CN102666831A - 至少一种属于出芽短梗霉种的微生物作为水果发酵剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及至少一种属于出芽短梗霉种的微生物作为水果的发酵助剂的应用，其中所述微生物选自出芽短梗霉DSM 14940或DSM 14941。

Description

至少一种属于出芽短梗霉种的微生物作为水果发酵剂的应用

本发明涉及至少一种属于出芽短梗霉（Aureobasidiumpullulans）种的微生物的应用。

出芽短梗霉种的微生物属于酵母类真菌，其通常存在于土壤、盆栽土、植物部分、堆肥、废水、水果、水果产品中，存在于种子上，以及存在于各种建筑材料上。一方面，出芽短梗霉的单个菌株是能够降解任何类型植物纤维中的纤维素的可怕的材料破坏者，其甚至可损伤木头；然而，另一方面，其它的出芽短梗霉菌株是生物技术中重要的生物体。例如，所述出芽短梗霉菌株作为支链淀粉产生者，其被用作增稠剂和能量减少的食品的添加剂，以及如用作人造纤维生产的润滑剂。

最近，出芽短梗霉菌株还被用作酸性媒介中的喷雾剂而用于生产用来对抗细菌和/或真菌植物疾病（特别是对抗火疫病）的植物保护剂或植物强化剂，或者在所述植物保护剂或植物强化剂中使用。与传统的喷雾剂不同，使用这种基于可繁殖的真菌结构的喷雾剂有下列优势：在经其处理的水果或水果树中不再会检测到所述喷雾剂的毒性残留。特别地，使用基于抗生素的喷雾剂时产生形成抗性的问题，而使用真菌喷雾剂不惧怕这种问题，真菌喷雾剂因而提供了重要的优势。因此，使用基于出芽短梗霉的喷雾剂将不产生收获前使用喷雾剂的保护期，特别是不产生形成抗特定抗生素株的抗性。

除了基于特定出芽短梗霉菌株的、适于使核果对抗火疫病的喷雾剂外，最近还开发了在抵抗各种作物植物的灰霉病中有活性的喷雾剂，其中同样使用所选择的出芽短梗霉菌株来实现。其中，在开花之后、收获之前，用含有出芽短梗霉的喷雾剂喷洒所述植物或水果（例如番茄，葡萄，以及观赏植物）数次，从而将预防或减少灰霉菌病（特别是Rohfaeule）的产生，其对于未成熟的水果具有负面影响。应用基于出芽短梗霉的此类喷雾剂特别在水果生产中具有下列优势：在收获前不久也能够或可以对植物（特别是水果）进行喷洒，因为不存在应用化学喷雾剂时的保护期，这在潮湿的夏天将是特别的优势，因为潮湿有利于灰霉病的产生。

现在，令人惊讶地发现了，除了出芽短梗霉抵抗火疫病病原体和由葡萄孢菌引起的植物疾病的活性外，出芽短梗霉种的特定菌株针对植物或水果表面上存在的其它微生物是有活性的，特别地，其能够预防这些微生物对于由水果产生的酒精饮料的质量的负面影响，从而本发明的目的在于使用至少一种属于出芽短梗霉种的特殊微生物来生产用于水果的发酵助剂。

为了解决这一任务，根据本发明的应用，使用至少一种属于出芽短梗霉种的微生物作为发酵助剂，所述微生物选自出芽短梗霉DSM14940或出芽短梗霉DSM 14941。

为了通过发酵水果汁或水果糊而由水果生产酒精饮料，通常采用所谓的自发发酵，其中采用存在于水果中的酵母来发酵水果汁或水果糊中所含有的糖，其中此类自发发酵经常导致发酵失误或不完全的发酵，因为天然存在的酵母群体经常功效不足够强，以将糖完全转化为醇。此外，除了发酵过程中普遍的不利温度外，水果汁或水果糊中缺少酵母可利用的营养物质以及浑浊的颗粒也将导致对于酵母过大的应激，这同样可在自发发酵的过程中引起发酵失误或发酵抑制。

即使将培养的酵母加入发酵中，水果糊或水果汁的发酵也可停滞，特别地，进一步添加培养的酵母或酵母营养物盐或者提高发酵温度对于所获得的发酵产品（例如所获得的酒或果汁）的质量通常具有不利影响，从而要进行尝试使得尽可能快速和完全地实现发酵。

通过根据本发明的、出芽短梗霉菌株DSM 14941和DSM 14940作为水果的发酵助剂的应用，令人惊讶地罕见地，使得能够不仅总体上加速发酵，而且特别是当采用借助于直接存在于水果上的酵母菌株进行的自发发酵时，使得能够获得没有发酵失误或发酵中断的完全的彻底发酵。

特别地，如与本发明的进一步发展相应的，当使用出芽短梗霉菌株DSM 14940或DSM 14941来生产用于葡萄的发酵助剂时，将成功地生产出按照消费趋势的纯的、新鲜的和水果性的酒，并且特别是还能够安全、可靠以及完全（特别是快速）地彻底发酵由葡萄上存在的酵母菌株自发发酵而产生的风土葡萄酒，从而确定地防止发酵失误。

其中，如与本发明的进一步发展相应的，通过作为含水悬浮液应用到水果上或者直接引入水果糊中而利用所述微生物，通过应用包含出芽短梗霉菌株DSM 14940或DSM 14941的至少一种的含水悬浮液而在紧邻发酵之前成功地抑制干扰发酵的微生物，从而使水果糊或由所述水果糊产生的水果汁的发酵加速，特别是确保发酵充分且不停滞地进行。令人惊讶地，相对于用常规抗葡萄孢菌的试剂处理的葡萄，通过根据本发明的应用可实现发酵行为的显著改善。

其中，当根据本发明的应用以下列方式进行时，能够实现发酵结果的进一步改善，特别是能够进一步加速水果的发酵：在生产水果糊之前，至少两次向所述水果上应用所述含水悬浮液。在制备水果糊之前向水果上至少两次应用所述悬浮液（其与作为喷雾剂使用的悬浮液的不同在于不含酸性媒介）被证明是特别有利的，其中在收获水果之后可向可储存的水果上进行两次应用，或者当其所处理的是不可存储的或容易腐坏的水果（例如葡萄）时，也可在紧邻收获之前任选地向水果上应用一次所述含水悬浮液，从而确保将使得对于发酵有害的微生物变得无害。特别地，通过至少一种出芽短梗霉菌株的这种应用，成功地正面影响了水果汁（特别是葡萄酒）的发酵行为，其中特别是在自发发酵时可观察到快速和完全的彻底发酵。

其中，当根据本发明的应用以使所述微生物以5x10⁷CFU/l至5x10¹¹CFU/l、优选1x10⁹CFU/l至1x10¹⁰CFU/l的浓度被包含在含水悬浮液中的方式来进行时，除了实现发酵加速（特别是自发发酵）外，还实现了从水果糊或待发酵的水果的表面上完全去除干扰发酵的微生物，从而能够确定排除发酵失误或发酵抑制。此外，当在悬浮液中应用微生物出芽短梗霉DSM 14940或DSM 14941的根据本发明所用的浓度时，还确保了不发生对于水果果汁发酵的干扰以及不发生二级病原体对作物的感染，所述二级病原体为例如青霉属（Penicillium），曲霉菌属（Aspergiullus），酸腐，Trichothezium，分枝孢子菌属（Cladosporium）或链格孢属（Alternaria）。

其中，如与本发明的进一步发展相应的，其中当以下列方式应用所述微生物时，将实现进一步加速的发酵、特别是同时去除或分离不希望的有害物质：所述微生物固定地存在于惰性载体上，特别是膨润土、沸石或硅藻土、酵母或酵母细胞壁、奶粉、乳清粉、硫酸钾或碳酸钾。特别地，当例如应用固定地存在于酵母或酵母细胞壁上的所述微生物时，可通过有目的地挑选所使用的酵母来进一步加速或进一步支持所述发酵，从而特别地能够实现快速和完全的发酵，并且能够确定地避免搅扰所产生的酒精饮料的残留的糖。

其中，如与本发明的进一步发展相应的，以下列方式进行所述应用：以10:90至90:10的比例应用微生物出芽短梗霉DSM 14940和出芽短梗霉DSM 14941，在水果发酵的过程中利用彼此不同的出芽短梗霉菌株DSM 14940和DSM 14941两者的积极作用，其中取决于水果上或糊状物中所含有的干扰性微生物而任意调节所述两种出芽短梗霉菌株相对于彼此的比例。特别地，当发酵容易被葡萄孢菌侵害的水果（例如葡萄、覆盆子、草莓和黑莓）时，为了防止二级病原体的感染，基于所述水果对于变质和葡萄孢属侵害的敏感性，证实了下述对于此类水果是有益的：在收获之前就已经用包含出芽短梗霉菌株DSM 14940和DSM 14941的悬浮液进行至少一次喷洒，从而为出芽短梗霉菌株提供足够的时间来与有害的病原体竞争营养和生存空间，从而当收获植物时，干扰性微生物或害虫的含量就已经显著减少了。在紧接着收获之后或者在用所使用的微生物接种所述糊状物时进行另外的喷洒进一步减少了有害物质的含量，从而使得随后的发酵（特别是水果自发发酵）能够完全且快速地进行。

特别地，为了用在其表面上包含少数促进发酵的酵母的水果（例如苹果和梨）来实现完全且可靠的发酵，以下述方式进行根据本发明的应用：向所述发酵助剂中额外添加基于微生物总重5％至95%的天然存在的酿酒酵母菌株。

下面，将通过附图中所阐释的实施方式示例来更详细地解释本发明，其中:

图1是显示维尔施丽斯林（Welschriesling）葡萄的发酵的图谱，其中在一种情形中,使经过抗葡萄孢菌处理的葡萄经历普通的自发发酵；在另一种情形中，使用50:50比例的出芽短梗霉DSM 14940和出芽短梗霉DSM 14941处理的相同的维尔施丽斯林葡萄的糊状物经历自发发酵;

图2显示了霞多丽（Chardonnay）葡萄的缓慢自发发酵，其中描绘了未处理的对照与用70:30比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941的混合物处理的配料的比较;

图3显示了添加了培养的酵母的白比诺葡萄的发酵，其中将未处理的对照与使用20:80比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941处理的配料以及经抗葡萄孢菌喷洒的配料进行了比较;

图4显示了卡本内苏维翁（Carbernet Sauvignon）葡萄汁的缓慢自发发酵，其中显示了收获前经抗葡萄孢菌处理的葡萄的果汁配料与通过加入55:45比例的出芽短梗霉DSM 14940和出芽短梗霉DSM 14941而处理的配料的比较;

图5显示了添加了培养的酵母的、含有梅乐（Merlot）葡萄的糊状物的发酵，其中有经抗葡萄孢菌处理的配料和使用10:90比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941处理的配料;和

图6显示了含有Blauburger葡萄的糊状物的自发发酵，其中显示了经抗葡萄孢菌处理的配料和添加了50:50比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941的配料。

此外，对于苹果汁的果汁发酵进行了比较测试，其中在一个情形中使用了未处理的苹果汁，在另一个情形中使用了这样的苹果汁：其中的苹果在紧接着收获后经含有出芽短梗霉DSM 14940的悬浮液处理。

在图1中，将发酵的天数标绘在横坐标上而将发酵过程中葡萄汁重量的减少(°Oe,奥斯勒度)显示在纵坐标上。由图1的图示能够明显看出，当使用经抗葡萄孢菌处理的葡萄时，虽然添加了培养的酵母，发酵自开始时缓慢地进行并且在发酵的第13天时仍未完全完成，从而特别地，将期待由这种发酵产生的葡萄酒具有覆盖缺陷的甜味，这将被消费者感受为缺点或认识为是缺陷，特别是在新鲜和水果性的新(young)白葡萄酒的情形中，如对于维尔施丽斯林所普遍描述的。

与此相对地，当使用以50:50比例的出芽短梗霉DSM 14940和出芽短梗霉DSM 14941处理的葡萄时（即特别地，两次喷洒中的一次是在收获前若干天或紧邻收获之前、以及在制备糊状物之后不向所述糊状物中添加培养的酵母时，用基本上中性的、出芽短梗霉菌株DSM14941和DSM 14940的悬浮液进行的），可观察到葡萄汁重量显著更快的减少，且此外，发酵在第11天之后就已经完全了，从而通过此种发酵方法产生的维尔施丽斯林将不具有覆盖缺陷的残留甜味，也不被不完全地发酵。

图2显示了霞多丽葡萄在14℃时的缓慢自发发酵，其中描绘了未处理的对照与使用以70:30的比例被加入待发酵果汁中的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941的配料的比较。

从此图中将清楚地得出（特别是在未处理的对照的自发发酵中），发酵一方面仅缓慢地开始进行并且特别地在9-13天期间被完全抑制了，从而恐怕要形成葡萄酒缺陷，特别是不希望的发酵副产物。在第13天时，通过添加酵母和营养物盐而使发酵再次进行，并随后快速进行直到葡萄汁的缓慢、完全的彻底发酵。

经出芽短梗霉处理的霞多丽葡萄还在第7天至第11天之间的时间段中显示出发酵曲线的变平，然而，其中没有进一步接种培养的酵母或没有添加营养素盐而使所述发酵自主继续，且从第14天起，其以与未处理的对照的发酵几乎相同的方式进行。由此结果可清楚地看出，特别是在自发发酵中，添加出芽短梗霉DSM 14941或DSM 14940确保了自发发酵可靠地继续进行而不停止或不发生任何抑制。

图3显示了添加培养的酵母后，白比诺葡萄的快速发酵，其中清楚可见的是，未处理的对照以及经抗葡萄孢菌处理的白比诺葡萄配料近似相同地快速发酵。在第5-9天期间，发生相对快速的发酵，在第9-12天之间发酵曲线变平，而随后从第12天起仅继续缓慢地进行直至从第22天开始达到完全的发酵。

与此相对地，在第一个5天中，用20:80比例的出芽短梗霉菌株DSM 14940和DSM 14941处理的白比诺葡萄与其它两组葡萄近乎同步地发酵。从第5天起，观察到发酵曲线的陡降直至第9天，这相应于葡萄汁的快速彻底发酵，然后出现所述发酵曲线的强烈变平直至第13天，从第13天起能够认为所述葡萄经完全彻底发酵了。

从所述比较清楚地显示出了通过加入出芽短梗霉DSM 14940或DSM 14941而处理的白比诺葡萄彻底发酵得显著更快，从而特别是将期待不含发酵缺陷的精干白葡萄酒。

图4显示了含有卡本内苏维翁葡萄的糊状物的缓慢自发发酵，其中在前10天中，发酵直接在糊状物中发生，而随后使经挤出的红葡萄汁最终发酵。从图中可清楚地看出，在含有经抗葡萄孢菌处理的卡本内苏维翁葡萄的糊状物配料的自发发酵中，所述自发发酵在第6天左右开始进行，然后相对快地进行直至第13天，然后仅继续发生缓慢的残余发酵。

对于含有在紧邻收获前用55:45比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941处理的卡本内苏维翁葡萄的糊状物，所显示的是自发发酵在第3天就已经开始了，其在第4-10天非常快速地进行并且随后仅继续缓慢地进行直至达到最终的发酵。通过挤出红葡萄汁既没有中断经抗葡萄孢菌处理的配料的发酵，也没有中断经55:45比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941处理的配料的发酵。

然而，总体而言，可清楚地看出，含有经出芽短梗霉处理的葡萄的糊状物的自发发酵快速地开始并且没有中断地继续进行直至糊状物或挤出的红葡萄汁完全发酵。

在图5中，显示了含有梅乐葡萄的糊状物的快速发酵，其中直接在糊状物中进行总的发酵并且在发酵结束后才挤出葡萄汁。两种糊状物配料的发酵都是加入培养的酵母而发生的，其中清楚可见的是，经抗葡萄孢菌处理的配料在第3天开始发酵并且发酵快速进行直至第7天，然后发酵曲线在第7-12天强烈变平。

与此相对地，梅乐葡萄的糊状物（其含有在收获之前用10:90比例的出芽短梗霉菌株DSM 14940和DSM 14941处理的葡萄）略微更快地发酵，其中发酵特别是在第二天就已经开始了并且在第3-5天之间非常快速地进行，然后发酵曲线在第5-7天间缓慢地变平以随后与经抗葡萄孢属处理的配料的发酵曲线近乎相同。在大约第11天，可认为所述糊状物被完全彻底发酵。

由这种比较显示出，在收获前用出芽短梗霉处理的梅乐葡萄的糊状物的发酵明显更快地开始，并且特别地，更快地彻底发酵，从而将期待没有任何发酵缺陷的红葡萄酒。

图6显示了含有Blauburger葡萄的糊状物的自发发酵，其中一种配料是在收获前经传统抗葡萄孢菌试剂处理的葡萄，且第二种配料是在收获前经50:50比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941处理的葡萄。

由这两个曲线的比较显示出，其中使用了经抗葡萄孢菌处理的葡萄的糊状物的自发发酵直至第6天都没有开始进行，然后将所述糊状物加热至约45℃从而一方面从红葡萄中溶解色素，而另一方面使发酵开始进行。加热糊状物和压榨之后，发酵自发开始进行并且到第12天时葡萄汁完全彻底发酵。

第二糊状物配料（其含有在收获前用50:50比例的出芽短梗霉DSM14940和DSM 14941处理的Blauburger葡萄）显示出，自发发酵在第3天自主地开始进行，非常快地进行直至第7天，然后发酵曲线变平并在第12天与以传统方式经抗葡萄孢菌处理的葡萄的配料的发酵曲线相同。

从所述发酵曲线可清楚地看出，由于以传统方式经抗葡萄孢菌处理的葡萄的糊状物的发酵抑制，在所产生的葡萄酒中将预期有发酵缺陷，此外，所述自发发酵仅能通过加热所述糊状物而开始，从而恐怕要进一步降低所产生的红葡萄酒的质量。与此相反，含有在收获前经50:50比例的出芽短梗霉DSM 14940和DSM 14941处理的Blauburger葡萄的糊状物的自发发酵均匀且快速地进行而没有中断，从而期待精红葡萄酒，其特别地不具有任何发酵缺陷。

比较测试

苹果汁的果汁发酵

将未处理的苹果汁与纯培养的酵母一起使用，以产生苹果酒或苹果汁，其中发酵在6天内完全完成并且产生了酒精含量为约7%的苹果酒。为了进一步储存产品，必须快速地去除酵母以防止由于苹果酒的低酒精含量而产生的微生物引起的酒缺陷、特别是不希望的微生物生长的危险。

在收获前用出芽短梗霉DSM 14940悬浮液处理第二种苹果汁配料一次，而向水果糊中加入一次另一配料的出芽短梗霉DSM 14940。进一步的发酵与第一配料的苹果汁类似地进行，且发酵速度比第一组稍快。

然而，令人惊讶地显示了，与对比的酒相比，所产生的苹果酒显著更稳定，特别是，其对于微生物产生的酒缺陷和能够导致酒腐败的不希望的微生物生长的易感性显著降低，特别是也不必须那么快地去除酵母。

Claims (8)

1.至少一种属于出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）种的微生物作为水果发酵助剂的应用，所述微生物选自出芽短梗霉DSM14940或出芽短梗霉DSM 14941。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述水果为葡萄。

3.根据权利要求1或2的应用，其特征在于，所述微生物作为含水悬浮液被应用至所述水果上，或者所述微生物被直接引入水果糊中。

4.根据权利要求3的应用，其特征在于,在生产水果糊之前，至少两次将所述含水悬浮液应用至所述水果上。

5.根据权利要求1至4中任一项的应用，其特征在于，所述微生物以5x10⁷CFU/l至5x10¹¹CFU/l，优选1x10⁹CFU/l至1x10¹⁰CFU/l的浓度被包含在所述含水悬浮液中。

6.根据权利要求1或2的应用，其特征在于，所述微生物固定地存在于惰性载体上，特别是膨润土，沸石或硅藻土，酵母或酵母细胞壁，奶粉，乳清粉，硫酸钾或碳酸钾。

7.根据权利要求1至4中任一项的应用，其特征在于，以10:90至90:10的比例使用所述微生物出芽短梗霉DSM 14940和出芽短梗霉DSM 14941。

8.根据权利要求1至4中任一项的应用，其特征在于，向所述发酵助剂中另外添加基于微生物的总量5％至95%的天然存在的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株。

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