CN102698667B - 核壳结构球形致孔剂及其用于制备三维细胞支架 - Google Patents

Abstract

一种核壳结构球形致孔剂及其用于制备三维细胞支架的方法，所述的致孔剂其核为具有较高的强度的碳酸钙/海藻酸钙复合物，壳为具有弹性的海藻酸钙水凝胶，该致孔剂是通过第一步在砂磨机中配制碳酸钙/海藻酸钠悬浮液；第二步制备致孔剂微球的核，其粒径在200-1000μm；第三步将第二步制得的微球过滤，沸腾干燥、筛分微粒，得到需要粒径的微粒；第四步过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。用所述的核壳结构球形致孔剂可以制备出孔隙间相互连通、孔隙直径大小和连通通道直径可以人为控制的三维细胞支架，且操作简便快速，适宜于工业化生产。

Description

核壳结构球形致孔剂及其用于制备三维细胞支架

技术领域：

本发明属于生物材料领域，特别涉及一种核壳结构球形致孔剂及其用于制备三维细胞支架。

背景技术：

三维细胞支架为种子细胞提供生长模板，引导组织再生，控制组织或器官的形状，它在组织工程学起着关键性的作用。组织工程所用的细胞支架需要具有适宜的孔隙形状、结构、大小、孔隙率和良好的孔隙连通性。以聚乙烯醇弹性微球为致孔剂的压滤成型/粒子沥滤法（Qi Q Q, Chen J D , Gao S Z, et al. Preparation cell scaffolds with well defined pore structure through elastic porogen/pressure filtration [J]. Advanced materials research, 2011, 236-238:1897-1901），通过调节致孔剂大小、压缩比例实现了控制支架内部孔隙的大小、孔隙间通道尺寸，但是，聚乙烯醇微球在微波加热过程中不能完全除尽；制备出的聚乙烯醇微球强度低，在压滤成型过程中，微球变形性随空间位置变化，当支架体积较大时，支架孔隙结构的均匀性较差、重现性不高，孔隙参数不能由实验条件调节与控制，不利于工业化生产。

发明内容：

本发明的目的是为了解决压滤成型/粒子沥滤法制备支架中致孔剂的不足，提供一种外层具有一定弹性、内层强度较高的微球，即核壳结构的致孔剂，并利用该致孔剂与压滤成型粒子/沥滤技术结合制备孔隙结构参数可控的三维多孔细胞支架。

本发明所涉及的核壳结构球形致孔剂是通过下述方法获得：其具体步骤如下： 

第一步 在砂磨机中配制碳酸钙/海藻酸钠悬浮液；

第二步 将第一步制得的悬浮液吸入注射器中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h，针头内径为0.55mm，将液滴滴入固化液氯化钙浓度为20%，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核，其粒径在200-1000μm；

第三步 将第二步制得的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于自制的沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水，筛分微粒，得到需要粒径的微粒；

第四步 称取第三步得到需要粒径的微粒，置于盛有EDTA溶液的烧杯中，反应至设定时间后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。

本发明的另一方面是将致孔剂微球用于制备三维细胞支架，其具体步骤为： 

第一步 配制PDLLA支架溶液；

第二步 将支架制备溶液、模具、致孔剂等置于三氯甲烷/二氧六环(V/V=5:2)蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按1:1(V/V)混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压；

第三步 将致孔剂/支架溶液复合物连同磨具迅速置于-45 ℃低温环境，冷冻、固化定型18h及以上；

第四步 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h；

第五步 将复合物浸入蒸馏水中30min；

第六步 将步骤⑤中的复合物取出用刀切去上下面，浸泡在用2mol/L 的EDTA溶液(pH=10)溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次；

第七步 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。

本发明所涉及的具有核壳结构的致孔剂克服了压滤成型/粒子沥滤法制备支架中致孔剂的缺点，致孔剂的外层海藻酸钙凝胶具有一定弹性、内层碳酸钙/海藻酸钙强度较高的微球，采用该种致孔剂制备的多孔支架的孔隙参数可以方便地由实验条件调节与控制，且制备工艺适合于工业化生产。 

附图说明：

图1是粒径为200-1000微米的核壳球形微球致孔剂的形貌显微镜照片；

图2是致孔剂与支架材料复合物的外观照片；

图3是三维细胞支架的外观；

图4是点光源透过多孔支架；

图5是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片（28倍）；

图6是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片（100倍）；

图7是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片（301倍）。

具体实施案例：

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明如下:

实施例1.

① 配制CaCO₃含量为2%、海藻酸钠浓度为3%的悬浮液称取研磨后的碳酸钙粉末(粒度为约10μm) 2g置于马克杯中，加入95mL蒸馏水，用砂磨机在转速为500r/min下砂磨1h；加入3g海藻酸钠，调整转速为100r/min，研磨30min后逐渐调高转速至500r/min，砂磨时间4h，形成白色粘稠悬浮液，停止砂磨，密封、静止脱泡，备用。

② 将步骤①中的悬浮液装入吸入注射器5ml的注射中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h；针头内径为0.55mm；将液滴滴入固化液(氯化钙浓度为20%)，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核。 

③ 将步骤②中的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水。筛分微粒，得到425-600微米。 

④ 称取0.2g空气干燥的致孔剂，置于盛有20mL、0.01g/mL 的EDTA溶液，反应至设定时间至5min后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。 

⑤ 将支架制备溶液、模具、致孔剂等置于三氯甲烷/二氧六环(V/V=5:2)蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按1:1(V/V)混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压，压滤比例为30%。 

⑥ 将致孔剂/支架溶液复合物连同磨具迅速置于-45 ℃环境，冷冻、固化定型18h。 

⑦ 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h。 

⑧ 将复合物浸入蒸馏水中30min。 

⑨ 将复合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10-11的EDTA溶液溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次。 

 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。 

实施例2 

① 配制CaCO₃含量为2%、海藻酸钠浓度为3%的悬浮液称取研磨后的碳酸钙粉末(粒度为约10μm) 2g置于马克杯中，加入95mL蒸馏水，用砂磨机在转速为500r/min下砂磨1h；加入3g海藻酸钠，调整转速为100r/min，研磨30min后逐渐调高转速至500r/min，砂磨时间4h，形成白色粘稠悬浮液，停止砂磨，密封、静止脱泡，备用。

② 将步骤①中的悬浮液装入吸入注射器5ml的注射中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h；针头内径为0.55mm；将液滴滴入固化液(氯化钙浓度为20%)，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核。 

③ 将步骤②中的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水。筛分微粒，得到425-600微米。 

④ 称取0.2g空气干燥的致孔剂，置于盛有20mL、0.01g/mL的EDTA溶液，反应至设定时间至15min后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。 

⑤ 将支架制备溶液、模具、致孔剂等置于三氯甲烷/二氧六环(V/V=5:2)蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按1:1(V/V)混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压，压滤比例为30%。 

⑥ 将致孔剂/支架溶液复合物连同磨具迅速置于-45 ℃环境，冷冻、固化定型18h。 

⑦ 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h。 

⑧ 将复合物浸入蒸馏水中30min。 

⑨ 将复合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10-11的EDTA溶液溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次。 

 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。 

实施案例3 

① 配制CaCO₃含量为2%、海藻酸钠浓度为3%的悬浮液。称取研磨后的碳酸钙粉末(粒度为约10μm) 2g置于马克杯中，加入95mL蒸馏水，用砂磨机在转速为500r/min下砂磨1h；加入3g海藻酸钠，调整转速为100r/min，研磨30min后逐渐调高转速至500r/min，砂磨时间4h，形成白色粘稠悬浮液，停止砂磨，密封、静止脱泡，备用。

② 将步骤①中的悬浮液装入吸入注射器5ml的注射中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h；将液滴滴入固化液(氯化钙浓度为20%)，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核。 

③ 将步骤②中的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水。筛分得到300-425微米的致孔剂核。 

④ 称取0.2g空气干燥的致孔剂，置于盛有20mL、0.01g/mL 的EDTA溶液，反应至设定时间至15min后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。 

⑤ 将支架溶液、模具、致孔剂等置于三氯甲烷/二氧六环(V/V=5:2)蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按1:1(V/V)混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压，压滤比例为20%。 

⑥ 将致孔剂/支架溶液复合物连同磨具迅速置于-45 ℃环境，冷冻、固化定型18h。 

⑦ 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h。 

⑧ 将复合物浸入蒸馏水中30min。 

⑨ 将复合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10-11的EDTA溶液溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次。 

 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。 

实施案例4 

① 配制CaCO₃含量为2%、海藻酸钠浓度为3%的悬浮液称取研磨后的碳酸钙粉末(粒度为约10μm) 2g置于马克杯中，加入95mL蒸馏水，用砂磨机在转速为500r/min下砂磨1h；加入3g海藻酸钠，调整转速为100r/min，研磨30min后逐渐调高转速至500r/min，砂磨时间4h，形成白色粘稠悬浮液，停止砂磨，密封、静止脱泡，备用。

② 将步骤①中的悬浮液装入吸入注射器5ml的注射中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h；针头内径为0.55mm；将液滴滴入固化液(氯化钙浓度为20%)，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核。 

③ 将步骤②中的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水。筛分得到425-600微米的致孔剂核。 

④ 称取0.2g空气干燥的致孔剂，置于盛有20mL、0.01g/mL 的EDTA溶液，反应至设定时间至15min后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。 

⑤ 将支架溶液、模具、致孔剂等置于三氯甲烷/二氧六环(V/V=5:2)蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按1:1(V/V)混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压，压滤比例为20%。 

⑥ 将致孔剂/支架溶液复合物连同磨具迅速置于-45 ℃环境，冷冻、固化定型18h。 

⑦ 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h。 

⑧ 将复合物浸入蒸馏水中30min。 

⑨ 将复合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10-11的EDTA溶液溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次。 

 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。 

图2是致孔剂与支架材料复合物的外观照片，显示出致孔剂均匀的填充在支架的材料中。 

图3是三维细胞支架的外观。通过核壳致孔剂-压滤成型/粒子沥析技术制备的三维支架外观较为均匀，白皙，质地和孔隙分布均匀、结构完整。 

图4是点光源透过多孔支架。从图中可以看出有均匀的光线透过支架，证实了支架中孔隙分布均匀、孔隙间连通性好。 

图5、图6、图7是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片。由图5可见，支架孔隙分布均匀、形态规则，表明核壳致孔剂-压滤成型/粒子沥滤技术可以制备出孔隙结构均匀的多孔细胞支架。由图6图7可以清楚地看出，支架中存在均匀分布的球形大孔以及在大孔壁上的圆形通道，大孔是由除去核壳球形微球致孔剂后形成的球形孔隙，大孔壁上的圆形通道为在压滤成型时核壳球形致孔剂相互之间挤压而形成的接触面，致孔剂除去后转化为了孔隙之间的连通通道。支架的孔隙形态与大小取决于致孔剂大小与形态；致孔剂之间的接触保证了支架孔隙间的相互连通性。 

实施案例1-2制备的支架，进行外观和微观结构观察，并用软件统计孔隙通道直径大小和孔间连通通道直径大小，其结果为表1。 

表1 致孔剂壳厚与孔隙参数的关系 

备注：压滤比例为30%，致孔剂粒径为425-600μm

 当致孔剂粒径和压滤比恒定不变时，当核壳致孔剂“壳”厚为70.03±9.94(100)μm时，支架孔隙直径为438.70±15.22(8)μm，孔间通道直径为129.31±20.61(14)μm；当核壳致孔剂“壳”厚为100.85±7.97(100)μm时，支架孔隙直径为575.26±224.60(19)μm，孔间通道直径为208.58±18.30(30)μm。统计分析表明：当致孔剂“壳”厚度不同时，支架中孔隙的直径之间，以及孔间通道直径之间均存在显著性差异，表明支架孔隙尺寸、孔间通道直径均与致孔剂“壳”厚度有显著的相关关系，即支架孔隙尺寸、孔间通道直径可以通过致孔剂“壳”厚度进行调节。

综上所述，当致孔剂粒径和压滤比恒定不变时，通过改变致孔剂“壳”厚度可以方便地调节三维多孔支架的孔隙尺寸、孔间通道直径。 

实施案例3-4制备的支架，进行外观和微观结构观察，并用软件统计孔隙通道直径大小和孔间连通通道直径大小，其结果为表1。

表2 不同粒径的致孔剂与孔隙参数的关系 

备注：压滤比例为20%。

从表2可以看出，在压滤比为20%的条件下，当致孔剂粒径为300-425μm时，支架孔隙的孔径为400.98±22.45(10)μm，孔间通道直径为127.48±17.34(17)μm；当致孔剂粒径为425-600μm时，支架孔隙的孔径为558.81±27.25(17)μm，孔间通道直径为190.86±22.28(25)μm。经统计分析发现，支架孔隙尺寸之间存在显著的差异，表明支架的孔隙直径与致孔剂之间有显著的相关关系，即支架的孔隙是由致孔剂形成的，且支架的孔隙尺寸可以由致孔剂大小调节。另一方面，孔隙间通道的直径存在显著的差异，表明孔间通道与致孔剂直径有显著的相关关系，即通道的直径取也可以由致孔剂控制。 

综上所述，致孔剂粒径决定了支架的孔隙尺寸、孔间通道的直径，即可以通过改变致孔剂的直径人为地调节孔隙大小、孔隙间的通道直径。 

Claims (2)

1.一种核壳结构球形致孔剂，其特征是：所述的致孔剂其核为具有较高的强度的碳酸钙/海藻酸钙复合物，壳为具有弹性的海藻酸钙水凝胶，该致孔剂是通过下述方法获得，该方法具体步骤如下：

第一步 在砂磨机中配制碳酸钙/海藻酸钠悬浮液；

第二步 将第一步制得的悬浮液吸入注射器中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h，针头内径为0.55mm，将液滴滴入固化液氯化钙浓度为20%，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核，其粒径在200-1000μm；

第三步 将第二步制得的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于自制的沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水，筛分微粒，得到需要粒径的微粒；

第四步 称取第三步得到需要粒径的微粒，置于盛有0.01g/mL EDTA溶液的烧杯中，反应5min或15min后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。

2.如权利要求1所述的核壳结构球形致孔剂用于制备三维细胞支架的方法，其特征是具体步骤为：

第一步 配制PDLLA支架溶液；

第二步 将支架制备溶液、模具、致孔剂置于三氯甲烷/二氧六环的体积比为5:2的蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按体积比为1:1混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压；

第三步 将致孔剂/支架溶液复合物连同模具迅速置于-45 ℃低温环境，冷冻、固化定型18h以上；

第四步 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h；

第五步 将复合物浸入蒸馏水中30min；

第六步 将第五步中的复合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L的PH=10 的EDTA溶液溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次；

第七步 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。

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