CN102686742A - 耐药性甲型流感病毒的检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测样本中奥塞米韦耐药性甲型流感病毒的存在的方法，该方法包括检测扩增子、其片段和/或衍生物的存在，其中所述扩增子、其片段和/或衍生物（a）是通过引物（SEQ ID NO:1）、其片段或衍生物和/或引物（SEQ ID NO:2）、其片段或衍生物扩增的。本发明还提供了用于检测样本和/或受试者中甲型流感的存在的引物和/或探针以及试剂盒。

Description

耐药性甲型流感病毒的检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及用于检测甲型流感病毒的存在的引物、探针以及使用该引物和/或探针的方法和试剂盒。特别地，本发明涉及抗病毒药物耐药性甲型H1N1亚型流感病毒的检测。

背景技术

甲型流感是由流感病毒的甲型毒株引起的动物传染疾病，流感病毒的甲型毒株通常传染鸟，较不常见传染猪。甲型流感病毒有很多亚型。这些亚型都基于血细胞凝集素（HA）片段4（具有14种变种）和神经氨酸酶（NA）片段6（具有9种变种）。正是病毒中的这两个片段引发毒性。

例如，众所周知，甲型H1N1亚型流感病毒变异迅速，并且已显示出高致病性并在人类中能引发严重的疾病。H1N1已被视为快速遗传进化和大流行性变化的模型。通常，进化解释为是对由缺乏复制功能的聚合酶复合体产生的频繁复制错误的选择。随后为了进化优势，如逃避宿主的免疫应答，而选择这些错误，这使得流感扩散并固定所选定的突变。流感病毒也会使用重组从而通过同源重组来快速进化。因此，在流感中突变频繁发生并且这些变体可以包括如抗病毒药物耐药性、逃避免疫识别的能力等性质。而且，在英国对64名儿童的研究证实了H1N1流感病毒比H3N2流感病毒和乙型流感病毒具有更高比率的耐药性。

过去较为常用的抗病毒药物之一是奥塞米韦（oseltamivir）。其过去被用作治疗季节性H1N1的单一疗法。然而，随着具有奥塞米韦耐药性的H1N1的出现，奥塞米韦的有效性下降。在每个报告的病例中，都分离出带有神经氨酸酶多态性H274Y的H1N1。这个变化是可以预期的，因为其位于该酶的活性位点，而且奥塞米韦结合需要在该活性位点处的构象变化，而H274Y抑制这种变化，从而产生了一种具有奥塞米韦耐药性的毒株。

带有H275Y突变的季节性H1N1病毒在2007-2008的北半球流感季节期间蔓延很广。在2007-2008年，从大洋州、东南亚和南非收集的甲型流感病毒（H1N1）分离物中有64%检测到了H275Y突变（Hurt,2009）。感染了奥塞米韦耐药性病毒的患者可能比感染了野生型病毒的患者更容易发展成肺炎或者鼻窦炎。过去普遍认为在季节性H1N1中耐药性的出现是由于药物疗法的选择性压力导致的以及耐药性病毒可能较不太适合于疾病传播。然而，2002和2007年之间，在欧洲，在面对相对低使用量的奥塞米韦，耐药性的季节性H1N1快速取代了易感的野生型季节性H1N1（Kramarz P等,2009）。

最近，在2009年流感大流行中，人们发现，分离出的新的病毒株（甲型（H1N1）2009流感病毒）是由四种不同流感病毒——北美猪流感病毒、北美禽流感病毒、人流感病毒以及在亚洲和欧洲通常发现的猪流感病毒的遗传成分组成。这种新毒株的出现似乎是H1N1亚型的所有四种不同毒株中的人流感病毒和猪流感病毒重配的结果。

近来也已在至少39个H1N1病例中报道了与体外奥塞米韦耐药性相关的主要突变（H275Y）（WHO Pandemic (H1N1)2009-update 71（世界卫生组织(H1N1)2009大流行-更新71））。人们由体外数据设想了该病毒中的这种突变的临床重要性。季节性H1N1中的这种突变在世界范围内的大流行从2007年的可以忽略迅速增加到2009年三月的高至95%（http://www.who.int/csr/disease/influenza/h1n1_table/en/index.html）。

甲型（H1N1）2009流感病毒于2009年5月在新加坡首次检测到。在降低病毒传播的努力中，将感染的患者进行隔离直到作为传染性的替代标记（surrogate marker）的PCR不再能检测到该病毒。对从新病例取得的样本系统地进行H275Y突变的监视。

具有奥塞米韦耐药性的季节性H1N1的自发性出现并不令人惊讶，但是其传播性、流行性和持久性是料想不到的。真正的问题是对带有H275Y突变的流感的病危病例使用奥塞米韦作为单一疗法时，奥塞米韦是否会失败。我们过去认为对于季节性H1N1其会失败，并预期对甲型（H1N1）2009流感病毒也相同。因此，人们更关注于考虑甲型（H1N1）2009流感病毒的耐药性突变体是否会重复在2007-2009年中季节性H1N1的全球性扩散以及是否会取代目前的野生型“易感”H1N1病毒和通常占主要地位的H3N2病毒两者而发展成为主要的流感病毒。

发明内容

随着基因组中发生突变（该突变导致了病毒在体内更易存活的性质）的甲型流感病毒的新毒株的迅速出现，早期检测和治疗是消除该病毒的根本。分子生物学技术（如PCR和RT-PCR）可以用于检测该病毒。然而，由于甲型流感病毒易于突变，因此所使用引物的灵敏性是最根本的。而且，因为耐药病毒的出现具有公共卫生重要性，所以抗病毒耐药性甲型流感病毒的特异性和/或灵敏性检测方法是很重要的。

由甲型（H1N1）2009流感病毒引发的疾病和由季节性H1N1引发的疾病的严重程度相似，仅有少数比例的感染导致严重的疾病。然而，人们顾虑的是，由于全球青少年人群的免疫系统较为脆弱，可能会存在巨大数量的流感，以及由于该分母较大，少数比例的严重病例可能实际上代表了相当大量的一群人。这些病例中，抗病毒疗法和耐药性发展十分重要。如果和季节性H1N1一样，耐药性突变体变得普遍，则需要耐药性测试，但是因为必要的技术相对不能实现，实验室不能够满足这些要求；根据经验进行的奥塞米韦单一疗法变得不太合适，并且实践上可能会迅速采用扎那米韦作为单一疗法，或者和奥塞米韦一起使用作为双保险（dual cover）。因此，抗病毒耐药性甲型（H1N1）2009流感病毒的特异性和/或灵敏性检测方法是最根本的。

本发明提供了用于在患者样品中检测甲型流感病毒的方法中的高灵敏性和特异性的寡核苷酸、其片段和/或衍生物。本发明的寡核苷酸能够通过单基因扩增而得到高产率的扩增子，并能提供用于检测由甲型流感病毒引发的感染和/或与其相关的疾病状态的快速和经济的诊断和预后试剂。特别是，本发明的寡核苷酸可以用于检测抗病毒药物耐药性甲型流感病毒。所述甲型流感病毒毒株会具有耐药性的抗病毒药物可以为神经氨酸酶抑制剂，例如奥塞米韦、扎那米韦（zanamivir）、帕拉米韦（peramivir）或其类似物。特别是，甲型流感病毒可以对奥塞米韦具有耐药性。更特别地是，抗病毒药物耐药性甲型流感病毒可以是H1N1亚型。这些引物可以提供能够在现场（即，在医疗点（“POC”））进行的提供详实信息的流感测试。

根据第一个方面，本发明提供了至少一种分离的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3、它们的片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3、它们的片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由选自SEQID NO:1到SEQ ID NO:3、它们的片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。所述寡核苷酸可以与甲型流感病毒结合，和/或从甲型流感病毒扩增。甲型流感病毒可以是抗病毒药物耐药性毒株。特别是，该抗病毒药物可以是奥塞米韦。所述抗病毒药物耐药性毒株可以是H1N1亚型。

根据另一个方面，本发明提供了至少一对寡核苷酸，其包含至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列，基本由SEQ ID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列组成，或者由SEQ ID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列组成；所述反向引物包含SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列，基本由SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列组成，或者由SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列组成。

根据一个方面，本发明提供了一组寡核苷酸，其包含一对根据本发明任一方面的寡核苷酸和至少一种探针。

根据另一个方面，本发明提供了一种使用至少一种正向引物和至少一种反向引物从甲型流感病毒扩增的扩增子，所述至少一种正向引物包含SEQ IDNO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列中的核苷酸序列，基本由SEQ IDNO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列中的核苷酸序列组成，或者由SEQID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列中的核苷酸序列组成；所述至少一种反向引物包含SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列中的核苷酸序列，基本由SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列中的核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列中的核苷酸序列组成。

根据一个方面，本发明提供了至少一种检测生物样本中甲型流感病毒存在的方法，该方法包括以下步骤：

（a）提供至少一种生物样本；

（b）使根据本发明任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸或一组寡核苷酸，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及

（c）检测从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时甲型流感病毒存在。

甲型流感病毒可以是抗病毒药物耐药性毒株。特别是，所述抗病毒药物可以是奥塞米韦。所述抗病毒药物耐药性毒株可以是H1N1亚型。

根据一个方面，本发明提供了至少一种扩增抗病毒药物耐药性甲型流感病毒核酸的方法，其中所述方法包括使用根据本发明任一方面的至少一种正向引物和根据本发明任一方面的至少一种反向引物进行聚合酶链式反应。所述抗病毒药物耐药性毒株可以是H1N1亚型。

根据另一个方面，本发明提供了至少一种检测抗病毒药物耐药性甲型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包含根据本发明任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸和/或根据本发明任一方面的一种测序引物（sequencingprimer）。所述抗病毒药物耐药性毒株可以是H1N1亚型。所有引物和探针可以混合从而在单管中构成基于多重一步荧光探针的实时PCR，同时具有高度特异性和灵敏性。

根据一个特别的方面，提供了用于能检测患者样本中奥塞米韦耐药性甲型流感病毒DNA的PCR方法中的高度灵敏和特异性引物、其片段和/或衍生物。该测试可以用于检查来自携带甲型流感病毒，特别是奥塞米韦耐药性甲型H1N1亚型流感病毒的患者的样品。该引物可以是灵敏和特异性的。而且，可以在每个反应中包括至少一种IC分子从而监控PCR的性能。

如通过以下描述将显而易见的，本发明的优选实施方式允许最佳使用所述寡核苷酸以利用这些引物的特异性和选择性。通过以下描述，这点和其他相关优点对本领域技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1示出了一名患者（28岁的女性美国海军军官）的临床检查结果。该结果显示了体温的每小时趋势、临床症状、PCR测试阳性和奥塞米韦治疗，其中“1”表示服用奥塞米韦或报告的临床症状或PCR测试阳性结果，以及“0”表示没有。

图2示出了焦磷酸测序序列（H275Y分析的热解图轨迹(Pyrogramtrace)）。每个曲线图中序列读数都为GT(G/A)ATA。阴影区域表示突变位点。阴影框中的G峰在0和1之间变化（标准化单位），然而由于序列中随后的核苷酸为A，所以G之后的A峰在1和2之间变化。

（a）5月27日读取的读数，直接在样本上；100%的野生型G；

（b）5月27日读取的读数，病毒分离物；100%的野生型G；

（c）5月29日读取的读数，直接在样本上；100%的野生型G；

（d）5月30日读取的读数，直接在38小时的样本上；76%的野生型G和24%的突变型A；

（e）5月30日读取的读数，直接在45小时的样本上；46%的野生型G和52%的突变型A；以及

（f）5月30日读取的读数，培养样本；100%的突变型A。

具体实施方式

为方便起见，本说明书中涉及的参考文献以文献列表的形式列出并附到实施例后面。这些参考文献的全部内容通过引用的方式并入本文。

定义

本文所用术语“生物样本”定义为来自至少一种动物和/或植物的任何组织和/或流体的样本。生物样本可以是动物（包括人）的流体、固体（例如，粪便）或者组织，以及液体和固体食物和饲料产品和原料，如乳制品、蔬菜、肉和肉类加工副产品以及废料。生物样本可以从所有各种各样的家畜以及野化家畜或者野生动物科中获得，包括，但不限于，如有蹄类动物、熊、鱼、兔形动物、啮齿动物等等的动物。环境样本包括环境材料，如表面物质、土壤、水、空气和工业样本，以及从食物、乳品加工器械、设备、装备、器具、一次性和非一次性产品得到的样本。这些实例并不解释为限制可适用于本文中所公开方法的样本类型。特别是，生物样本可以是至少来自人类的任何组织和/或流体。

本文所用术语“互补”是指与碱基配对规则有关的多核苷酸（即，如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列）。例如，“5'-A-G-T-3'”序列与“3′-T-C-A-5'”序列互补。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著作用。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中尤为重要。特别是，“互补序列”是指这样一种寡核苷酸，当与核酸序列排列以使一种序列的5'末端与另一序列的3'末端配对时，其处于“反向平行联会”状态。一些在天然核酸中不常发现的碱基可以被包含在本文所公开的核酸中，并且包括，例如，次黄嘌呤核苷和7-脱氮鸟嘌呤（7-deazaguanine）。互补性无需是完全的；稳定的双链体可以包含错配碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以凭经验考虑许多变量来确定双链体的稳定性，所述变量包括，例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。在第一寡核苷酸与靶核酸的一个区域互补并且第二寡核苷酸与相同区域（或者该区域的一部分）具有互补性的情况下，则沿所述靶核酸就存在一个“重叠区（region of overlap）”。重叠程度可以根据互补性的范围而变化。

本文所用术语“包含（包括）（comprising）”定义为“主要包含（包括），但不是必须唯一的”。而且，本领域技术人员会自发地将术语“包含（包括）”解读为包括“由……组成”。词语“包含（包括）（comprising）”的变形，如“包含（包括）（comprise）”以及“包含（包括）（comprises）”，具有相应的各种含义。

本文所用术语“衍生物”定义为本发明的寡核苷酸的化学修饰，或者与所述寡核苷酸互补的多核苷酸序列的化学修饰。多核苷酸序列的化学修饰可以包括，例如，用烷基、酰基或氨基取代氢。

本文所用术语“片段”定义为寡核苷酸全序列的不完整或分离的部分，其包含赋予该序列所述寡核苷酸的特征和功能的活性/结合位点。特别是，其可以短至少一个核苷酸或者氨基酸。更特别的是，所述片段包含能够使所述寡核苷酸与流感病毒结合的结合位点。本发明的寡核苷酸片段的长度可以为约20个核苷酸。特别是，所述寡核苷酸片段的长度可以为至少约10个核苷酸。例如，正向引物的片段可以包含SEQ ID NO:1的至少10、12、15、18或19个连续的核苷酸，和/或反向引物的片段可以包含SEQ ID NO:2的至少10、12、15、18、19、20、22或24个连续的核苷酸。更特别的是，引物片段的长度可以为至少15个核苷酸。

本文所用术语“H275Y”定义为甲型流感病毒基因中的突变，该突变会导致沿神经氨酸酶蛋白在275位置上的原始氨基酸由预期的野生型“H”（组氨酸）变为“Y”（酪氨酸）。在流感基因中的实际变化是从胞嘧啶碱基到胸腺嘧啶碱基的单点突变。

本文所用术语“内对照（IC）分子”定义为这样一种体外转录的寡核苷酸分子，所述寡核苷酸分子是通过本发明方法中使用的针对流感病毒的相同引物组进行共扩增的。特别是，所述IC可以被混合在反应混合物中以监测PCR的运行，从而避免假阴性结果。用于检测该IC分子的探针可以特异性针对该分子的内部部分。该内部部分可以为人工设计的并且在自然界不会发生。

本发明上下文中使用的术语“流感病毒”包括所有落入“禽流感病毒”和“人流感病毒”范畴的流感病毒亚型。所述流感病毒可以是甲型、乙型或丙型流感病毒。特别是，所述甲型流感病毒可以包括，但不限于H1N1、H3N2、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7和H9N2等。

本文所用术语“突变”定义为在核酸序列中一定长度的核苷酸的改变。本领域技术人员将理解的是，小的突变，特别是置换、缺失和/或插入的点突变对核苷酸的延伸影响不大，特别是在所述核酸被用作探针时。因此，根据本发明的寡核苷酸包括至少一个核苷酸的替换、缺失和/或插入的突变。而且，根据本发明的寡核苷酸及其衍生物也可以用作探针，因此，本文所涉及的任何寡核苷酸也包括它们的突变和衍生物。例如，如果突变发生在靶基因的任何引物杂交位点的几个碱基位置处，特别是在5'-末端，引物的序列不会影响该引物的灵敏性和特异性。

术语“生物样本中的核酸”是指任何包含核酸（RNA或DNA）的样本。特别是，核酸的来源是包括但不限于血液、唾液、脑脊髓液、胸膜腔积液、乳汁、淋巴液、痰和精液的生物样本。

根据本发明的寡核苷酸可以用作引物和/或探针并且可以用于特异性检测样本（含有一种或两种流感病毒株和/或其他不相关的病毒/微生物）中抗病毒药物耐药性甲型流感病毒的方法中。这些本发明的引物和探针的核苷酸序列被设计成特异性地与耐药性的甲型流感病毒基因组的区域杂交，所述区域相对于各毒株的基因组是独特的，但是在各毒株内所述区域是保守的，横穿很多病毒。

根据本发明任一方面的引物可以用于区分耐药性甲型流感病毒和非耐药性甲型流感病毒的基因型。特别是，根据本发明的引物可以用于区分耐药性甲型流感病毒的不同亚型的基因型。甚至更特别的是，所述引物可以用于区分带有猪源H1N1分型确认的甲型流感病毒、季节性H1N1和季节性H3N2等。

所述流感病毒的耐药性毒株可以对选自金刚烷胺（amantadine）、奥塞米韦、金刚乙胺（rimantadine）和扎那米韦（zanamivir）等中的一种或多种药物有耐药性。所述流感病毒的耐药性毒株可以是对多种药物有耐药性的多药耐药性毒株。

所述寡核苷酸序列的长度可以在13至35个连接的核苷酸之间并且可以包含与选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3中的任意序列的至少70%序列同一性。本领域技术人员将理解的是，给出的引物无需以100%的互补性杂交以有效地启动扩增反应中互补核酸链的合成。引物可以在一个或多个区段上杂交，以使插入或相邻区段不参与杂交事件（例如，环结构或发夹结构）。特别是，所述寡核苷酸的序列可以具有与选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3中的任一序列的80%、85%、90%、95%或98%的序列同一性。

序列同一性的70%到100%的变化范围，或者这其中的任何范围可以与公开的特异性引物序列相关。下述实例中描述了序列同一性的确定：一个长度为20个核苷酸的引物，其与另一个具有两个非全同残基的长度为20个核苷酸的引物一致，则其具有20个中的18个相同残基（18/20=0.9或90%序列同一性）。另一个实例中，一个长度为15个核苷酸的引物，其所有残基都与一个长度为20个核苷碱基的引物中的15个核苷酸的区段一致，则其就会与该20个核苷酸的引物具有15/20=0.75或75%的序列同一性。

同源性、序列同一性或者互补性的百分比可以通过，例如使用默认设置的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,GeneticsComputer Group,University Research Park,Madison WI(Wisconsin序列分析包，UNIX版本8，遗传学计算机组，大学研究园，麦迪逊，威斯康辛州))来确定，其采用Smith和Waterman的算法（Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489）。技术人员能够计算出序列同一性百分比或者序列同源性百分比，并能够无需过多实验就能确定引物序列同一性的变化对引物行使其启动用于制备扩增产物的核酸互补链的合成的功能的影响。

一组寡核苷酸可以包含根据本发明任一方面的一对寡核苷酸和至少一种探针。所述探针可以用荧光染料在其5'和3'末端标记。5'-标记荧光染料的实例可以包括，但不限于，6-羧基荧光素(FAM)、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、四氯-ó-羧基荧光素和花青-5(Cy5)。3'-标记荧光染料的实例可以包括，但不限于，5-羧基四甲基若丹明(TAMRA)和黑洞猝灭剂-1,2,3(BHQ-1,2,3)。

本发明的寡核苷酸可以用于本领域中已知的各种核酸扩增技术，如，举例来说，聚合酶链式反应（PCR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、转录介导的扩增（TMA）、滚环扩增（RCA）、链置换扩增（SDA）、耐热SDA（tSDA）或连接介导的扩增（LMA）。本发明的寡核苷酸也可以用于本领域普通技术人员已知的各种方法中以通过直接与病毒核酸杂交来直接检测甲型流感病毒而不进行扩增，或者用于检测病毒核酸的DNA或RNA拷贝或它们的互补。

根据本发明任一方面的寡核苷酸可以用于从临床或培养样本中检测流感病毒的方法中，其中，所述临床样本可以包括但不限于，鼻咽拭子、鼻拭子和咽喉拭子以及鼻咽分泌物和清洗物。所述临床样本可以在测试以前进行初步处理从而使病毒核酸的检测更有效。例如，可以收集样本并加入到运送培养基中以使病毒稳定。可以将鼻咽拭子、鼻拭子和咽喉拭子加入到运送培养基中。鼻咽分泌物和清洗物可以或不用通过添加运送培养基而稳定。测试实验室一旦收到病毒，就可以将其灭活并溶解以释放病毒RNA。核酸可以任选地随后被提取从而除去后续测试步骤的潜在抑制剂或其他干扰剂。为了进行本发明的方法，可以将病毒核酸与对于特异性检测甲型流感病毒必不可少的组分混合。

检测生物样本中甲型流感病毒存在的方法和/或扩增抗病毒药物耐药性甲型流感病毒核酸的方法可以进一步包含分析所述扩增序列的步骤。特别是，所述分析步骤可包括测序。更特别地是，所述测序步骤可以是使用测序引物的焦磷酸测序方法，所述测序引物包含SEQ ID NO:3、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列，基本由SEQ ID NO:3、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成，或者由SEQ ID NO:3、其片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列组成。对临床材料直接使用焦磷酸测序能够在没有污染或稀释病毒培养物的效应下测量这些混合基因型的动态特性。

本发明提供了至少一种用于检测甲型和/或乙型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明任一方面的至少一种寡核苷酸、一对寡核苷酸或一组寡核苷酸。临床医生可以使用所述试剂盒从而检测受流感症状折磨的患者的人流感病毒和禽流感病毒。这样的试剂盒会包括一种或多种引物和探针组以检测甲型流感病毒、耐药性甲型流感病毒和/或耐药性甲型（H1N1）流感病毒。

实施例

本领域已知的和未被具体说明的标准分子生物学技术通常按照Sambrook和Russel的《分子克隆：实验室指南》,冷泉港实验室（Cold SpringsHarbor Laboratory），纽约(2001)中的描述进行。

实施例1

样本

将流行病学资料和临床资料以及日常呼吸拭子作为大流行爆发计划的一部分收集起来。采用easyMag仪器（Biomerieux）提取核酸。在Mx3005P仪器（Stratagene,美国）上对甲型流感病毒（H1N1）2009病毒进行带有内部评价的实时RT-PCR。MDCK细胞用于病毒培养。尽管采用三种测序方法（使用ABI BigDye terminator chemistry的传统测序、克隆PCR产物并随后测序和焦磷酸测序），但是，对从未培养的样本中提取的RNA直接使用焦磷酸测序所得到的结果如下所示。

-患者和病毒

患者是一名在新加坡的28岁的女性美国海军军官，她于2009年5月13日到18日至北加州旅行并于2009年5月18日至25日至夏威夷州旅行。她在5月25日开始不舒服，伴有咽喉痛、肌肉疼痛、右眼发红以及咳嗽并带有黄色痰的症状。她没有注意到任何发烧情况并没有过去医疗疾病的记录。在5月27日（生病3天），她在海军救护所寻求治疗并被转到指定的国家爆发管理中心（National outbreak management centre）——陈笃生医院（Tan TockSeng Hospital）的传染病中心去接受治疗和隔离。

入院临床检查和她的整个住院期较为寻常。生病第4天记录的体温最大值是38.8℃；见图1。入院时，她的白血球计数为5300/μl，其中53.5%是嗜中性白血球，30.8%是淋巴细胞。胸部X线摄影、肝功能和肾功能测试以及C反应性蛋白均比较寻常。5月27日晚上获取的两组结合的鼻拭子和咽喉拭子在2009年5月28日报告为甲型（H1N1）2009流感病毒阳性。那天之后在6:00PM开始了奥塞米韦治疗。她在生病第5天退烧并且两天之后（5月31日）出院。11个亲密接触者全部服用奥塞米韦预防并保持良好。

实验室结果如表1所示。

表1：4天收集的呼吸样本的结果。RT-PCR=甲型（H1N1）2009流感病毒的反转录PCR；nd=未做；ct=循环阈值。这示出了病毒存在的相对量。数值越高表示病毒越少。每增加3.3个循环代表数量上降低10倍。突变体=H275Y突变。

用于焦磷酸测序的扩增子的建立

采用SuperScript^TM III一步RT-PCR系统，用

Taq（目录号：12574-018），在含有5μl RNA样本的50μl反应体积中进行RT-PCR。在热循环仪中，通过终浓度为0.25μM的正向引物(5'-3')Bio/TGCTTTACTGTAATGACCGAT(SEQ ID NO:1)和终浓度为0.2μM的反向引物(5'-3')GATTCTGGTTGAAAGACACCC(SEQ ID NO:2)产生生物素化的PCR产物。这些引物被设计成通过单基因扩增而获得高得率的扩增子。所得的217bp长的扩增子容纳了产物中用于H275（CAC）或者H275Y（TAC）的密码子。按照以下步骤和条件使用EppendorfMastercycler-ep-gradient-S仪器（Hamburg,德国）：在55℃逆转录10分钟；和在94℃初始变性2.5分钟，随后进行40个循环（94℃变性32秒，57℃退火76秒和68℃延伸33秒），以及在68℃最终延伸5分钟。扩增后，通过常规凝胶电泳分析PCR产物从而评价产物的得率。

焦磷酸测序

根据厂商指南，用测序引物(5'-3')TAGAATCAGGATAACAGGAGCA(SEQ ID NO:3)对约200ng的生物素化产物进行焦磷酸测序。

焦磷酸测序序列如图2所示。

在奥塞米韦疗法开始前一天、当天以及开始之后一天收集的样本中仅检测到野生型序列。从奥塞米韦开始使用那天收集的样本中分离的病毒序列是100%野生型。通过直接对从该疗法开始后38和45小时收集的临床样本进行焦磷酸测序检测到混合的野生型和突变型序列；突变型病毒的比例分别为23%和52%。即使采用焦磷酸测序，38小时样本的体外培养病毒表现为100%突变。

患者自她发病后第7天出院，但是突变出现以及相对于野生型病毒而占优势的速度是显著的。在甲型H1N1流感治疗期间耐药性的快速出现以及在治疗48小时内占优势的突变群体一步一步的建立是意料不到的，并且比报道的H5N15天（Gupta R.K.等,2006）快很多。从38小时样本的培养物中分离的病毒是100%突变型也是显著的。尽管在培养之前，原样本中的病毒76%是野生型的。耐药性突变体长得比野生型快并且在细胞培养中变为优势病毒的这一观察就是其适应性的证据。对临床材料直接使用焦磷酸测序能够在没有病毒培养物的污染或稀释效应的情况下测得这些混合基因型的动态特性。尽管它是精确的方法，但是其仍不能排除出现少数（<5%）亚群（Fakhrai-RadH等,2002）。然而，在38小时样本中23%的少数突变群体在培养后的分离物中变为仅有的可检测病毒的能力表明，如果在奥塞米韦治疗之前该突变就已出现，那么在生病第4天，其会在奥塞米韦治疗之前的几小时收集的样本的培养物中检测到。但是，在从该样本分离的病毒中仅检测到野生型序列，以及在从培养前样本直接衍生的192个克隆中仅检测到野生型序列。这一数据表明在第四天后突变才发生并进行选择。

表1中的ct值显示出在生病第5天时病毒数量处在最大值，比生病第3天和第6天大大约1000倍。这对应于生病第4天和第5天的高烧，也对应于施用奥塞米韦的第一天。在病毒出现高峰量的时间施用奥塞米韦对于耐药突变体的选择是有效方法。

参考文献

1WHO Pandemic(H1N1)2009-update 71.2009年10月30日起可以得到.http://www.who.int/csr/disease/swineflu/laboratory23_10_2009/en/print.html

2Gupta R.K.,Nguyen-Van-Tam J.S.,de Jong M.D.,Hien T.T.,Farrar J.Oseltamivir Resistance during Treatment of Influenza A(H5N1)Infection.N EnglJ Med 2006;354:1423-1424.

3Influenza A(H1N1)virus resistance to oseltamivir.Summary Table March2009.2009年10月30日起可以得到.http://www.who.int/csr/disease/influenza/h1n1_table/en/index.html

4Kramarz P，Monnet D,Nicoll A,et al.Use of oseltamivir in 12 Europeancountries between 2002 and 2007–lack of association with the appearance ofoseltamivir-resistant influenza A(H1N1)viruses.Eurosurv 2009;14(5):1-5.

5Hurt AC,Ernest J,Deng YM,et al.Emergence and spread ofoseltamivir-resistant A(H1N1)influenza viruses in Oceania,South East Asia andSouth Africa.Antivir Res 2009;83:90-3.

6Fakhrai-Rad H,Pourmand N,Ronaghi M.Pyrosequencing:an accuratedetection platform for single nucleotide polymorphisms.Hum Mutat.2002May;19(5):479-85.

Claims (19)

1.一种分离的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3、它们的片段、衍生物、突变和互补序列中的至少一种核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸能与抗病毒药物耐药性甲型流感病毒结合，和/或从抗病毒药物耐药性甲型流感病毒扩增。

3.根据权利要求2所述的分离的寡核苷酸，其中，所述抗病毒药物是奥塞米韦。

4.根据权利要求2或3所述的分离的寡核苷酸，其中，所述甲型流感病毒是H1N1亚型。

5.一对寡核苷酸，其包含至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物包含SEQ ID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列，以及所述反向引物包含SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列。

6.一对寡核苷酸，其包含至少一种正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物由SEQ ID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列组成，以及所述反向引物由SEQ ID NO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列组成。

7.根据权利要求5或6所述的寡核苷酸对，其能与抗病毒药物耐药性甲型流感病毒结合，和/或从抗病毒药物耐药性甲型流感病毒扩增。

8.根据权利要求7所述的寡核苷酸对，其中，所述抗病毒药物是奥塞米韦。

9.根据权利要求7或8所述的寡核苷酸对，其中，所述甲型流感病毒是H1N1亚型。

10.一组寡核苷酸，其包含根据权利要求5～9中任一项所述的寡核苷酸对和至少一种探针。

11.一种使用至少一种正向引物和至少一种反向引物从甲型流感病毒扩增的扩增子，其中，所述至少一种正向引物包含SEQ ID NO:1、其片段、衍生物、突变和互补序列的核苷酸序列，所述至少一种反向引物包含SEQ IDNO:2、其片段、衍生物、突变和互补序列的核苷酸序列。

12.根据权利要求11所述的扩增子，其中，所述甲型流感病毒是奥塞米韦耐药性的。

13.一种检测生物样本中甲型流感病毒存在的方法，该方法包括以下步骤：

（a）提供至少一种生物样本；

（b）使至少一种根据权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及

（c）检测从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时甲型流感病毒存在。

14.一种检测生物样本中甲型流感病毒存在的方法，该方法包括以下步骤：

（a）提供至少一种生物样本；

（b）使根据权利要求5～9中任一项所述的寡核苷酸对，与生物样本中的至少一种核酸接触，和/或与从生物样本中提取、纯化和/或扩增的至少一种核酸接触；以及

（c）检测从步骤(b)中的接触产生的任何结合，由此当检测到结合时甲型流感病毒存在。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述病毒是抗病毒药物耐药性甲型流感病毒。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述抗病毒药物是奥塞米韦。

17.一种扩增甲型流感病毒核酸的方法，其中，所述方法包括使用SEQID NO:1和SEQ ID NO:2进行聚合酶链式反应。

18.一种检测甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含至少一种根据权利要求1～4中任一项所述的寡核苷酸。

19.一种检测甲型流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个根据权利要求5～8中任一项所述的寡核苷酸对。

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