培养基中，pH 5.0-6.0时，28℃静置培养3天后，发酵液4000rpm离心15分钟后弃上清，菌体用超声波破碎细胞，乙醇提取后，旋转蒸发浓缩后得到纯化的蓝色素。
本发明所涉及菌株假单胞菌NJYS-02（Pseudomonadaceae sp.NJYS-02），小鼠灌胃急性毒性试验证明该菌株所产蓝色素为实际无毒类。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1.利用马铃薯和葡萄糖等原料为发酵基质发酵，产生天然蓝色素，满足市场需求；
2.通过静置培养，就可大规模发酵蓝色素，无需大型发酵设备，节省大量动力和人工费用。
3.菌株所产的天然蓝色素具有无毒、安全性高的特点，可应用于医疗、食品、化妆品、纺织等行业。
4.本发明旨在利用微生物资源采用发酵工程技术将农业资源转化为蓝色素，解决自然源蓝色素紧缺问题，生产出安全的蓝色素。
附图说明：
图1是本发明菌株在显微镜下1000倍观察的个体形态图。
图2是本发明菌株的菌落图
图3是本发明菌株的16S rRNAPCR产物电泳图
图4是本发明菌株与相关菌株的系统发育树图
图5是本发明菌株的产色素生长曲线图
图6是碳源对本发明菌株产色素的影响图，其中图a为碳源种类对色素产生的影响，图b是碳源浓度对色素产生的影响
图7是氮源对本发明菌株产色素的影响图
图8是温度对本发明菌株产色素的影响图
图9是pH对本发明菌株产色素的影响图
图10是溶氧对本发明菌株产色素的影响图
具体实施方式
以下对本发明进行详细的阐述。
1.材料与方法
材料
主要试剂
1.1.2主要仪器
1.1.3培养基
营养肉汤培养基：蛋白胨10克，牛肉膏3克，氯化钠5克，水1000毫升，
pH 7.2-7.4。
高氏1号培养基：可溶性淀粉20克，硝酸钾1克，磷酸氢二钾0.5克，氯化钠0.5克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.01克，水1000毫升，pH 7.2-7.4。
PDA培养基：马铃薯200克，蔗糖20克，水1000毫升，自然pH。
发酵培养基：马铃薯200克，蔗糖15克，水1000毫升，pH 5.0。
1.1.4试验动物
昆明种小白鼠（Ⅱ级）50只，动物合格证号：CXK苏2007700001，体重18～25g，由南京盛民科研动物养殖场提供。
1.2菌株的分离与筛选
样品为采自江苏盐城大丰市金海农场的盐土。称取10g样品放入装有90ml无菌的含玻璃珠的250ml三角瓶中，震荡30min，制成10-1为土壤悬液。用1mL的无菌吸头从中吸取1mL 10-1土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀，制成10-2为土壤悬液，依此类推制成10-3，10-4，10-5各种稀释度的土壤悬液。分别吸取10-4，10-5土壤悬液0.1mL涂布于营养肉汤、高氏1号和PDA培养基上，28℃培养5-7天，挑起产蓝色素的菌株进行划线纯化2-3次后，PDA斜面4℃保存。
将纯化的菌株编号，在发酵培养液中28℃静置培养3天后，测OD570值，比较产蓝色素的能力（在一定范围内，OD570值与发酵液中蓝色素含量成正比），获得产蓝色素能力最强的菌株NJYS-02。
1.3蓝色素的分离纯化
将假单胞菌NJYS-02（Pseudomonadaceae sp.NJYS-02）按2%接种量接种到以20%的马铃薯汁添加1.5%的葡萄糖的培养基中，pH 5.0-6.0时，28℃静置培养3天后，发酵液4000rpm离心15分钟后弃上清，菌体用超声波破碎细胞，乙醇提取后，旋转蒸发浓缩后得到纯化的蓝色素。
1.4菌株鉴定
1.4.1形态学观察：28℃条件下，将菌株在PDA固体培养基上培养72h后，观察菌落形态。挑起纯菌落，进行革兰氏染色，光学显微镜下观察菌体形态。
1.4.2分子鉴定：取出适量菌体溶于无菌水中，5000g离心5min，弃上清，在沉淀中加入300uL Chelex裂解液，加10uL蛋白酶K（invitrogen），56℃，1-2h，100℃煮10min，12000g离心10min，取上清做PCR。采用引物（16SFAgAgTTTgATCCTggCTCAg，16SR ggTTACCTTgTTACgACTT）进行16S rDNA的PCR扩增，PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收、测序，将所得序列与GenBank数据库中序列进行BLAST分析比对，并选取相似性较高的菌株与菌株NJYS-02用Clustal X(1.83)软件进行多重序列匹配排列（Multiple alignments）分析，用MEGA4软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树。
1.5菌株产蓝色素生长曲线的测定
斜面菌种用无菌水洗脱成菌悬液，将菌悬液分别接种于装液量为50ml/250ml的PDA液体培养基中，接种量为2%，静置28℃发酵5天，每隔1天取出三瓶培养物，测OD570。
1.6菌株产蓝色素发酵条件的优化
1.6.1碳源对蓝色素合成的影响
1.6.1.1不同碳源种类对蓝色素合成的影响
以20%的马铃薯汁为基础，分别加入2%的葡萄糖、蔗糖、玉米粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉，2%的接种量28℃连续培养3天，观察色素合成情况。
1.6.1.2不同碳源浓度对蓝色素合成的影响
分别加入0.5%，1.5%，2.5%，3%的葡萄糖到20%马铃薯汁中，2%的接种量28℃连续培养3天，观察色素合成情况。
1.6.2不同氮源对蓝色素合成的影响
以PDA培养基为基础，分别以土豆、牛肉膏、NH4CL、KNO3蛋白胨、草酸铵为氮源，2%的接种量28℃连续培养3天，观察色素合成情况。
1.6.3最适pH的确定
以PDA培养基为基础，2%的接种量，分别在pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0连续培养3天，观察色素合成情况。
1.6.4最适发酵温度的确定
以PDA培养基为基础，2%的接种量，在20℃、25℃、28℃、30℃、37℃连续培养3天，观察色素合成情况。
1.6.5最适氧浓度的选择
以PDA培养基为基础，2%的接种量，28℃对菌株分别进行厌氧培养、静置培养和摇床培养3天，观察色素合成情况。
1.7经口急性毒性预试验
取16只体重在18～25g的小鼠，随机分成4组，雌雄各半，禁食（不禁水）8h后，采用霍恩氏法将蓝色素用蒸馏水配制成0.5g/ml、0.23g/ml、0.11g/ml、0.05g/ml四个浓度溶液，分别用四个浓度的溶液灌胃给药一次，给药体积均为30ml/kg，给药后各组小鼠正常饲养，观察药后动物全身反应及死亡情况。
1.8经口急性毒性正式试验：
取50只精神状态良好的小白鼠，雌雄各半，在室温22℃±3℃，湿度30%～70%，自由摄食、饮水的饲养条件下，适应性饲养5d后，随机分成5组，每组10只，其中第Ⅰ～Ⅳ组为试验组，第Ⅴ组为空白对照组，正式给药前禁食8h，不禁水。称重各个小组小白鼠体重，记录。采用改良寇氏法，根据预试验的剂量，分别以0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml 4个不同剂量组进行灌胃，30ml/kg，分3次灌胃给予受试物，间隔8h。空白对照组分3次灌服相同体积的生理盐水，间隔8h。给药后正常饲养，连续观察14d。每天观察小白鼠的进食、活动、大小便、精神等全身反应状况及死亡情况，并及时记录。第14天时称重各组小白鼠体重后，剖检存活小白鼠，观察主要脏器是否有病变。
2.结果与分析
2.1形态学观察
菌株为革兰氏阴性（图1），好氧，短杆状，无鞭毛、芽孢和荚膜。在PDA固体培养基上，菌落形态为蓝色，圆形凸起，有光泽，不透明，直径1-2mm（图2）；在PDA液体发酵培养基中呈深蓝色，无菌膜，澄清无沉淀，色素无挂壁现象。在营养琼脂培养基、高氏培养基和虎红培养基上不生长。
2.2 16S rRNA序列分析
通过16S rDNA克隆测序，得到了1400bp左右的碱基序列（图3）。将所得的1430bp DNA序列与NCBI数据库Blast比对，与其同源性较高的菌株均属于假单胞菌（Pseudomonadaceae），选取相关菌株进行系统发育分析，用MEGA4软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树（图4），可知菌株为假单胞菌（Pseudomonadaceae sp.）。
2.3产蓝色素菌株色素合成的生长曲线
将9ml无菌水倒入菌种斜面中，用接种环将菌苔刮下，混匀。按2％的接种量分别接种于装液量为50mL/250mL的PDA液体培养基中，28℃下培养，每隔1天取出三瓶测OD570。
以时间为横坐标，以OD570为纵坐标，画生长曲线，结果如图5。菌株在第1天内色素合成不是太好，分析原因此刻菌株生长可能处于延滞期和对数期，次生代谢产物色素还没有合成。在1天往后，色素合成速度加快快，此刻菌体生长处于稳定期。但是到了3天后，色素产量增加不是很明显，可能是此时培养基中各种养分基本消耗怠尽，菌株的生长受到限制。同时菌株在发酵过程中产生和积累的一些次生代谢产物也可能抑制了菌体的生长，因此，此阶段应该处于稳定期向衰亡期发展。所以，以获得最大色素量，节约生产成本考虑，在后面的发酵条件优化实验中，我们采用了3天作为培养时间。
2.4菌株产蓝色素发酵条件的优化
2.4.1最适碳源的选择
2.4.1.1最佳碳源种类的选择
在20%的马铃薯汁中，分别加入2%的葡萄糖、蔗糖、玉米粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉，2%的接种量28℃连续培养3天，测量OD570,结果见图6-a，菌株在葡萄糖马铃薯培养基时，蓝色素产量最高。当碳源变为玉米粉马铃薯培养基时，产量最低。碳源为马铃薯或水解淀粉时，蓝色素产量无显著变化。在不同碳源条件下，菌株产蓝色素从高到低依次是葡萄糖＞蔗糖＞马铃薯、淀粉＞玉米粉。分析原因，可能是葡萄糖和蔗糖都属于速效性碳源，适合菌体的大量生成，而20%的马铃薯汁可用于次生代谢产物蓝色素的合成。而玉米粉、马铃薯或淀粉都属于缓释型碳源，不适合菌体的生长，因此在加入玉米粉、马铃薯或淀粉的20%培养基中，由于没有大量菌体生成，也无法大量产生菌体的次生代谢产物——蓝色素。因此，选择20%的马铃薯汁加葡萄糖作为产蓝色素的碳源。
2.4.1.2最佳碳源浓度的选择
在20%的马铃薯汁中，分别加入0.5%，1.5%，2.5%，3%的葡萄糖，2%的接种量28℃连续培养3天，测量OD570,结果见图6-b，当葡萄糖浓度为1.5%时，菌株产蓝色素量最高，当葡萄糖浓度为0.5%和2.5%时，产量次之，当葡萄糖浓度为3%时，蓝色素产量较葡萄糖浓度为1.5%有显著性差异。分析原因，是由于葡萄糖是一种速效性碳源，适合菌体的大量增殖，但过高浓度会产生葡萄糖抑制效应，所以当发酵液中葡萄糖浓度为3%，由于渗透压过高，菌体生长受到限制，无法大量合成蓝色素这类次生代谢产物。但当葡萄糖浓度为0.5%的时候，由于营养不够，菌株无法达到最大生长速率，蓝色素处理也不高。因此选择1.5%的葡萄糖浓度，作为最适速效碳源浓度。
2.4.2最适氮源的选择
以PDA培养基为基础，分别以土豆、牛肉膏、NH4Cl、KNO3蛋白胨、草酸铵为氮源，2%的接种量28℃连续培养3天，测量OD570,结果见图7，不同氮源中菌株产蓝色素能力依次为土豆＞牛肉膏＞蛋白胨、草酸铵＞NH4Cl＞KNO3。且以土豆为氮源时，菌株产蓝色素的能力极显著于以牛肉膏、NH4Cl、KNO3、蛋白胨、草酸铵等为氮源，故选择土豆作为菌株产蓝色的最佳氮源种类。
2.4.3最适温度的选择
以PDA培养基为基础，2%的接种量，在20℃、25℃、28℃、30℃、37℃和连续培养3天，测量OD570,结果见图8，菌株在30℃时产蓝色素能力最高，其次是28℃和25℃，但在25℃、28℃、30℃之间菌株产蓝色素的能力无统计学上的差异。菌株在20℃时产蓝色素能力最差，其次是37℃时，但两者之间也无显著性差异。因此，选择常用的28℃为发酵条件。
2.4.4最适pH的选择
以PDA培养基为基础，2%的接种量，分别在pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0连续培养3天，测量OD570,结果见图9，当pH值为5.0时，菌株产蓝色素能力最高，但pH为6.0时，菌株产蓝色素能力与pH5.0时无显著性差异，pH为7.0和8.0时，菌株色素产量有显著性下降，但当pH为4.0时，菌株产色素能力有极显著下降，故选择pH 5.0-6.0（接近培养基自然pH）作为最适发酵pH。
2.4.5最适氧浓度的选择
以PDA培养基为基础，2%的接种量，28℃对菌株分别进行厌氧培养、静置培养和摇床培养3天，测量OD570,结果见图10，静置培养时，菌株色素产量最高，厌氧培养时，菌株不能生长，故无色素产生，而摇床培养时候菌株能产生蓝色素，但色素产量较低，由此可见该细菌微好氧，故选择静置培养。
2.5毒理学预试验结果：
在灌服不同浓度的蓝色素后，预试验结果见表1。
表1 蓝色素一次性灌胃小鼠试验结果
由表1可知，一次性灌胃蓝色素小鼠的LD50剂量超过15.00g/kg，死亡率为0的剂量也达到6.90g/kg。动物死亡过程表现为：抽搐、呼吸困难，最后死亡，均在给药后24h内死亡。
2.6经口急性毒性正式试验结果
在灌服不同浓度的蓝色素后小白鼠死亡情况见表2，灌胃前后各组小白鼠体重变化见表3。
表2 蓝色素灌胃急性毒性试验结果
由表2可知在灌服不同浓度的蓝色素后各组小鼠外观特征基本正常，未见毛色差、精神萎靡、毛松等异常表现，也未见耳、眼、口、鼻有异样分泌物，呼吸道反应正常，未见咳嗽、哮喘现象，四肢活动和走动正常，试验组与对照组各小鼠状态无明显差异，各组小白鼠未见死亡。整个试验过程中未见小白鼠出现明显的中毒症状。表3灌胃蓝色素前后小白鼠体重变化情况
注：与对照组比较，*P>0.05。
由表3可知各组小白鼠平均体重呈增长趋势，实验组与对照组相比差异不显著（P>0.05）。
Claims (2)
1.一株产蓝色素菌株，其特征是假单胞菌（Pseudomonadaceae sp. ）NJYS-02，保藏号为CGMCG No.6071。
2.根据权利要求1所述的产蓝色素菌株制备蓝色素的方法，其特征是将NJYS-02种子液以2%接种量接种到以20%的马铃薯汁添加1.5%的葡萄糖的培养基中，pH 5.0-6.0，28℃静置培养3天后，发酵液4000rpm离心15分钟后弃上清，菌体用超声波破碎细胞，乙醇提取后，旋转蒸发浓缩后得到纯化的蓝色素。
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