CN102653753A - 一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，属于环糊精技术领域。本发明将环糊精与大豆脂肪氧合酶分子的疏水性氨基酸发生络合作用，从而改变脂肪氧合酶的活性构象，抑制脂肪氧合酶的活性，抑制率可达86.26%。本发明涉及方法简单易行、节约能源，成本低，工作环境和卫生环境好，无污染，利用此方法可简化大豆及其制品脱腥工艺。
Description
技术领域
一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，涉及环糊精在豆制品除腥中的应用，属于环糊精技术领域。
背景技术
大豆食品中往往具有不同程度的豆腥味，这使许多人难以接受，从而限制了大豆食品的发展和广泛食用，因此大豆脱腥也成为大豆制品开发利用的关键技术，寻找一种适宜的脱腥方法迫在眉睫。大豆的豆腥味主要由脂肪氧合酶（LOX）催化氧化不饱和脂肪酸所致（蔡琨，方云，夏咏梅等.大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究）。大豆中蛋白含量为40%左右，脂肪氧合酶是大豆中活性最高的酶。成熟的大豆种子中，脂肪氧合酶的活性很高，约占大豆种子蛋白含量的1%~2%。它催化多不饱和脂肪酸的氧化，产生氢过氧化合物，这些氧化产物导致油脂和含油食品在贮藏和加工过程中的色、香、味发生劣变，如大豆及其制品的豆腥味等。因此，抑制大豆中脂肪氧合酶活性是祛除豆腥味的关键。
食品加工过程中消除大豆种子脂肪氧化酶活性、除去豆腥味的手段主要有加热处理、微波照射、改变介质的pH、有机溶剂萃取和通过醛水解酶水解等。但这些方法都不同程度地会增加大豆产品的成本，且常常会导致大豆蛋白质溶解度下降，降低食品的营养价值，使一些风味、色泽、维生素和营养成分受到很大损失。理想的脱腥方法是在最大限度脱除豆腥味的同时，不降低蛋白质的得率及产品质量。从而根本上改善了大豆食品的风味。而环糊精分子结构独特，立体中空环状构造赋予了它独特的功效，外壁较强的亲水性和内腔较强的疏水性使其可以与许多无机与有机化合物形成具有不同程度稳定性的包合物或复合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，本发明方法抑制脂肪氧合酶的效率高，操作简便，安全卫生。
本发明的技术方案：一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，大豆中蛋白含量为40%，脂肪氧合酶是大豆中活性最高的酶，成熟的大豆种子中，脂肪氧合酶的活性占大豆种子蛋白含量的1%~2%；利用环糊精的立体中空环状构造与大豆脂肪氧合酶（EC 1.13.11.12）分子发生络合，从而抑制酶活性。
所述环糊精抑制脂肪氧合酶活性的方法，使用的抑制剂为β-环糊精。
所述环糊精抑制脂肪氧合酶活性的方法，在脂肪氧合酶催化氧化亚油酸的3mL反应体系中，亚油酸的浓度为10mmol/L，添加量为60μL，脂肪氧合酶的浓度为0.238mg/mL，添加量为500μL，β-环糊精的浓度为10mmol/L，添加量为1mL，其余为0.1M pH9.0硼砂-硼酸缓冲液。
本发明的有益效果：本发明方法脂肪氧合酶灭活效率高，抑制率可达86.26%，操作简单易行、节约能源，成本低，环境卫生且无污染。本方法首先可为环糊精与大分子物质形成的超分子体系的研究提供参考；其次，对开发低豆腥味大豆制品进行工艺操作选择时具有参考作用，开发控制腥味、异味的关键技术，从而得到工艺简单、品质优良、货架期长的大豆制品。
附图说明
图1 添加与不添加β-环糊精的条件下对脂肪氧合酶活性的影响效果对比。
图2 添加不同浓度的β-环糊精对脂肪氧合酶的抑制效果影响。
具体实施方式
实施例1 一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，包括以下步骤：
（1）硼砂-硼酸缓冲溶液的制备
硼砂-硼酸缓冲溶液（0.1M，pH9.0）：称取15.265g Na2B4O7·10H2O和2.474g H3BO3 用蒸馏水定容至1.0L得到0.1M pH9.0的硼砂-硼酸缓冲溶液；
（2）底物的配制
将1.3mL吐温-20分散于20mL 上述配制好的pH9.0、0.1 M的硼砂-硼酸缓冲溶液中，摇动下逐滴加入1.5mL亚油酸（LA），充分混匀，使LA以微细的乳状体分散在溶液中，接着加入11mL 0.5M NaOH溶液，摇动使其成为清澈透明的溶液。用0.1M HCl调pH到9.0，最后用上述配制好的硼砂-硼酸缓冲溶液定容至100mL。此时LA的浓度为50mmol/L。
准确移取10mL 50mmol/L 的LA溶液，用0.1M pH9.0 的硼砂-硼酸缓冲溶液定容至50mL，得到10 mmol/L的亚油酸溶液。
将上述配制好的亚油酸溶液放置于4℃冰箱中，待用。
（3）环糊精（β-CD）的配制
β-CD：称取0.1135g、0.1702g、0.341g、0.5107g、0.681g、0.8512g、1.135g、1.362g β-CD，用超纯水溶解，并定容至100mL，分别得到1 mmol/L、1.5 mmol/L、3 mmol/L、4.5 mmol/L、6 mmol/L、7.5mmol/L、10mmol/L、12 mmol/L的β-CD溶液，待用；
（4）大豆脂肪氧合酶（LOX-1）的配制
准确称取0.238g大豆脂肪氧合酶，用0.1M pH9.0硼砂-硼酸缓冲溶液溶解，并定容至100mL。移取10mL上述溶液，用上述配制好的硼砂-硼酸缓冲溶液定容至100mL，此时酶的浓度为0.238mg/mL（1wU/mL）。
配制好的溶液放置在4℃冰箱内，待用。
（5）添加环糊精组：取500μL上述酶液（0.238 mg/mL）于试管中，加入1.44 mL硼砂-硼酸缓冲液。然后加入1mL环糊精溶液，充分混匀，反应1h后再加入60μL亚油酸溶液（10 mmol/L），混匀，使体系总体积为3mL，4min后加入5mL无水乙醇终止反应，于234nm处测吸光度。
无环糊精组：取500μL上述酶液（0.238 mg/mL）于试管中，加入2.44 mL缓冲液，然后加入60μL亚油酸溶液（10 mmol/L），充分混匀，4min后加入5mL无水乙醇终止反应，于234nm处测吸光度。
空白组：取500μL酶液（0.238 mg/mL）于试管中，先加入5mL无水乙醇，再加入1mL β-环糊精，混匀、静置1h，然后加入60μL亚油酸和2.44mL缓冲液，25℃下放置4min后终止反应。
酶活测定做三次重复。得到添加与不添加β-环糊精的条件下对脂肪氧合酶活性的影响效果，先加β-环糊精和酶作用一段时间后再加底物的抑制率最大，高达86.26%，如图1所示。
（6）取500μL上述酶液（0.238 mg/mL）于试管中，加入1.44 mL上述配制好的硼砂-硼酸缓冲溶液。然后加入环糊精溶液（1 mmol/L、1.5 mmol/L、3 mmol/L、4.5 mmol/L、6 mmol/L、7.5mmol/L、10mmol/L、12 mmol/L）各1mL，混匀静置1h，然后加入pH9.0、0.1mol/L的硼砂-硼酸缓冲液1.44mL，加入10mmol/L的亚油酸60μL，充分混匀，4min后加入5mL无水乙醇终止反应，测定反应液在234nm处的吸光度。空白样先添加5mL无水乙醇，然后加入亚油酸，其余操作相同。酶活测定做三次重复。得到添加不同浓度的环糊精对大豆脂肪氧合酶的抑制效果影响，如图2所示，当添加的环糊精为10 mmol/L时，对大豆脂肪氧合酶的抑制率达到最高值，之后趋于平稳，可见最适环糊精浓度为10 mmol/L。
实施例2
一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，用于10mM的α-环糊精或者γ-环糊精1mL代替β-环糊精添加到脂肪氧合酶催化氧化亚油酸的3mL反应体系中。其余同实施例1，其也能起到抑制大豆脂肪氧合酶的活性。
实施例3 用本发明方法制备豆乳产品，去豆腥味
称取50g大豆，加入400mL的自来水浸泡（浸泡水温28℃，浸泡时间6.5h），按照豆水质量比1:8进行冷水磨浆，按0.5%-2.5%（以大豆重为基准）的比例添加β-环糊精，同时搅拌，使得环糊精快速均匀地分散到豆乳中，然后杀菌装瓶。
工艺流程为：大豆筛选、清选、浸泡、磨浆、滤浆、加入环糊精、调制、杀菌、瓶装得成品。
具体步骤如下：
1、大豆的选择：选择粒度均匀一致，表皮完好无杂质的优质大豆作为原料。
2、大豆的清洗浸泡：用自来水清洗3遍以清除灰尘等杂物，加入8倍于大豆质量的自来水浸泡（浸泡水温28℃，浸泡时间6.5h）。
3、按照豆水质量比1︰8进行冷水磨浆。
4、添加β-环糊精：添加0.5%-2.5%（以大豆为基准）的β-环糊精，边加边搅拌。
5、杀菌：在120℃条件下杀菌15min。
所述大豆脂肪氧合酶（75,000,000Unit），购于Sigma Aldrich。
Claims (3)
1.一种环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，大豆中蛋白含量为40%，脂肪氧合酶是大豆中活性最高的酶，成熟的大豆种子中，脂肪氧合酶的活性占大豆种子蛋白含量的1%~2%；其特征在于：利用环糊精的立体中空环状构造与大豆脂肪氧合酶（EC 1.13.11.12）分子发生络合，从而抑制酶活性。
2.根据权利要求1所述环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于使用的抑制剂为β-环糊精。
3.根据权利要求1所述环糊精抑制大豆脂肪氧合酶活性的方法，其特征在于：在脂肪氧合酶催化氧化亚油酸的3mL反应体系中，亚油酸的浓度为10mmol/L，添加量为60μL，脂肪氧合酶的浓度为0.238mg/mL，添加量为500μL，β-环糊精的浓度为10mmol/L，添加量为1mL，其余为0.1M pH9.0硼砂-硼酸缓冲液。
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2012
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