CN102676571A - 一种真核蛋白表达载体及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及真核蛋白表达载体，所述表达载体为在pcDNA3.3TOPO表达载体的TOPO位点上插入Human IgG1-Fc基因，得到真核蛋白表达载体pcDNA3.3-IgG-Fc质粒。本发明构建的真核蛋白表达载体，不仅能引入外源基因进行蛋白表达，执行翻译后修饰，维护蛋白天然结构；获得极高的蛋白质表达水平，适合用于大规模蛋白制备；并可同时表达标签蛋白IgG-Fc，利用其可以对表达蛋白进行鉴定和纯化，且纯化及鉴定蛋白所用试剂为实验室常备试剂，价格低廉，摆脱了对生物公司配套产品的依赖及配套产品价格昂贵的困扰。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达载体，具体涉及一种真核蛋白表达载体及其构建和应用。
背景技术
蛋白表达是实验室应用非常广泛的技术，目前主要有原核表达系统和真核表达系统两种。
原核表达系统能够在较短时间内获得大量目的蛋白，成本也比较低廉。但无法对表达时间及表达水平进行调控；细菌产生的致热原致使表达产物难以应用于临床；目的蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难；原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善；表达产物的生物活性较低。
真核表达系统能够弥补原核表达系统的不足，能诱导基因高效表达，严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量；表达后修饰，使蛋白更接近体内型。但是成本相对高，并且表达量比原核要低。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
能使目的基因进入宿主细胞表达的克隆载体叫表达载体，可以是质粒、噬菌体或病毒等。典型的表达载体带有能使基因表达的调控序列，并在适当位置有可插入外源基因的限制性内切酶位点，常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶将目的基因与载体基因连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
Invitrogen公司的pcDNA3.1系列表达载体在大多数哺乳动物细胞里均能够高水平、稳定表达，其CMV启动子能够保证在广泛的哺乳动物细胞中进行高水平表达，多克隆位点是插入外源基因的部位，有很多种限制性内切酶的位点，可产生粘性末端，便于插入外源基因。Neomycin用于筛选稳定表达细胞系，Ampicillin用来筛选目的质粒。其中pcDNA3.1带有his，myc标签基因，his可以用于表达蛋白的纯化及鉴定，但购买pcDNA3.1带有his标签的真核表达载体，就要购买相应配套的蛋白纯化体系及鉴定体系的相关试剂，价格昂贵。而pcDNA3.3 TOPO表达载体是在pcDNA3.1的基础上对启动子进行了修饰，所以表达水平高于pcDNA3.1，能获得极高的蛋白质表达水平，适于大规模蛋白制备。但pcDNA3.3TOPO表达载体不带有任何标签基因，表达的蛋白无法进行富集纯化和鉴定。因此，要获得既能高效表达，又能易于富集纯化、鉴定目的蛋白的真核蛋白表达载体，还需要进一步的研究和创新。
发明目的
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种新型真核蛋白表达载体，该表达载体不仅能高水平表达蛋白、执行翻译后修饰、维护蛋白天然结构，并可同时表达用于表达蛋白鉴定和纯化的标签蛋白，而且鉴定及纯化蛋白所用的试剂不依赖于生物试剂公司，价格低廉。
本发明的另一目的是提供所述表达载体的构建方法。
本发明的第三个目的是提供所述表达载体在表达目的蛋白中的应用。
本发明提供的一种真核蛋白表达载体，所述表达载体为在pcDNA3.3TOPO表达载体的TOPO位点上插有Human IgG1-Fc基因，得到结构如下的所述真核蛋白表达载体pcDNA3.3-IgG-Fc质粒：
本发明提供的所述真核蛋白表达载体的构建方法，包括步骤：(1)human IgG1-Fc基因扩增引物设计，(2)以逆转录得到的cDNA为模板，PCR扩增human IgG1-Fc基因，(3)将human IgG1-Fc PCR扩增产物与pcDNA3.3TOPO载体连接，从中选择CMV forward引物测序human IgG1-Fc序列为正向的pcDNA3.3-IgG-Fc质粒，得到所述真核蛋白表达载体。
本发明提供的所述的真核蛋白表达载体在表达目的蛋白中的一种应用，其步骤包括(1)目的蛋白基因的特异引物设计，(2)以逆转录得到的cDNA为模板，以所设计引物进行PCR扩增，(3)目的蛋白基因的PCR扩增产物及pcDNA3.3-IgG-Fc用HindIII、BgLII及BamHI同时来酶切，连接具有相同粘性末端的pcDNA3.3-IgG-Fc部分和目的基因部分(4)目的蛋白富集：用所述目的基因插入pcDNA3.3-IgG-Fc构建的表达质粒，通过Lipofectin转染cos-7细胞，收集培养上清中加入蛋白A琼脂糖悬液，杂交炉中低温缓慢摇动混匀2.5-3.5小时，离心弃去上清，沉淀为蛋白A-目的蛋白复合物，加入上样缓冲液煮沸3-6分钟，取上清获得含目的蛋白和标签蛋白的融合蛋白。
本发明所述的真核蛋白表达载体在表达目的蛋白中的另一种应用，其步骤包括(1)目的蛋白基因的特异引物设计，(2)以逆转录得到的cDNA为模板，以所设计引物进行PCR扩增，(3)目的蛋白基因的PCR扩增产物连接于T-easy载体，(4)用BamHI、HindIII及BgLII同时来酶切所述pcDNA3.3-IgG-Fc和带目的蛋白基因的T-easy两种质粒，连接具有相同粘性末端的pcDNA3.3-IgG-Fc部分和目的基因部分，(5)目的蛋白富集：用所述目的基因与pcDNA3.3-IgG-Fc连接的表达质粒通过Lipofectin转染cos-7细胞，收集培养上清，加入蛋白A琼脂糖悬液，杂交炉中低温缓慢摇动混匀2.5-3.5小时，离心弃去上清，沉淀为蛋白A-目的蛋白复合物，加入上样缓冲液煮沸3-6分钟，取上清获得含目的蛋白和标签蛋白的融合蛋白。
进一步，所述应用还包括步骤(6)目的蛋白鉴定：以获得的目的融合蛋白进行westernblot实验，用辣根酶标记的抗人IgG抗体与融合蛋白中的IgG-Fc部分结合显色表明目的蛋白的存在。
本发明的有益效果在于：
1.本发明构建的真核蛋白表达载体，不仅能插入外源基因表达蛋白，而且能执行翻译后修饰，维护蛋白天然结构；
2.本发明构建的真核蛋白表达载体，能获得极高的蛋白质表达水平，适合用于大规模蛋白制备；
3.本发明构建的真核蛋白表达载体，可同时表达标签蛋白IgG-Fc，此标签蛋白与所有生物公司所出售的载体标签不同，利用其可以对表达蛋白进行鉴定和纯化，且纯化蛋白所用的试剂蛋白A琼脂糖为实验室常备试剂，不需另行购买纯化蛋白相关试剂，以及鉴定所用试剂辣根酶标记的抗人IgG抗体，价格低廉，可摆脱对生物公司配套产品的依赖以及配套产品价格昂贵的困扰。
4.本发明构建的真核蛋白表达载体，可用于人体生物活性蛋白质与IgG-Fc段全人源融合功能蛋白的制备与研发。
附图说明：
图1为Invitrogen公司pcDNATM 3.3-TOPO载体图谱及基本信息；
图2为本发明所构建的真核蛋白表达载体图谱；
图3为本发明所构建的真核蛋白表达载体酶切位点图谱(利用限制性内切酶HindIII及BamHI可以插入外源基因进行表达)；
图4为PCR扩增获得human IgG1-Fc基因片段(788bp)；
图5为human IgG1-Fc基因插入pcDNTM3.3-TOPO载体之后酶切鉴定(即本发明构建的真核蛋白表达载体的鉴定)；
图6为PCR扩增获得目的蛋白4-1BB基因片段(580bp)；
图7为目的蛋白基因4-1BB(片段长度为580bp)及human IgG-Fc(片段长度为788bp)基因连接在一起的融合基因(约1368bp)表达质粒酶切鉴定；
图8为目的蛋白4-1BB与标签蛋白human IgG-Fc融合蛋白(50kDa)表达ECL结果。
具体实施方式
实施例1
本发明真核蛋白表达载体的构建，其步骤如下：
(1)设计扩增human IgG1-Fc引物，上游引物中加入HindIII及BamHI酶切位点，下游引物中加入EcoRI酶切位点。
(2)human IgG1-Fc基因扩增：2ml正常人外周血，用淋巴细胞分离液获取其中单个核细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA文库，利用设计好的引物，PCR扩增human IgG1-Fc。PCR反应体系如下：
(3)放入PCR仪中设定反应程序如下：95℃5分钟→【95℃30秒→58℃30|秒→72℃30秒】循环30次→72℃10分钟→4℃保存
(4)将human IgG1-Fc与pcDNA3.3TOPO载体(图1所示)连接，连接体系如下：
按照pcDNA3.3TOPO载体试剂盒中的方法将连接体系的6μl转化感受态细胞，第二天挑取克隆菌落在2ml含Ampicillin的LB培养基中扩增细菌，第三天提取菌液中的质粒，利用酶切鉴定的方法(图2)，选择已经插入了human IgG1-Fc的pcDNA3.3TOPO载体送公司测序，从中选择CMV forward引物测序human IgG1-Fc为正向的质粒，即为我们构建的真核蛋白表达载体质粒。
实施例2
利用本发明构建的表达载体表达并富集目的蛋白human 4-1BB
(1)设计表达目的蛋白human 4-1BB(GenBank U03397)的基因(1-558位碱基)的特异引物；上游引物中加入HindIII酶切位点，下游引物中加入BgLII酶切位点。
(2)无菌条件下，利用淋巴细胞分离液分离5ml人外周血中的单个核细胞，将分离的单个核细胞在体外用10％1640，并加入PHA刺激培养2天。收集刺激培养后的细胞，提取总RNA，逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，扩增目的片段，反应体系如下：
放入PCR仪中设定反应程序如下：95℃5分钟→【95℃30秒→58℃30秒→72℃30秒】循环30次→72℃10分钟→4℃保存。
(3)将获得的PCR产物连接T-easy载体(购买promega公司试剂盒)，连接体系如下：
连接体系放置22℃2小时，然后将连接体系中的5μl转化感受态细胞(DH5α)，第二天挑取单个克隆菌落，放到2ml含Ampicillin的LB中扩增培养，第三天提取菌液中的质粒，酶切鉴定，酶切体系为：
挑取目的基因已经插入T载体的质粒送公司测序，选择插入基因与GenBank中human4-1BB(U03397)基因序列完全一致的克隆，用来表达。
(4)用BamHI、BgLII及HindIII同时来酶切pcDNA3.3-IgG-Fc和T-4-1BB两种质粒，利用DNA凝胶回收试剂盒，回收前者切出的pcDNA3.3-IgG-Fc部分和后者切出的4-1BB部分，将两种回收获得的带有相同粘性末端的片段，连接，连接体系如下：
连接体系放置22℃2小时，然后将连接体系中的5μl转化感受态细胞(DH5α)，第二天挑取单个克隆菌落，放到2ml含Ampicillin的LB中扩增培养，第三天提取菌液中的质粒，酶切鉴定，酶切体系为：
切下的片段应为4-1BB及human IgG-Fc连接在一起的融合基因，挑选切下片段长度为580(4-1BB)+788(human IgG-Fc)左右的克隆进行下一步的蛋白表达。预测融合蛋白的大小为约为50kDa。
(5)cos-7细胞用10％DMEM培养于6孔细胞培养板，待细胞铺满底面积80％左右进行Lipofectin转染，无血清DMFM培养48小时后收集上清；2毫升上清中加入20μl蛋白A琼脂糖悬液，杂交炉中低温缓慢摇动混匀3小时，离心弃去上清，沉淀为蛋白A-蛋白复合物，洗两次沉淀，加入上样缓冲液，煮沸5分钟，取上清，获得融合蛋白。
实施例3
利用本发明构建的真核蛋白表达载体表达并富集的目的蛋白human 4-1BB的鉴定
以实施例2获得的蛋白，进行SDS-PAGE电泳及电转即western blot实验。取出硝酸纤维素膜，丽春红染色5分钟，清水冲洗至条带清晰，标记好蛋白marker，5％牛奶封闭，用辣根酶标记的抗人IgG抗体(1∶5000，购于中杉金桥生物技术公司)4℃孵育过夜，第二天进行ECL实验。实验结果如图8所示，融合蛋白中的IgG-Fc与辣根酶标记的抗人IgG抗体结合，显色，表明了目的蛋白的存在。
Claims (5)
1.一种真核蛋白表达载体，其特征在于：所述表达载体为在pcdna3.3TOPO表达载体的TOPO位点上插入Human IgG1-Fc基因，得到蛋白表达载体pcDNA3.3-I gG-Fc质粒。
2.按照权利要求1所述的真核蛋白表达载体的构建方法，其特征在于：包括步骤：(1)human IgG1-Fc基因扩增引物设计，(2)以逆转录得到的cDNA为模板，PCR扩增human IgG1-Fc基因，(3)将human IgG1-Fc PCR扩增产物与pcDNA3.3TOPO载体连接，从中选择CMV forward引物测序human IgG1-Fc为正向的pcDNA3.3-IgG-Fc质粒，得到所述真核蛋白表达载体。
3.按照权利要求1所述的真核蛋白表达载体在表达目的蛋白中的应用，其特征在于：其步骤包括(1)目的蛋白基因的特异引物设计，(2)以逆转录得到的cDNA为模板，以所设计引物进行PCR扩增，(3)目的蛋白基因的PCR扩增产物及pcDNA3.3-IgG-Fc用HindIII、BgLII及BamHI同时来酶切，连接具有相同粘性末端的pcDNA3.3-IgG-Fc部分和目的基因部分(4)目的蛋白富集：用所述目的蛋白基因插入pcDNA3.3-IgG-Fc构建的真核蛋白表达质粒通过Lipofectin转染cos-7细胞，培养上清中加入蛋白A琼脂糖悬液，杂交炉中低温缓慢摇动混匀2.5-3.5小时，离心弃去上清，沉淀为蛋白A-目的蛋白复合物，加入上样缓冲液煮沸3-6分钟，取上清获得含目的蛋白和标签蛋白的融合蛋白。
4.按照权利要求1所述的真核蛋白表达载体在表达目的蛋白中的应用，其特征在于：其步骤包括(1)目的蛋白基因的特异引物设计，(2)以逆转录得到的cDNA为模板，以所设计引物进行PCR扩增，(3)目的蛋白基因的PCR扩增产物连接于T-easy载体，(4)用BamHI、HindIII及BgLII同时来酶切所述pcDNA3.3-IgG-Fc和带目的蛋白基因的T-easy两种质 粒，连接具有相同粘性末端的pcDNA3.3-IgG-Fc部分和目的基因部分，(5)目的蛋白富集：用所述的pcDNA3.3-IgG-Fc-4-1BB表达质粒通过Lipofectin转染cos-7细胞，培养上清中加入蛋白A琼脂糖悬液，杂交炉中低温缓慢摇动混匀2.5-3.5小时，离心弃去上清，沉淀为蛋白A-目的蛋白复合物，加入上样缓冲液煮沸3-6分钟，取上清获得含目的蛋白和标签蛋白的融合蛋白。
5.按照权利要求3或4所述的真核蛋白表达载体在表达目的蛋白中的应用，其特征在于：还包括步骤(6)目的蛋白鉴定：以获得的目的融合蛋白进行western blot实验，用辣根酶标记的抗人IgG抗体与融合蛋白中的IgG-Fc部分结合显色表明目的蛋白的存在。
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