CN106668941A - 一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法 - Google Patents
一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法，属于生物复合材料制备技术领域，可用作骨修复三维支架材料使用，具有良好的生物活性、机械性能和降解特性，有利于提高骨修复的效果。所述制备方法包括：将短肽分子溶于水中，使其组装；将组装好的短肽溶液、硅前驱体、粘合剂混合，使它们反应形成短肽/二氧化硅凝胶；将凝胶用超纯水置换后利用冰凝诱导法冷冻样品，冻干后即可得到短肽/二氧化硅多孔材料；利用模拟体液浸泡材料，冻干后得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料。本发明用于制备有机‑无机多孔复合材料，具有易于调控的多级孔结构，可作为人工骨材料的三维支架应用在骨修复领域。
Description
技术领域
本发明属于生物复合材料制备技术领域，具体涉及一种用于修复骨损伤的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法。
背景技术
我国是一个拥有13亿以上人口的大国，每年由于交通、体育运动事故造成的骨损伤患者每年达到百万人以上，且随着人口老龄化引起的骨质疏松、骨组织坏死等疾病日益增多。尽管骨组织具有一定的自我修复能力，但自我修复只能在缺损较小的情况下进行，目前的主要治疗方法是通过在病变区植入骨修复材料，促进骨组织的再生和修复。因此，骨修复材料是目前需求量最大的生物医用材料之一。
根据来源不同，骨修复材料主要包括自体骨、同种异体骨和异种骨、人工合成骨材料等。自体骨是最为最理想的骨修复材料，但是因其取材有限且会对患者造成二次损伤而大大影响了其应用；同种异体骨和异种骨容易引发免疫排斥反应，而且有传播疾病的风险；因此，研究和开发能够修复骨损伤并重建其功能的人工骨材料受到了广泛重视，也取得了显著的进展，但与理想的人工骨材料相比仍存在一些不足。比如：人工骨材料的力学性能与原骨组织不匹配，可能会导致植入材料与植入环境以及新生骨不能很好地结合；在材料的孔隙率、孔隙联通、孔径大小调控方面仍然存在困难，影响成骨细胞的生长增殖以及骨组织的形成等。
机械性能、孔特性以及生物功能性是人工骨材料设计时需要重点考虑的三个方面。我们知道天然骨材料主要由胶原纤维羟基磷灰石组成，但通过人工仿生 制备很难获得如此复杂而精致的结构以及相应的机械性能，因此在有机生物分子和羟基磷灰石之外复合其它组分成为强化人工骨材料的重要手段。理想的骨修复材料应具有多级孔结构和较高的孔隙率，研究表明，材料的多级孔结构有利于控制细胞行为，大孔结构则有利于成骨细胞的分化、神经化和血管化，另外多级微孔结构则有利于营养物质和代谢产物的输送(Moutos FT等，《自然材料》2007,6,162-167)。因此在保持其机械强度和生物活性的前提下改善材料孔隙率、孔径、孔形貌、孔分布成为改善其骨修复功能的重要途径之一。目前主要制备方法包括颗粒堆积烧结法、添加造孔剂法、发泡法、溶胶-凝胶法、相分离法、3D打印法和电化学法等。但是这些方法或者需要有机溶剂的加入，或者需要高温高压等苛刻的条件，并且所制备的多孔材料孔结构分布不均匀，孔尺寸控制也比较困难，使得所制备材料在临床应用上受到较大的限制。近些年来，冰凝诱导法逐渐被人们所认识(Yanina Minaberry等，《化学材料》2011,23，2327-2332)，该方法无毒无害，且对于孔特性的调控具有独特的优势，在骨修复领域具有显著的应用价值。将仿生矿化与冰凝诱导相结合，在提高其机械强度和保持生物活性的基础上，大大提高了对材料孔结构的控制性，通过组成和工艺的变化可以很容易地调控材料的机械性能和降解特性，作为支架材料在骨修复领域展示了良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法，可用作骨修复三维支架材料使用，具有良好的生物活性、机械性能、降解特性和易于调控的多级孔结构，有利于提高骨修复的效果。
本发明提供了一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将短肽分子溶于水中，超声分散，调节至指定pH值，在一定温度下放置使其组装，得到含有短肽自组装体的溶液，即短肽溶液；
将短肽溶液、硅前驱体、粘合剂混合，使硅前驱体水解并在短肽组装体表面形成二氧化硅沉积层，继续反应形成短肽/二氧化硅凝胶；
将短肽/二氧化硅凝胶用超纯水置换，然后利用冰凝诱导法，在不同的冷冻域中冷冻样品，冷冻干燥后即可得到短肽/二氧化硅多孔材料；
利用模拟体液浸泡材料，在短肽/二氧化硅多孔材料表面沉积羟基磷灰石层，一定时间后冷冻干燥得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料；
可选的，短肽为两亲性阳离子短肽，疏水部分由3-10个甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸组成，亲水部分由1-3个赖氨酸、精氨酸或组氨酸构成，疏水部分和亲水部分通过肽键连接；
优选的，将短肽溶解于水后，调节至pH 3-9，使其在温度15-50℃的水溶液中放置，最终能够自组装成纳米纤维；
可选的，硅前驱体为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯，粘合剂为聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠中的一种，浓度分别为短肽1-10mM、硅前驱体50-500mM、粘合剂1-3wt％；
优选的，将形成的凝胶置于大量超纯水中进行置换，每4-12小时换一次水，目的是为了除去在二氧化硅形成过程中生成的少量乙醇或甲醇；
可选的，所述的冰凝诱导法是以凝胶在冷冻过程中形成的冰晶为模板驱动溶质组装，然后除去冰晶得到多孔材料的方法；
优选的，冰凝诱导的温度在-196-0℃之间，样品首先在冷冻源中冷冻10-60分钟，然后在-80℃冰箱中熟化10-30分钟；
优选的，将短肽/二氧化硅多孔材料在37℃的SBF模拟体液中浸泡3-6天， 每12-48小时更换一次模拟体液；
本发明的另一方面提供了如上述技术方案中任一项所述的一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料；
本发明的再一方面提供了如上述技术方案所述的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料作为三维支架材料在骨修复中的应用。
本发明将仿生矿化方法与冰凝诱导技术相结合，制备出短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料具有良好生物活性，且强度可控、孔特性可控的多级孔材料。与已有技术相比，本发明具有以下优势：1)得到的是具有纳米孔、微米孔等多级孔结构的多孔材料；2)多孔材料中孔的尺寸、孔的方向、孔的连通性易于调控，例如孔的尺寸能从几百纳米到几百微米变化；3)多孔材料的形状由冰凝诱导的模具决定，易于得到具有不同形状的多孔材料，从而满足不同部位的特殊需求；4)具有可调控的机械性能和降解特性，易于通过二氧化硅和羟基磷灰石组成和分布的变化调控其机械性能和降解性质；5)良好的生物活性，所制备多孔材料由无毒的短肽、二氧化硅、羟基磷灰石组成，表面羟基磷灰石和硅羟基的存在以及材料所具有的多级孔结构赋予其良好的生物活性，有助于骨细胞的粘附增殖，促进受损骨组织的修复；6)简单、环境友好的制备工艺，冰凝诱导是以水作为溶剂，以冰晶作为模板制备多孔材料，未引入其它杂质，并且除冰晶模板也比较方便；整个过程不需要复杂的设备，成本较低且容易实现。
附图说明
图1为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2的数码照片；
图2A为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合 材料2垂直于冰晶生长方向截面的扫描电子显微镜照片；
图2B为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2平行于冰晶生长方向截面的扫描电子显微镜照片；
图2C为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2孔壁的扫描电子显微镜照片；
图3为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2的压汞孔分布测试曲线；
图4为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2的EDS能谱；
图5为本发明实施例2所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2的细胞毒性图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。应当指出的是，所描述的仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供了一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法，包括：
S1：将短肽分子溶于水中，超声分散，调节至指定pH值，在一定温度下放置使其组装，得到含有短肽自组装体的溶液，即短肽溶液。
本步骤中，利用两亲性短肽分子间的非共价相互作用构建具有矿化活性的短肽自组装体。具体的，将称量的短肽粉末溶解于超纯水中，超声助其分散， 调节到指定pH值后静置使其组装，在下一步使用前要保证其充分组装，可以利用利用原子力显微镜或透射电子显微镜观察其组装情况。通过本步骤，可以得到阳离子分布在表面的短肽自组装体。
S2：将短肽溶液、硅前驱体、粘合剂混合，使硅前驱体水解并在短肽组装体表面形成二氧化硅沉积层，继续反应形成短肽/二氧化硅凝胶。
本步骤中，利用阳离子短肽自组装体作为模板并诱导二氧化硅在其表面沉积，并成为凝胶的三维骨架。具体的，首先把聚乙烯醇溶解到组装好的短肽溶液中并混合均匀，然后按照比例与硅前驱体混合，搅拌均匀后放置于恒温箱中放置成胶。
S3：将短肽/二氧化硅凝胶用超纯水置换，然后利用冰凝诱导法，在不同的冷冻域中冷冻样品，冷冻干燥后即可得到短肽/二氧化硅多孔材料。
本步骤中，为克服乙醇(甲醇)的存在对冰凝诱导过程以及对多孔材料生物活性的影响，需要采用纯水置换的手段除去。具体的，待混合溶液成胶后，直接在容器中加入大量的超纯水置换，待乙醇基本除尽后再进行冰凝诱导处理。
S4：利用模拟体液浸泡材料，在短肽/二氧化硅多孔材料表面沉积羟基磷灰石层，一定时间后冷冻干燥得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料
本步骤中，复合羟基磷灰石层的目的有两个：一是为了增加该多孔材料的生物活性以及骨细胞的生长增殖活性；二是通过二氧化硅层和羟基磷灰石层的比例以及分布调节其降解性质。二氧化硅层的存在一方面可以提高复合材料的机械强度，另一方面硅羟基的存在也为羟基磷灰石的形成提供了成核位点，有助于促进其沉积。具体的，将短肽/二氧化硅多孔材料直接浸泡在配置好的模拟体液中，放置于恒温水浴锅中反应一定时间，取出冻干即可。
在本发明的一实施例中，所述的短肽为两亲性阳离子短肽，疏水部分由3-10 个甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸组成，亲水部分由1-3个赖氨酸、精氨酸或组氨酸构成，疏水部分和亲水部分通过肽键连接。两亲性阳离子短肽通过分子间非共价作用在水溶液中形成组装体，亲水的赖氨酸、精氨酸或组氨酸在非碱性溶液中容易质子化而使组装体表面带有正电荷，通过亲疏水单元组成的变化可以调控其组装体形态和带电性质，以及作为模板诱导二氧化硅形成的能力。
在本发明的一实施例中，将短肽溶解于水后，调节至pH 3-9，使其在温度15-50℃的水溶液中放置，最终能够自组装成纳米纤维。短肽的组装依赖于分子间的弱相互作用，包括氢键、静电、疏水相互作用等，因此环境对于组装结果具有一定影响。例如溶液pH值决定了短肽分子的质子化程度，因此对分子间静电作用和氢键有重要影响，而温度主要影响的是氢键作用，在短肽的组装体系中，氢键是驱动短肽分子形成一维组装体的关键因素，因此在这里要加以控制。可以理解的是可将pH值调节到3、4、5、6、7、8、9不等或上述范围内的其它任何一点均可，本领域技术人员可根据实际情况调节。
在本发明的一实施例中，所采用的硅前驱体为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯，粘合剂为聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠中的一种，浓度分别为短肽1-10mM、硅前驱体50-500mM、粘合剂1-3wt％。在本实施例中由于不同的二氧化硅前驱体具有不同的水解速率，因此通过一种或者多种前驱体间的调节，可以控制矿化反应速率以及短肽组装体表面二氧化硅层的厚度。所采用的粘合剂为聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠中的一种，目的是为了调控材料的机械强度。可以理解的是，在上述范围内所配制的溶液均可制备凝胶，因此本领域技术人员可根据需要在上述范围内进行调节，例如短肽浓度为1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM或之间的任一值，硅前驱体浓度为50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM或之间的任一值，粘合剂浓度为1wt％、2wt％、3wt％ 或之间的任一值。
在本发明的一实施例中，将形成的凝胶置于大量超纯水中进行置换，每4-12小时换一次水，目的是为了除去在二氧化硅形成过程中生成的少量乙醇(甲醇)。乙醇对冰凝诱导过程以及最终材料的结构和生物相容性均有一定的影响，因此要在冰凝诱导之前将其除去。可以理解的是，在上述换水频率范围内均可以有效除去乙醇(甲醇)，本领域技术人员可根据需要在上述范围内进行调节，例如4小时、8小时、12小时或其间的任一时间。
在本发明的一实施例中，所述的冰凝诱导法是以凝胶在冷冻过程中形成的冰晶为模板驱动溶质组装，然后除去冰晶得到多孔材料的方法。水溶液在低温下结冰，结冰过程中会把溶质排挤到冰晶间并进行重新排列，经真空冷冻干燥除去冰晶后形成多孔材料。冰凝诱导方法简单易于操作，不需要复杂的设备和苛刻的条件，而且过程中没有引入任何杂质，保证了材料的纯净，这对于制备生物医用材料来说尤其重要。
在本发明的一实施例中，冰凝诱导的温度在-196-0℃之间，样品首先在冷冻源中冷冻10-60分钟，然后在-80℃冰箱中熟化10-30分钟。冰凝诱导的过程是冰晶驱动溶质组装的过程，因此冰晶形成以及生长的速率会影响孔的尺寸及孔表面形态，合适的冷冻温度产生规则的孔结构。我们通过冷冻温度、温度梯度的控制制备适宜的孔尺寸，通过冷冻方向控制孔的方向和连通性，熟化的目的是为了进一步巩固所形成的孔结构。可以理解的是，在上述冷冻温度范围内，均可以制备得到短肽/二氧化硅多孔材料，本领域技术人员可根据需要在上述范围内进行调节。冷冻时间和熟化时间本领域技术人员可以在上述范围内自行控制，只要能保证凝胶中的水全部形成冰晶即可。
在本发明的一实施例中，将短肽/二氧化硅多孔材料在37℃的SBF模拟体液 中浸泡3-6天，每12-48小时更换一次模拟体液。在本实施例中采用37℃下矿化羟基磷灰石是因为，在该条件下矿化更快速，且形成的羟基磷灰石层更均匀。根据所需的羟基磷灰石层厚度选择不同的矿化时间，可以是3、4、5、6天或或之间的任意时间，本领域技术人员可根据需要选择合适的时间。更换模拟体液的目的是为了让环境中有足够的钙离子和磷酸根离子可供使用。
本发明的另一实施例提供了一种如上述实施例中任一项所述的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料。由本发明实施例制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料具有以下特点：1)具有纳米孔、微米孔等多级孔结构的多孔材料；2)多孔材料中孔的尺寸、孔的方向、孔的连通性易于调控，例如孔的尺寸能从几百纳米到几百微米变化；3)多孔材料的形状由冰凝诱导的模具决定，易于得到具有不同形状的多孔材料，从而满足不同部位的特殊需求；4)具有可调控的机械性能和降解特性，易于通过二氧化硅和羟基磷灰石组成和分布的变化调控其机械性能和降解性质；5)良好的生物活性，所制备多孔材料由无毒的短肽、二氧化硅、羟基磷灰石组成，表面羟基磷灰石和硅羟基的存在以及材料所具有的多级孔结构赋予其良好的生物活性，有助于骨细胞的粘附增殖，促进受损骨组织的修复；6)简单、环境友好的制备工艺，冰凝诱导是以水作为溶剂，以冰晶作为模板制备多孔材料，未引入其他杂质，并且除去冰晶模板也比较方便；整个过程不需要复杂的设备，成本较低且容易实现。
本发明的再一实施例提供了一种如上述实施例中任一项所述的一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料作为三维支架材料在骨修复中的应用。由本发明实施例制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料具有良好的机械性能和生物学功能，可调控的孔结构特性降解特性，可作为骨修复的三维支架 材料使用，有望提高缺损或病变骨部位的修复效果。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法，以下将结合具体实施例进行说明。
实施例1
首先配置4mM的两亲性短肽溶液，并放置于室温待其自组装；向1mL组装好的两亲性短肽溶液中加入40μL正硅酸四乙酯和1wt％的聚乙烯醇，振荡均匀后在25℃反应3天得到短肽/二氧化硅凝胶；将所得的凝胶用超纯水置换6次后，与-80℃冰箱进行冰凝诱导处理，冻干后于模拟体液中浸泡3天后得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料1。
实施例2
首先配置10mM的两亲性短肽溶液，并放置于室温待其自组装；向1mL组装好的两亲性短肽溶液中加入200μL正硅酸四乙酯和2wt％的海藻酸钠，振荡均匀后在25℃反应得到短肽/二氧化硅水凝胶；将所得的凝胶用超纯水置换6次后，与-196℃液氮中进行冰凝诱导处理，冻干后于模拟体液中浸泡5天，得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2。
实施例3
首先配置2mM的两亲性短肽溶液，并放置于室温待其自组装；向1mL组装好的两亲性短肽溶液中加入正硅酸四乙酯和3wt％的壳聚糖，振荡均匀后在25℃反应得到短肽/二氧化硅水凝胶；将所得的凝胶用超纯水置换8次后，与-20℃冰箱进行冰凝诱导处理，冻干后于模拟体液中浸泡6天，得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料3。
由上述实施例1-3所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料在外观、三维结构、保水性能和细胞毒性方面比较相似，只是材料的孔径和机械 强度不同。以下将以实施例2得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料2为例进行具体描述。
实施例4
短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的形态及结构表征
通过普通的数码相机获得短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的外观照片，如图1所示，得到的材料材质均匀，且具有较好的机械强度。
短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的微观结构以及孔特性通过扫描电子显微镜获得。所用仪器为：日立公司所生产的S-4800冷场发射扫描电子显微镜，采用加速电压5kV。
本实施例结合冷场发射扫描电子显微镜观察短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的微观结构。具体的，首先对短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料样品内进行预处理，干态放置于液氮中冷冻30min后进行脆断，且分别沿着原冰晶生长的垂直方向和平行方向切断，获得垂直于冰晶生长方向和平行于冰晶生长方向的不同截面。然后把处理后的样品分别粘到有导电双面胶的样品台上，对样品喷金1-2min增加导电性，然后放入样品室，找到合适样品区域并调到适当放大倍率进行扫描拍照。
由图2A中可以看出，材料的横截面由多个孔隙排列而成。材料孔隙在50um左右，孔径比较均匀，反映了冰凝诱导法制备短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料孔径较为均匀。
由图2B中可以看出，材料的纵截面由多个半圆筒性的孔隙组成。其直径在50um左右，反映了材料形成的是具有方向性的直通孔，且空隙的方向是沿着冰晶生长方向延伸的。
由图2C中可以看出，三维大孔材料的孔壁是由一维的纳米纤维结构堆积而 成。一维纳米纤维的直径在15nm左右，表面较为粗糙。与单纯的二氧化硅矿化相比，纤维的直径增加且表面变得粗糙，表明有其它的颗粒在短肽/二氧化硅纤维表面沉积。这种无机材料包覆有机组装体形成的一维结构在机械性能提高的同时保留了有机组装体的弹性，因此，由这些一维复合纤维形成的大孔材料具有良好的机械性能，而且纤维之间保留了足够的纳米级别的堆积空隙。
实施例5
短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的孔分布表征
本实施例中的孔分布测试采用AutoporeⅢ-9420型压汞仪，分别测试1-6000psi下的进汞曲线和退汞曲线，然后通过计算得出材料的孔径分布。首先在真空条件下给材料脱气5h后进行压汞测试，测试时由低压到高压依次渐变，记录每次升压时压入的汞体积即可。
由图3中可以看出，其在50.69μm处的孔径分布量最大，其次还有在100μm、20μm、2μm等处均有少量的孔隙存在，反映了通过冰凝诱导法制备的多孔材料能够形成以某一孔径为主导的多级孔结构。因此，通过冰凝诱导法不仅仅能获得较大孔径的直通孔，还能得到许多较小孔径的其它孔，形成了这种多级孔分布的特性，更有利于骨细胞的生长以及营养物质和代谢废物的排出。
实施例6
短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的元素分布表征
短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料中的各主要元素分布通过扫描电子显微镜附带的能谱仪获得。所用仪器：日立公司所生产的S-4800冷场发射扫描电子显微镜-能谱仪，采用20kV的工作电压进行大范围内普通扫描。
本实施例结合场发射扫描电子显微镜-能谱仪测定短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料中Si，P，Ca，O四中元素的分布。具体的，首先把大孔材料研磨 成粉末状，然后把处理后的样品分别粘到有双面胶的样品台上，放入样品室，找到合适样品区域并调到适当放大倍率进行能谱分析。
由图4中可以看出，谱图中硅和氧的含量最多，说明二氧化硅仍然是复合材料中的主要成分。但钙和磷的元素峰也比较明显，说明复合材料含有较多的钙磷化合物。由于其钙磷比为1.7，故推断其为羟基磷灰石。以上分析表明，所制备材料为具有多级孔结构的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石复合材料。
实施例7
短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的细胞毒性表征
按照实施例2中的反应物组成和工艺条件在96孔聚苯乙烯细胞培养板中成胶，并通过冰凝诱导处理后，于超净台紫外灯下灭菌半小时后分别用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)和达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基置换数次，然后接种细胞并进行细胞毒性实验。培养使用DMEM高糖培养基(培养基中含有10％的胎牛血清)培养成骨细胞，在37℃、5％的二氧化碳氛围下培养一天和三天后，加入少量噻唑蓝(MTT)溶液(浓度为0.5mg/mL)，作用4h后吸弃培养基并加入一定量二甲基亚砜(DMSO)待甲臜完全溶解后于酶标仪中读取490nm处的吸光度值。通过转换即可得到细胞在材料中的生长情况。其结果如图5所示，可以看出，短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料，其细胞存活率均在90％以上，符合医学上的使用标准。
综合以上实施例，通过仿生矿化和冰凝诱导法构筑的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料，具有良好的孔结构调控性能和机械性能、较低的毒性和良好的生物功能性，作为三维支架材料在骨修复领域具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将短肽分子溶于水中，超声分散，调节至指定pH值，在一定温度下放置使其组装，得到含有短肽自组装体的溶液，即短肽溶液；
将短肽溶液、硅前驱体、粘合剂混合，使硅前驱体水解并在短肽组装体表面形成二氧化硅沉积层，继续反应形成短肽/二氧化硅凝胶；
将短肽/二氧化硅凝胶用超纯水置换，然后利用冰凝诱导法，在不同的冷冻域中冷冻样品，冷冻干燥后即可得到短肽/二氧化硅多孔材料；
利用模拟体液浸泡材料，在短肽/二氧化硅多孔材料表面沉积羟基磷灰石层，一定时间后冷冻干燥得到短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的短肽为两亲性阳离子短肽，疏水部分由3-10个甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸组成，亲水部分由1-3个赖氨酸、精氨酸或组氨酸构成，疏水部分和亲水部分通过肽键连接。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将短肽溶解于水后，调节至pH 3-9，使其在温度15-50℃的水溶液中放置，最终能够自组装成纳米纤维。
4.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：硅前驱体为正硅酸乙酯或正硅酸甲酯，粘合剂为聚乙烯醇、壳聚糖、海藻酸钠中的一种，浓度分别为短肽1-10mM、硅前驱体50-500mM、粘合剂1-3wt％。
5.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：将形成的凝胶置于大量超纯水中进行置换，每4-12小时换一次水，目的是为了除去在二氧化硅形成过程中生成的少量乙醇或甲醇。
6.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：所述的冰凝诱导法是以凝胶在冷冻过程中形成的冰晶为模板驱动溶质组装，然后除去冰晶得到多孔 材料的方法。
7.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：冰凝诱导的温度在-196-0℃之间，温度梯度在10-196℃之间，样品首先在冷冻源中冷冻10-60分钟，然后在-80℃冰箱中熟化10-30分钟。
8.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：将短肽/二氧化硅多孔材料在37℃的SBF模拟体液中浸泡3-6天，每12-48小时更换一次模拟体液。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料的制备方法所制备得到的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料。
10.一种如权利要求9所述的短肽/二氧化硅/羟基磷灰石多孔复合材料作为三维支架材料在骨修复中的应用。
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