CN102648283A

CN102648283A - 植物中有害动物的防治

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Publication number: CN102648283A
Application number: CN2010800539799A
Authority: CN
Inventors: 叶健; 蔡南海; 曲景; S-Q·高
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-09-15
Also published as: US20120240288A1; SG179075A1; EP2730657A1; AU2010301171B2; US10017774B2; CN102648283B; WO2011040880A1; EP2730657B1; AU2010301171A1; EP2483410A4; EP2483410A1

Abstract

本发明涉及使用在宿主中表达有害动物基因的病毒来防治有害动物(诸如昆虫)的领域。更具体地，本发明涉及一种快速筛选有害动物基因的方法，当有害动物摄入表达与病毒连接的有害动物基因序列的宿主组织时，所述有害动物基因可以导致有害动物死亡。本发明还涉及一种防治有害动物的方法，通过靶标有害动物序列的病毒表达来改变有害动物基因在有害动物细胞或组织中的内源表达。

Description

植物中有害动物的防治

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年9月29日提交的美国临时专利申请系列号61/246,597的优先权，该申请援引加入本文。

序列提交

本申请连同电子形式的序列表一起提交。所述序列表称为2577_197PCT_Sequence_Listing.txt，在2010年8月25日创建。电子形式序列表的信息属于本申请，并以其整体援引加入本文。

发明背景

本发明涉及使用病毒在宿主中表达有害动物基因来防治有害动物(诸如昆虫)的领域。更具体地，本发明涉及一种快速筛选有害动物基因的方法，当有害动物摄入表达与病毒连接的有害动物基因序列的宿主组织时，所述有害动物基因可以导致有害动物死亡。本发明还涉及一种防治有害动物的方法，通过靶标有害动物序列的病毒表达来改变有害动物基因在有害动物细胞或组织中的内源表达。

用于说明本发明背景或提供有关实施的补充细节的出版物和其他材料援引加入本文，为了方便起见在文献目录中分别分组。

地球上充满了各种各样的有害动物问题，已经使用大量方法来试图防治这些有害动物造成的侵袭。用于防治微观有害动物诸如细菌、真菌和病毒的侵袭的组合物已经采用抗生素组合物，抗病毒组合物和抗真菌组合物的形式来提供。用于防治较大的有害动物诸如线虫、扁虫、蛔虫、蛲虫、恶丝虫、绦虫、锥体虫、血吸虫等侵袭的组合物通常采用化学组合物的形式，其可施用于已知有害动物将侵袭的基质表面，或以丸剂、粉末、片剂、糊剂或胶囊等的形式被侵袭动物所摄入。

经济作物经常是昆虫攻击的靶标。化学农药在清除有害动物侵袭方面已经非常有效。但是，众所周知使用化学杀虫剂存在数种缺点。首先，化学杀虫剂不是选择性的，因此，在防治靶标昆虫的同时，因为缺乏选择性，它们还对非靶标动物区系(fauna)起作用，经常在一段时间内有效的使施用杀虫剂的区域成为不毛之地。其次，化学杀虫剂残留在环境中，代谢(即使有的话)通常是缓慢的。它们在食物链中聚积，最终聚积在高等食肉动物物种(诸如人类)中，其中这些杀虫剂充当诱变剂和/或致癌物，导致不可逆的和有害的遗传改变。这种聚积引起更高等食肉动物的抗虫性。因此长期以来需要对环境无害的用于防治或清除对植物的有害动物侵袭或植物中有害动物侵袭的方法，即所述方法是选择性的、环境嵌入物、不稳定的、并且是可生物降解的，并且很好的适应抗虫控制方案。这些环境安全的安全组合物，包括苏云金杆菌(Bt)细菌以及表达一种或更多种编码杀虫Bt蛋白的基因的转基因植物，在防治虫害侵袭方面是非常有效的。但是，随着Bt作物(诸如玉米和棉花)应用的增加，带来了靶标有害动物可能发展出对这些毒素的抗性的威胁。尽管在野外还没有观察到Bt抗性有害动物群体，但通过用毒素浸渗的食物进行筛选已经在实验室中发展出抗性品系(McGaughy,1985)。因此，除了在延缓Bt抗性发展方面进行努力，非常重要的是发现防治有害动物侵袭的不同作用方式(通过单独使用或与Bt表达策略联合使用)。

双链RNA(dsRNA)介导的对真核生物特异性基因的抑制，先前已经被用于沉默基因和研究少数昆虫诸如鞘翅类的昆虫赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)中的基因功能(Bucher et al.,2002)。正常输送dsRNA以介导dsRNA参与的遗传控制包括产生转基因昆虫(其表达双链RNA分子)或将dsRNA溶液注射入昆虫体内或在胚胎发育之前或胚胎发育期间注射入卵囊内。普遍认为这种在昆虫中转基因表达以防治农田作物中昆虫的方法无法在大多数无脊椎有害动物种类的食物中提供dsRNA分子或将包含dsRNA的组合物注射入无脊椎有害动物体内。最近，使用转基因植物来产生dsRNA的方法显示，转基因表达的dsRNA可以增强对经济上重要的农业有害动物棉铃虫(Helicoverpa armigera;Lepidoptera)和玉米根萤叶甲(WCR;Diabroticavirgifera virgifera LeConte;Coleoptera)(Baum et al.,2007;Mao et al.,2007;美国公开的专利申请号2006/0021087)的抗性。这些参考文献已经证明使用dsRNA在保护作物抵抗有害动物侵袭方面的可能性。这种方法在未来大有希望，因为它允许利用各种各样的潜在靶标来抑制昆虫的基因表达。但是，此刻，这些鉴定的基因仍然未能像改造的转基因玉蜀黍一样有效的产生改造的Cry3Bb苏云金杆菌(Bt)毒素。

因此，与Bt转基因植物技术竞争甚至取代其的关键是鉴定出一种或更多种合适的昆虫基因，在每种农业上重要的有害动物巨大基因数目的情况下(例如，对于模型甲虫和有害动物赤拟谷盗来说是16,404种基因)按照特异性的植物-昆虫配对体内施用表达的dsRNA。过去，鉴定这些候选基因的一项重要技术是植物的稳定转化。但是，一些重要作物诸如棉花中转基因植物的低效产生限制了大规模的基因鉴定。此外，这类方法是费力、昂贵、耗费时间的，不适合于基因组规模的高通量分析。

早在1928年就首次发现植物中的RNA沉默造成病毒抗性(Wingard,1928)。Wingard描述了感染烟草环斑病毒的烟叶。上层叶子变得对病毒有免疫性，所以没有症状，并且耐受二次感染(Wingard,1928)。因此在世界各地，用温和株预处理作物后，交叉保护被广泛用于人工干预严重的病毒株感染(Prins等,2008)。通过交叉保护防治病害的良好实例分别成功用于柑橘腐根病和大麦黄矮病(Prins等,2008)。

用RNA和DNA病毒感染植物产生病毒相关的小干扰RNA(siRNA)。dsRNA，来源于一些单链病毒RNA区的复制中间物或二级结构特征，在感染病毒的植物细胞中可以聚积到较高水平。就植物DNA病毒而言，dsRNA可以由重叠互补转录物的退火而形成(Baulcombe,2004)。用于植物基因的病毒诱导的基因沉默(VIGS)(Ruiz等,1998;Burch-Smith等,2004)提供了一种有吸引力的替代方式，因为在植物基因功能分析中它无需植物转化就能研究基因功能。可以构建载有插入的候选基因部分序列的重组病毒。这类重组病毒可以在植物中全身移动，产生包括候选基因的插入片段的dsRNA(进一步siRNA)，其介导内源基因转录物的降解(Brigneti等,2004;Burch-Smith等,2004)，导致候选基因表达在接种植物中的沉默。取决于植物种属，通常在病毒感染后1-2周测定对内源基因表达的影响。VIGS可以以快速和高通量的方式用做基因/基因家族敲低(knock-down)的有效可逆遗传工具(Nasir等,2005)。因为敲低表型是瞬时和可逆的，这种方法可用于评价其缺陷可以引起胚胎死亡的基因的功能(Burch-Smith等,2004)。利用不同的注射法，已经证明VIGS在不同的器官中起作用，诸如叶子(Liu等,2002;Burch-Smith等,2006)，根(Valentine等,2004;Bhattarai等,2007)，花(Liu等,2004;Chen等,2005)，甚至果实(Fu等,2005)。

VIGS系统已经成功用于测定植物中的基因功能，诸如烟草(Ratcliff等,2001)、胡椒(Chung等,2004)、番茄(Liu等,2002)、麻风树属(美国临时专利申请号61/143,484)、棉花(美国临时专利申请号61/185,631)和罂粟(Hileman等,2005)中的烟草脆裂病毒；烟草(Hiriart等,2003)和胡椒(Kim等,2007)中的烟草花叶病毒；烟草(Saitoh and Terauchi,2002)和马铃薯(Faivre-Rampant等,2004)中的马铃薯X病毒(PVX)；稻米，大麦和玉蜀黍中的雀麦花叶病毒(BMV)(Ding等,2006)；大麦和小麦中的大麦条纹花叶病毒(BSMV)(Holzberg等,2002)；大豆中的黄瓜花叶病毒(Nagamatsu等,2007)；烟草，番茄和大豆中的苹果潜隐球状病毒(Igarashi等,2009;Yamagishi andYoshikawa,2009)；大豆中的豆荚斑点病毒(Zhang and Ghabrial,2006)；豌豆(Constantin等,2008)，蒺藜状苜蓿和香豌豆中的豌豆早枯病毒(

等,2008)；植物DNA病毒诸如甜菜曲顶病病毒(Golenberg等,2009)和番茄黄化曲叶病毒(Huang等,2009)。全面综述请参见Unver和Budak(2009)。

因此，希望提供用于防治有害动物侵袭的替代性和选择性的方式。还希望开发一种用于在基因组规模瞬时和高通量对有害动物基因进行功能分析的方法，以鉴定作为有害动物防治靶标的有害动物基因。本发明提供一种用于鉴定靶标有害动物基因的方法，还提供用于防治有害动物侵袭的替代性和选择性的方式。

发明概述

因此在第一个方面，本发明提供一种筛选有害动物基因的方法，以鉴定当所述有害动物基因的表达在有害动物中被沉默时可以导致有害动物死亡的有害动物基因。根据这个方面，所述方法包括∶

(a)将包含待筛选有害动物基因序列的核酸插入病毒的病毒诱导基因沉默(VIGS)载体以产生改造的VIGS载体，所述病毒可以感染所需宿主；

(b)用改造的VIGS载体接种宿主以产生被感染的宿主；

(c)在所述改造的VIGS载体被复制的条件下培养被感染的宿主以产生RNA，所述RNA在宿主组织中聚积；

(d)给有害动物饲喂具有RNA的宿主组织；和

(e)确定RNA对有害动物是否有毒性，

其中有害动物毒性鉴定出所述有害动物基因为当该有害动物基因的表达在有害动物中被沉默时导致有害动物死亡的有害动物基因。

在一个实施方案中，有害动物是昆虫。在另一个实施方案中，宿主是植物。在另外一个实施方案中，VIGS载体来源于可以感染所需宿主(诸如植物)的病毒。在一些实施方案中，改造的VIGS载体包含含有所述核酸的单一载体。在其他实施方案中，VIGS载体包括两种载体，其中一种被改造以包括所述核酸。在一些实施方式中，病毒是DNA病毒。在其他实施方案中，病毒是RNA病毒。在一个实施方案中，通过用病毒颗粒接种来用改造的VIGS载体接种宿主，诸如植物。在另一个实施方案中，通过农杆菌渗入来接种宿主，诸如通过注射器渗入或真空渗入或土壤浸润(agro-drench)或其他接种方法来产生病毒颗粒，利用农杆菌感染作为中间步骤。在另外的实施方案中，通过粒子轰击来接种宿主。在其他的实施方案中，通过载体传播(transmission)来接种宿主，诸如通过细菌、真菌、线虫、节肢动物和蜘蛛。在另一个实施方案中，通过机械传播或传播的其它自然方法来接种宿主。

在一个实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方案中，RNA是小干扰RNA(siRNA)，其可以是短发夹RNA(shRNA)的形式。在另外的实施方案中，RNA是单链RNA(ssRNA)。可以如本文所述在宿主中从改造的VIGS载体制备RNA。

在另一个方面，本发明提供一种防治有害动物的方法，通过靶标有害动物序列在宿主中的病毒表达以改变有害动物基因在有害动物细胞或组织中的内源表达。根据这个方面，所述方法包括∶

(a)将包含待沉默的所需有害动物基因序列的核酸以有义或反义方向或作为反向重复序列而插入病毒的病毒诱导基因沉默(VIGS)载体以产生改造的VIGS载体，所述病毒可以感染所需宿主；

(b)用改造的VIGS载体接种宿主以产生被感染的宿主；和

(c)在所述改造的VIGS载体被复制的条件下培养受感染宿主以产生RNA，所述RNA在宿主的组织中聚积，

其中在宿主中产生的RNA被摄入时所述RNA引起有害动物中的基因沉默，由此防治有害动物。

在一个实施方案中，有害动物是昆虫。在另一个实施方案中，宿主是植物。在另外的实施方案中，VIGS载体来源于可以感染所需宿主(诸如植物)的病毒。在一些实施方案中，改造的VIGS载体包含含有所述核酸的单一载体。在其他实施方案中，VIGS载体包括两种载体，其中一种被改造以包括所述核酸。在一些实施方式中，病毒是DNA病毒。在其他实施方案中，病毒是RNA病毒。在一个实施方案中，通过用病毒颗粒接种来用改造的VIGS载体接种宿主，诸如植物。在另一个实施方案中，通过农杆菌渗入来接种宿主，诸如注射器渗入或真空渗入。在另一个实施方案中，通过粒子轰击接种宿主。在另外的实施方案中，通过载体传播来接种宿主，诸如通过细菌、真菌、线虫、节肢动物和蜘蛛。在另一个实施方案中，通过机械传播或传播的其它自然方法来接种宿主。

在一个实施方案中，本发明使用在宿主植物中表达的重组植物病毒RNA序列来在摄入上述RNA序列的有害动物中实现异源沉默。本发明并不局限于在可能被植物病毒感染的那些作物(诸如单子叶植物植物，包括水稻、小麦、大麦、玉蜀黍等，和双子叶植物包括棉花、麻风树、烟草、番茄、马铃薯、大豆等)和其他植物中使用任何单一病毒(诸如TRV)，还包括使用本文描述的任何植物DNA或RNA病毒(例如，双粒病毒组，BSMV，BMV，PVX，CMV等)。

在另一个实施方案中，可以使用微生物的非致病、减毒菌株作为昆虫防治物质的载体，并且就这点来说，携带这类物质的微生物也被称为昆虫防治物质。可以将微生物改造为表达含有昆虫靶标基因的重组植物病毒核苷酸序列以产生RNA分子，所述RNA分子包括与通常在昆虫细胞内发现的RNA序列同源或互补的RNA序列。将昆虫暴露于微生物导致微生物的摄入和直接或间接由所述RNA分子或其片段或衍生物所介导的靶标基因表达的下调。

在另外的实施方案中，存在温和病毒株，其不引发宿主植物的任何症状，但可以保护宿主免受严重病毒株的后续感染。这类温和病毒株(被称为减毒的并可以提供交叉保护)已在数个国家的野外实验中用于病毒抗性。根据本发明，可以使用这类温和病毒株以在宿主植物中产生有害动物序列。被感染的宿主植物将具有对后续严重病毒株感染的抗性，并且耐受有害动物(昆虫)。这些温和毒株通常产生基因沉默的弱阻抑因子，从而使病毒RNA并不完全宿主机制所降解。在一个实施方案中，本发明使用合成TRV以证明温和毒株的TRV感染在棉花中并不诱导明显形态学表型以及在烟草中诱导弱表型。在另外的实施方案中，本发明通过用病毒颗粒接种，使用重组病毒在宿主植物中产生有害动物序列。在另一个实施方案中，通过农杆菌渗入来接种宿主，诸如通过喷雾接种、注射器渗入或真空渗入、或土壤浸润或其他接种方法来通过农杆菌感染作为中间步骤以产生病毒颗粒。在另一个实施方案中，通过粒子轰击接种宿主。在另外的实施方案中，通过载体传播来接种宿主，诸如通过细菌、真菌、线虫、节肢动物和蜘蛛。在另一个实施方案中，通过机械传播或传播的其它自然方法来接种宿主。在另一个实施方案中，嵌有靶标昆虫基因的重组病毒RNA可以在体外转录，并进一步用于感染植物以赋予植物昆虫抗性。在另外的实施方案中，产生重组病毒的转基因事件提供针对无脊椎有害动物侵袭(在针对靶标有害动物的优选有效范围内)的保护。此外，本领域技术人员熟知存在以下情况，其中将这类转基因事件置于优选的有效范围内是有利的。

可以预见，可以将本发明的组合物掺入到植物品种的种子内，或者是作为整合入植物细胞基因组内的重组基因的表达产物，或者是掺入在播种前应用于种子的包被或种子处理中。含有重组基因的植物细胞在本文中被认为是转基因事件。

本发明还包括具有不止一种转基因事件的种子和植物。这种组合被称作“叠加的(stacked)”的转基因事件。这些叠加的转基因事件可以是针对相同靶标有害动物的事件，也可以是针对不同的靶标有害动物。在一种优选的方法中，具有表达Cry3蛋白或其杀虫变体的能力的种子还具有表达至少一种其他杀虫物质的能力，所述杀虫物质包括但不限于不同于Cry3蛋白的蛋白和/或RNA分子，所述RNA分子的序列来源于在靶标植物中表达的重组病毒RNA的序列并且在种子或由种子长成的植物细胞中表达时形成沉默，其中靶标有害动物摄入一或多个植物细胞时导致靶标有害动物细胞中RNA表达的抑制。

附图简述

图1显示筛选昆虫基因的快速重组病毒方法，所述昆虫基因在表达被沉默时可以导致死亡。

图2显示根据本发明的实施方案防治昆虫的瞬态VIGS(transient VIGS)方法。

图3显示sTRV介导的棉铃虫(CBM)基因的沉默和对棉花昆虫侵袭的防治。数字表示来自至少3个独立实验的用不同sTRV载体处理的植物全身性叶(systemic leaves)饲喂13天后平均死亡率的平均相对值，含标准误差。对于每次饲喂实验，选择同期的幼虫(2-3龄虫)，单独称重并分组；每组包含6-18只个体。

图4显示sTRV介导的CBM基因的沉默和对本塞姆氏烟草昆虫侵袭的防治(N.benthamiana)。数字表示来自至少3个独立实验的用不同sTRV载体处理的植物系统叶饲喂13天后平均死亡率的平均相对值，含标准误差。对于每次饲喂实验，选择同期的幼虫(2-3龄虫)，单独称重并分组；每组包含6-18只个体。

图5显示sTRV介导的CBM基因沉默以及通过有义、反义和发夹RNA结构对棉花昆虫侵袭的防治。数字表示用不同sTRV载体处理的植物系统叶饲喂13天后平均死亡率的平均相对值。

图6显示sTRV介导的CBM基因沉默以及通过有义、反义和发夹RNA结构对本塞姆氏烟草昆虫侵袭的防治。数字表示用不同sTRV载体处理的植物系统叶饲喂13天后平均死亡率的平均相对值。

发明详述

本发明使用重组DNA技术来沉默或抑制有害动物细胞中靶标序列的表达，通过给有害动物饲喂一种或更多种病毒RNA序列，所述病毒RNA序列载有(a)靶标编码序列的一部分，(b)靶标5'UTR序列的一部分，(c)靶标3'UTR序列的一部分，(d)靶标5'UTR的一部分和靶标编码序列的一部分或(e)靶标编码序列的一部分和靶标4'UTR序列的一部分，采用(i)有义，(ii)反义，或(iii)发夹双链结构，从而防治有害动物。在一个实施方案中，靶标序列的长度在约50个核苷酸到约2000个核苷酸以及更多的范围之内。在另一个实施方案中，靶标序列的长度在约150个到约1500个核苷酸的范围之内。在进一步的实施方案中，靶标序列的长度是约200个到约1200个核苷酸。在另一个实施方案中，靶标序列的长度是约300个到约1000个核苷酸。在进一步的实施方案中，靶标序列的长度是约300个到约800个核苷酸。优选的使用约300个到约1000个核苷酸的靶标序列长度。进一步具体来说，使用在宿主植物中表达的重组植物DNA或RNA病毒序列在有害动物中进行异源沉默，所述有害动物摄入上述RNA序列。还描述了包含本发明RNA核苷酸序列的组合物，其被用于局部施用于植物或动物或动物所处的环境以实现有害动物的清除或减少。本发明还使用病毒作为表达载体以瞬时转录RNA，以便快速鉴定用于防治有害动物的一种或更多种核酸分子和重组DNA序列。利用这种方法，还描述了当沉默时可以导致死亡的数种昆虫基因。

本发明涉及异源病毒诱导的基因沉默(VIGS)以可靠、快速和高通量的方式鉴定杀死昆虫的基因或靶标序列的用途。本发明提供一种用于昆虫中VIGS的高效和可重复的系统和方法。在一个实施方案中，本发明提供两种基因的共沉默以增强防治昆虫的功效。

本发明包括一种抑制无脊椎有害动物中靶标基因表达的方法。表达抑制在本文中也被称为基因沉默。具体来说，本发明包括一种调节或抑制无脊椎有害动物(诸如昆虫)中一种或更多种靶标基因表达的方法，这造成摄食、生长、发育、繁殖和侵袭的终止，最后导致有害动物的死亡。简单来说，这种方法涉及包含在病毒RNA序列(对有害动物靶标序列特异的dsRNA或siRNA)内的有害动物相关序列在宿主(诸如宿主植物)中的表达。在一个实施方案中，作为包含核酸(包括有害动物靶标序列)的病毒复制的结果，产生有害动物RNA序列(dsRNA或siRNA)。当用包含靶标有害动物序列的重组病毒接种宿主植物时，所述病毒将复制，而与病毒RNA(dsRNA或siRNA)连接的有害动物序列将在系统叶中聚积。宿主植物可以通过以下方式接种：农杆菌渗入（诸如注射器渗入或真空渗入），粒子轰击，直接病毒颗粒，载体传染（诸如细菌，真菌，线虫，节肢动物和蜘蛛），机械传染（诸如，用包含病毒的制品摩擦植物部分诸如叶）或其他自然传染法。然后使用这些叶子作为饲喂昆虫的食物。如果病毒RNA连接的有害动物序列(昆虫dsRNA或siRNA)有毒时，当摄入时它将引起死亡。因此，这是一种筛选当沉默时可以导致死亡的昆虫基因的快速和高通量的方法。

所述方法包括将载有有害动物序列(表达的dsRNA或其修饰型诸如小干扰RNA(siRNA))的重组病毒引入有害动物的细胞或胞外环境，诸如无脊椎有害动物机体内的昆虫中肠，其中病毒RNA-有害动物序列(dsRNA或siRNA)进入细胞并抑制至少一种或更多种靶标基因的表达，并且所述一种或更多种靶标基因的抑制导致摄食、生长、发育、繁殖和侵袭的终止，最终导致无脊椎有害动物的死亡。特别可以预期，本文的方法和组合物可用于快速筛选用于限制或消除对任意有害动物宿主植物(其也是植物病毒宿主)的无脊椎有害动物侵袭的基因。

本发明还涉及一种使用病毒中单链NA(ssRNA)(按照有义或反义方向)而不是使用dsRNA的方法尽管确切机制是未知的，因为是植物病毒，有可能ssRNA具有一些单链病毒RNA区域的复制中间物或二级结构特征以形成dsRNA。但是，关键在于所述序列不作为dsRNA构建体存在，而是以有义方向或反义方向的ssRNA构建体存在。植物中的RNA沉默可以直接来源于病毒基因组的ssRNA，或通过宿主编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RDRs)作用来介导包括病毒基因组的同源RNA序列的降解。如本文所示，将ssRNA掺入病毒RNA是有效的抗有害动物防御机制。这种有效抗有害动物防御机制的准确机理是未知的。

因此在第一个方面，本发明提供一种筛选有害动物基因的方法，以鉴定当所述有害动物基因的表达在有害动物中被沉默时可以导致有害动物死亡的有害动物基因。根据本发明所述方面的一个实施方案的方法显示于图1。根据这个方面，所述方法包括∶

(a)将包括待筛选有害动物基因序列的核酸插入病毒的病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体以产生改造的VIGS载体，所述病毒可以感染所需宿主；

(b)用改造的VIGS载体接种宿主以产生受感染宿主；

(c)在所述改造的VIGS载体被复制的条件下培养受感染宿主以产生RNA，所述RNA在宿主组织中聚积；

(d)给有害动物饲喂含有RNA的宿主组织；和

(e)确定RNA对有害动物是否有毒性，

其中有害动物毒性鉴定出有害动物基因为当有害动物基因表达在有害动物中被沉默时导致有害动物死亡的有害动物基因。

在一个实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方案中，RNA是小干扰RNA(siRNA)，其可以采用短发夹RN(shRNA)形式。在进一步的实施方案中，RNA是单链RNA(ssRNA)。可以如本文所述在宿主中从改造的VIGS载体制备RNA。在本发明的这个方面，优选的RNA是dsRNA。

在一个实施方案中，有害动物是昆虫。在另一个实施方案中，宿主是植物。在另外一个实施方案中，VIGS载体来源于可以感染所需宿主(诸如植物)的病毒。在一些实施方案中，改造的VIGS载体包括包含核酸的单一载体。在其他实施方案中，VIGS载体包括两种载体，其中一种被改造以包括核酸。在一些实施方式中，病毒是DNA病毒。在其他实施方案中，病毒是RNA病毒。在一个实施方案中，通过用病毒颗粒接种，用改造的VIGS载体来接种宿主，诸如植物。在另一个实施方案中，通过农杆菌渗入来接种宿主，诸如注射器渗入或真空渗入。在另一个实施方案中，通过粒子轰击接种宿主。在其他的实施方案中，通过载体传播来接种宿主，诸如通过细菌，真菌，线虫，节肢动物和蜘蛛。在另一个实施方案中，通过机械传染接种宿主，诸如通过用包含病毒的制品摩擦宿主组织或通过其他自然传染法。

用于筛选的潜在有害动物基因包括编码重要蛋白(诸如参与有害动物的发育调节，生理或代谢方面)的那些基因。潜在有害动物基因的预测功能可以选自构成代谢途径诸如能量代谢和脱毒蛋白，器官或组织分化和发育调节，包括小RNA生物合成，蜕皮过程，和细胞骨架蛋白。

在第二个方面，本发明提供一种防治有害动物的方法，通过在宿主中表达靶标有害动物序列以改变有害动物基因在有害动物细胞或组织中的内源表达。根据本发明所述方面的一个实施方案的方法显示于图2。根据这个方面，所述方法包括∶

(a)将包括所需有害动物基因序列的核酸插入病毒的病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体以产生改造的VIGS载体，所述病毒可以感染所需宿主；

(b)用改造的VIGS载体接种宿主以产生受感染宿主；和

(c)在所述改造的VIGS载体被复制的条件下培养受感染宿主以产生RNA，所述RNA在宿主组织中聚积，

其中在有害动物摄入宿主所产生的dsRNA时所述dsRNA引起基因沉默，从而防治有害动物。

在一个实施方案中，有害动物是昆虫。在另一个实施方案中，宿主是植物。在另外一个实施方案中，VIGS载体来源于可以感染所需宿主(诸如植物)的病毒。在一些实施方案中，改造的VIGS载体包括包含核酸的单一载体。在其他实施方案中，VIGS载体包括两种载体，其中一种被改造以包括核酸。在一些实施方式中，病毒是DNA病毒。在其他实施方案中，病毒是RNA病毒。在一个实施方案中，通过用病毒颗粒接种，用改造的VIGS载体来接种宿主，诸如植物。在另一个实施方案中，通过农杆菌渗入来接种宿主，诸如注射器渗入或真空渗入。在另一个实施方案中，通过粒子轰击接种宿主。在其他的实施方案中，通过载体传播来接种宿主，诸如通过细菌，真菌，线虫，节肢动物和蜘蛛。在另一个实施方案中，通过机械传染接种宿主，诸如通过用包含病毒的制品摩擦宿主组织或通过其他自然传染法。在一个实施方案中，有害动物靶标基因如上文所述。

在一个实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方案中，RNA是小干扰RNA（siRNA），其可以采用短发夹RNA（shRNA）形式。在进一步的实施方案中，RNA是单链RNA(ssRNA)。可以如本文所述在宿主中从改造的VIGS载体制备RNA。

在另一个实施方案中，微生物的非致病、减毒菌株可以用作昆虫防治物质的载体，就这点来说，携带这类药剂的微生物也被称为昆虫防治物质。可以将微生物改造为表达含有昆虫靶标基因的重组植物病毒核苷酸序列以产生RNA分子，所述RNA分子包括与在昆虫细胞内常见的RNA序列同源或互补的RNA序列。将昆虫暴露于微生物导致微生物的摄入和靶标基因表达的下调，所述靶标基因受RNA分子或其片段或衍生物的直接或间接介导。

在本发明的一个实施方案中，VIGS载体是烟草脆裂病毒(TRV)。在该实施方案中，将核酸插入TRV RNA2序列来产生改造的TRV RNA2载体。制备包含TRV RNA1载体的农杆菌和包含改造的TRV RNA2载体的农杆菌的混合农杆菌培养物，并用于接种宿主植物。在一个实施方案中，包括TRVRNA2的载体和包括TRV RNA1的载体是合成的植物载体。在另一个实施方案中，第一所需基因的序列是基因有义链的序列。在另一个实施方案中，第一所需基因的序列是基因反义链的序列。在另一个实施方案中，第一所需基因的序列是基因发夹结构的序列。在进一步的实施方案中，核酸还包括待沉默的第二所需基因的序列。在一个实施方案中，第二所需基因是宿主植物病毒抗性基因。在另一个实施方案中，植物病毒抗性基因选自由RNase III切酶样4(DCL4)基因，RNase III切酶样2(DCL2)基因，RNase III切酶样3(DCL3)基因，ARGONAUTE1(AGO1)，ARGONAUTE71(AGO7)，RNA依赖性RNA聚合酶1(RDR1)，RNA依赖性RNA聚合酶6(RDR6)，基因沉默阻抑基因1(SGS1)，基因沉默阻抑基因3(SGS3)，和沉默缺陷基因3(Silencing defective 3,SDE3)所组成的组。在进一步的实施方案中，第二所需基因是昆虫小RNA生物合成基因。在另一个实施方案中，小RNA生物合成基因选自有切酶-1(DCR1)基因，Pasha基因，Loquacious基因(Loqs)，ARGONAUTE1基因(AGO1)，ARGONAUTE2基因(AGO2)，ARGONAUTE3基因(AGO3)，Piwi基因，Stellate基因和Aubergine基因(Aub)所组成的组。在另外的实施方案中，核酸包括超过两种待沉默的所需基因的序列。

如本文所述，本发明涉及一种抑制无脊椎有害动物中靶标基因表达的方法。具体来说，本发明包括一种调节或抑制无脊椎有害动物中一种或更多种靶标基因表达的方法，这造成摄食、生长、发育、繁殖和侵袭的终止，最后导致昆虫的死亡。所述方法包括将病毒表达的部分单链RNA(ssRNA)或其修饰型诸如小干扰RNA(siRNA)序列引入细胞或胞外环境(诸如无脊椎有害动物体内的中肠)，其中dsRNA或siRNA进入细胞并抑制至少一种或更多种靶标基因的表达，并且所述一种或更多种靶标基因的抑制对无脊椎有害动物起有害作用。除了防治有害动物以外，本发明可用于快速筛选基因以鉴定可用于限制或消除对任意宿主(诸如植物)的无脊椎有害动物侵袭的那些基因。此处参照棉铃虫(Helicoverpa armigera；鳞翅目)作为有害动物来说明本发明。但是，应理解本发明适用于任何有害动物，诸如本文公开的那些。还利用棉花或烟草作为宿主植物来说明本发明。但是，应理解本发明适用于任何宿主植物，诸如本文公开的那些。还使用TRV作为VIGS系统来说明本发明。但是，应理解本发明可以使用任何VIGS系统，诸如本文公开的那些。

用RNA和DNA病毒感染植物产生病毒相关的小干扰RNA(siRNA)。dsRNA，来源于一些单链病毒RNA区的复制中间物或二级结构特征，在感染病毒的植物细胞中可以聚积到较高水平。就植物DNA病毒而言，dsRNA可以由重叠互补转录物的退火而形成(Baulcombe,2004)。病毒诱导的基因沉默(VIGS)(Ruiz等,1998;Burch-Smith等,2004)提供了一种有吸引力的替代方式，因为它无需植物转化就能研究基因功能。可以构建载有插入的候选基因部分序列的重组病毒。这类重组病毒可以在植物中全身移动，产生包括候选基因的插入片段的dsRNA(其可以被改造为siRNA)，其介导内源基因转录物的降解(Brigneti等,2004;Burch-Smith等,2004)，导致候选基因表达在接种植物中的沉默。取决于植物种属，通常在病毒感染后1-2周测定对内源基因表达的影响。VIGS可以以快速和高通量的方式用做基因/基因家族敲低(knock-down)的有效反向遗传工具(Nasir等,2005)。因为敲低表型是瞬时和可逆的，这种方法可用于评价其缺陷可以引起胚胎死亡的基因的功能(Burch-Smith等,2004)。利用不同的注射法，已经证明VIGS在不同的器官中起作用，诸如叶子(Liu等,2002;Burch-Smith等,2006)，根(Valentine等,2004;Bhattarai等,2007)，花(Liu等,2004;Chen等,2005)，甚至果实(Fu等,2005)。

TRV VIGS系统已经成功地用于测定草本植物中的基因功能，诸如烟草(Ratcliff等,2001)，胡椒(Chung等,2004)，番茄(Liu等,2002)，大麦(Holzberg等,2002)，大豆(Fu等,2006;Nagamatsu等,2007)，蒺藜状苜蓿(Constantin等,2008)和罂粟(Hileman等,2005)及其他中的烟草脆裂病毒。

TRV VIGS系统已经成功地用于一些植物诸如拟南芥(Burch-Smith等,2006)，辣椒(Capsicum annuum)(Chung等,2004)，番茄(Lycopersiconesculentum)(Liu等,2002;Dinesh Kumar等,2007)，矮牵牛(Petunia hybrida)(Chen等,2005)，本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamian)(Liu等,2002)，马铃薯（Solanum tuberosum）(Brigneti等,2004),麻风树(Jatropha curcas)(美国临时专利申请号61/143,484)，棉花属(美国临时专利申请号61/185,631)，以及列于Plant Virus Online(http://image.fs.uidaho.edu/vide/descr808/htm)的其他推定植物。

因此，可用于本发明的VIGS系统包括，但不限于，烟草(Ratcliff等,2001)，胡椒(Chung等,2004)，番茄(Liu等,2002)，麻风树(美国临时专利申请号61/143,484)，棉花(美国临时专利申请号61/185,631)和罂粟(Hileman等,2005)中的烟草脆裂病毒；烟草(Hiriart等,2003)和胡椒(Kim等,2007)中的烟草花叶病毒；烟草(Saitoh and Terauchi,2002)和马铃薯(Faivre-Rampant等,2004)中的PVX；水稻，大麦和玉蜀黍中的BMV(Ding等,2006)；大麦和小麦中的BSMV(Holzberg等,2002)；大豆中的黄瓜花叶病毒(Nagamatsu等,2007)；烟草，番茄和大豆中的苹果潜隐球形病毒(Igarashi等,2009;Yamagishiand Yoshikawa,2009)；大豆中的豆荚斑点病毒(Zhang and Ghabrial,2006)；豌豆(Pisum sativum)(Constantin等,2008)，蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)和香豌豆(Lathyrus odoratus)(

等,2008)中的豌豆早枯病毒；植物DNA病毒诸如甜菜曲顶病病毒(Golenberg等,2009)和中国番茄黄化曲叶病毒(Huang等,2009)。全面综述请参见Unver和Budak(2009)。

基于它们的摄食方法，对植物造成损伤的昆虫通常属于3种类型，这三种类型分别是，咀嚼、吸吮和钻孔昆虫，它们属于鞘翅目，鳞翅目，双翅目，直翅目，异翅亚目，栉首蚤属(Ctenophalides)，蛛形纲(Arachnidiae)，和膜翅目。已经发现本方法可用于保护种子和植物抵抗广泛的农业有害动物。

当昆虫是本发明的靶标有害动物时，这类有害动物包括但不限于∶来自鳞翅目，例如，卷蛾(Acleris spp.),叶蛾(Adoxophyes spp.),透翅蛾(Aegeriaspp.),夜盗虫属(Agrotis spp.),棉叶虫(Alabama argillaceae),粉翅蛾(Amylois spp.),黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis),黄卷蛾(Archips spp),带卷蛾(Argyrotaenia spp.),银纹夜蛾(Autographa spp.),玉米楷夜蛾(Busseolafusca),粉斑螟蛾(Cadra cautella),桃小食心虫(Carposina nipponensis),二化螟(Chilo spp.),色卷蛾(Choristoneura spp.),葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella),卷叶螟(Cnaphalocrocis spp.),云卷蛾(Cnephasia spp.),纹卷蛾(Cochylis spp.),鞘蛾(Coleophora spp.),大菜螟(Crocidolomia binotalis),苹果异形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta),小卷蛾(Cydia spp.),螟属(Diatraea spp.),苏丹棉铃虫(Diparopsis castanea),金刚钻属(Earias spp.),粉蛾(Ephestia spp.),花小卷蛾(Eucosma spp.),女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella),黄毒蛾(Euproctisspp.),切夜蛾(Euxoa spp.),小食心虫(Grapholita spp.),广翅小卷蛾(Hedyanubiferana),实夜蛾(Heliothis spp.),菜心螟(Hellula undalis),美国白蛾(Hyphantria cunea),番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella),旋纹潜叶蛾(Leucoptera scitella),金纹细蛾(Lithocollethis spp.),花翅小卷蛾(Lobesiabotrana),舞毒蛾(Lymantria spp.),潜蛾(Lyonetia spp.),天幕毛虫(Malacosoma spp.),甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae),烟草天蛾(Manducasexta),秋尺蛾(Operophtera spp.),欧洲玉米螟(Ostrinia Nubilalis),超小卷蛾(Pammene spp.),褐卷蛾(Pandemis spp.),松夜蛾(Panolis flammea),红铃虫(Pectinophora gossypiella),马铃薯块茎蛾(Phthorimaea operculella),菜粉蝶(Pieris rapae),马醉木属(Pieris spp.),小菜蛾(Plutella xylostella),巢蛾(Praysspp.),三化螟(Scirpophaga spp.),蛀茎夜蛾(Sesamia spp.),长须卷蛾(Sparganothis spp.),灰翅夜蛾(Spodoptera spp.),透翅蛾(Synanthedon spp.),异舟蛾(Thaumetopoea spp.),卷叶蛾属(Tortrix spp.),粉斑夜蛾(Trichoplusiani)和巢蛾(Yponomeuta spp.);

来自鞘翅目，例如，细胸金针虫(Agriotes spp.),棉铃象虫(Anthonomusspp.),甜菜隐食甲(Atomaria linearis),甜菜胫跳甲(Chaetocnema tibialis),根颈象甲(Cosmopolites spp.),象鼻虫(Curculio spp.),皮蠹(Dermestes spp.),萤叶甲(Diabrotica spp.),食植瓢虫(Epilachna spp.),象鼻虫(Eremnus spp.),马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata),稻水象属(Lissorhoptrus spp.),金龟属(Melolontha spp.),尖头甲(Oycaephilus spp.),黑象鼻虫(Otiorhynchus spp.),花园象虫(Phlyctinus spp.),弧丽金龟(Popillia spp.),十节跳甲(Psylliodesspp.),劫根蠹(Rhizopertha spp.),金龟科(Scarabeidae),象鼻属(Sitophilusspp.),麦蛾(Sitotroga spp.),拟步行虫(Tenebrio spp.),赤拟谷盗(Triboliumspp.)和花斑皮蠹(Trogoderma spp.);

来自直翅目，例如，蜚蠊(latta spp.),小蠊属(Blattella spp.),蝼蛄(Gryllotalpa spp.),马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae),东亚飞蝗(Locustaspp.),大蠊属(Periplaneta ssp.),和沙漠蝗属(Schistocerca spp.);

来自等翅目，例如，散白蚁属(Reticulitemes spp.);来自啮虫目，例如，虱啮属(Liposcelis spp.);

来自虱目，例如，血虱属(Haematopinus spp.),长颚虱属(Linognathusspp.),虱属(Pediculus spp.),天疱疮(Pemphigus spp.)和葡萄根瘤蚜属(Phylloxera spp.);

来自食毛目，例如，牛羽虱属(Damalinea spp.)和啮毛虱属(Trichodectesspp.);

来自缨翅目，例如，禾蓟马(Franklinella spp.),蓟马(Hercinothrips spp.),带蓟马(Taeniothrips spp.),节瓜蓟马(Thrips palmi),烟蓟马(Thrips tabaci)和非洲橘硬蓟马(Scirtothrips aurantii);

来自异翅亚目，例如，臭虫属(Cimex spp.),狄氏盲蝽(Distantiellatheobroma),蝽象属(Dysdercus spp.),褐蝽(Euchistus spp.),盾蝽(Eurygasterspp.),缘蝽(Leptocorisa spp.),绿蝽(Nezara spp.),皮蝽(Piesma spp.),长红猎蝽(Rhodnius spp.),可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis),黑蝽(Scotinopharaspp.),锥蝽(Triatoma spp.),盲蝽科(Miridae family spp.)，诸如豆荚草盲蝽(Lygus Hesperus)和美国牧草盲蝽(Lygus lineoloris),长蝽科(Lygaeidaefamily spp.)诸如麦长蝽(Blissus leucopterus)，和蝽科(Pentatomidae familyspp.);

来自同翅目，例如，丝绒粉虱(Aleurothrixus floccosus),甘蓝夜蛾(Aleyrodes brassicae),红圆蚧(Aonidiella spp.),蚜科(Aphididae),蚜虫属(Aphis spp.),蚧属(Aspidiotus spp.),烟粉虱(Bemisia tabaci),蜡蚧(Ceroplaster spp.),菊叶介壳虫(Chrysomphalus aonidium),网籽草叶圆蚧(Chrysomphalus dictyospermi),褐软蜡蚧(Coccus hesperidum),小绿叶蝉(Empoasca spp.),苹果绵蚜(Eriosoma larigerum),斑叶蝉(Erythroneura spp.),介壳虫(Gascardia spp.),灰飞虱属(Laodelphax spp.),茱萸介壳虫(Lacaniumcorni),蛎属(Lepidosaphes spp.),长管蚜(Macrosiphus spp.),桃蚜(Myzusspp.),叶蝉(Nehotettix spp.),褐飞虱(Nilaparvata spp.),盾蚧(Paratoria spp.),天疱疮(Pemphigus spp.),动性球菌属(Planococcus spp.),白盾蚧(Pseudaulacaspis spp.),粉蚧(Pseudococcus spp.),木虱(Psylla ssp.),埃塞俄比亚蜡蚧(Pulvinaria aethiopica),圆蚧(Quadraspidiotus spp.),缢管蚜(Rhopalosiphum spp.),珠蜡蚧(Saissetia spp.),带叶蝉(Scaphoideus spp.),麦二叉蚜(Schizaphis spp.),长管蚜(Sitobion spp.),温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum),柑桔木虱(Triozae treae)和桔矢尖蚧(Unaspis citri);

来自膜翅目，例如，切叶蚁科(Acromyrmex),切叶蚁属(Atta spp.),麦茎蜂(Cephus spp.),松叶蜂属(Diprion spp.),松叶蜂科(Diprionidae),吉松叶蜂(Gilpinia polytoma),李实蜂(Hoplocampa spp.),心结蚁(Lasius spp.),法老蚁(Monomorium pharaonis),新松叶蜂属(Neodiprion spp),水蚁(Solenopsisspp.)和胡蜂属(Vespa ssp.);

来自双翅目，例如，伊蚊属(Aedes spp.),高粱黄潜蝇(Antherigonasoccata),全北毛蚊(Bibio hortulanus),红头丽蝇(Calliphora ethrocephala),地中海实蝇属(Ceratitis spp.),金蝇属(Chrysomyia spp.),库蚊属(Culex spp.),黄蝇属(Cuterebra spp.),实蝇(Dacus spp.),果蝇(Drosophila melanogaster),厕蝇属(Fannia spp.),胃蝇属(Gastrophilus spp.),舌蝇属(Glossina spp.),牛蝇(Hypoderma spp.),虱蝇Hyppobosca spp.,斑潜蝇(Liriomysa spp.),绿蝇属(Lucilia spp.),潜蝇(Melanagromyza spp.),蝇属(Musca ssp.),牛虻(Oestrusspp.),瘿蚊(Orseolia spp.),瑞典秆蝇(Oscinella frit),甜菜潜叶蝇(Pegomyiahyoscyami),草种蝇(Phorbia spp.),苹果实蝇(Rhagoletis pomonella),蕈蚊(Sciara spp.),厩蝇属(Stomoxys spp.),虻虫属(Tabanus spp.),Tannia spp.和欧洲大蚊(Tipula spp.);

来自蚤目，例如，角叶蚤属(Ceratophyllus spp.)和印鼠客蚤(Xenopsyllacheopis);和

来自缨尾目，例如，衣鱼(Lepisma saccharina)。

本发明还包括具有不止一种转基因事件的种子和植物。这种组合被称作“叠加的”的转基因事件。这些叠加的转基因事件可以是针对相同靶标有害动物的事件，也可以是针对不同的靶标有害动物。在一种优选的方法中，具有表达Cry3蛋白或其杀虫变体的能力的种子还具有表达至少一种其他杀虫剂的能力，所述杀虫剂包括但不限于不同于Cry3蛋白的蛋白和/或RNA分子，所述RNA分子的序列来源于在靶标植物中表达的重组病毒RNA的序列，并且在种子或由种子长成的植物细胞中表达时形成沉默，其中靶标有害动物摄入一种或更多种植物细胞时导致靶标有害动物细胞中RNA表达的抑制。

除非另外指出，本发明的实施使用以下常规技术：化学，分子生物学，微生物学，重组DNA，遗传学，免疫学，细胞生物学，细胞培养和转基因生物学，这都在本领域技术范围内。参见，例如，Maniatis等,1982,MolecularCloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York);Sambrook等,1989,Molecular Cloning,2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York);Sambrook and Russell,2001,Molecular Cloning,3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor，New York);Ausubel等,1992),Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,including periodic updates);Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford);Russell,1984,Molecular biology of plants: a laboratorycourse manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(AcademicPress,New York,1992);Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology(Academic Press,New York,1991);Harlow and Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984);CultureOf Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized CellsAnd Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To MolecularCloning(1984);the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Methods In Enzymology,Vols.154 and 155(Wu等eds.),Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);Riott,EssentialImmunology,6th Edition,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988;Fire等,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge,2005;Schepers,RNA Interference inPractice,Wiley-VCH,2005;Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts &Bolts of siRNA Technology,DNA Press,2003;Gott,RNA Interference,Editing，and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004;Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application,CRC,2004。

实施例

本发明参考下列实施例进行描述，提供所述实施例是为了说明而不是旨在以任何方式限制本发明。使用本领域公知的标准技术或下文具体描述的技术。

实施例1

实验步骤

植物幼苗∶烟草(本塞姆氏烟草)和棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum)L.cv.Coker 312)种子在新加坡繁殖，并在温室中发芽。在25℃按照16-h-白天/8-h-夜晚循环，在预灭菌的土壤中培养烟草和棉花植株。具有3-5片真叶的烟草幼苗用于农杆菌注射，具有2-3片真叶的棉花幼苗用于真空渗入。

棉铃虫∶棉铃虫(Helicoverpa armigera)卵获自中国农业科学院，在25℃和70%相对湿度下按照14-h-白天/10-h-夜晚的循环在实验室中培育。按照描述给幼虫饲喂改良的人工食物。烟草植株(农杆菌注射后1-2周)或棉花植株(真空渗入后2-3周)的叶子用于饲喂实验。对于每次饲喂实验，选择同期的幼虫，单独称重并分组；每组包含6-12只个体。在饲喂不同食物指定天数后，对幼虫称重，并记录每只个体的死亡。利用Excel程序中的斯氏t-检验进行数据统计。

合成的TRV RNA1表达载体∶合成的TRV1载体全长(7756bp)序列包括∶SphI位点，T-DNA右缘序列(152bp)，复制的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S增强子区(752bp)(Shi等,1997)，TRV Ppk20株RNA1(6791bp)，地三叶斑点病毒卫星RNA核酶序列(46bp)和SmaI位点序列。该全长序列被内源SalI位点分为两个部分。这两个部分单独合成，并克隆入pGH载体以得到两个载体pGH-YeJ-V1-1和pGH-YeJ-V1-2。合成的TRV RNA1片段，V1-1(通过用SphI和SalI酶处理从pGH-YeJ-V1-1释放)，和V1-2(通过用SalI和SmaI酶处理从pGH-YeJ-V1-2释放)，与用SphI和EcoICRI酶处理的pBIN121载体连接。新合成的TRV RNA1载体被称为psTRV1001。合成的psTRV1001序列显示于SEQ ID NO:1。合成的TRV RNA1序列与公开的TRV RNA1序列相同。

合成的TRV RNA2表达载体∶合成的TRV2载体全长(2915bp)序列包括∶HindIII位点，复制的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S增强子区(752bp)(Shi等,1997)，TRV株ppk20 RNA25'-序列(1639bp)，多克隆位点(61bp)，TRV株ppk20 RNA23'-序列(396bp)，HpaI位点。合成全长序列，并克隆入pGH载体得到pGH-YeJ-V2。将合成的TRV RNA2片段V2通过HindIII和HpaI连接入pCAMBIA0390。新合成的TRV rna2载体被称为psTRV2001。合成的psTRV2002序列显示于SEQ ID NO:2。

基因克隆和载体构建∶3个基因HaGST1,HaCHT,HaCYP6AE14的基因序列获自GenBank。通过果蝇(HaDCR1,HaCG4572,HaTub和HaVATP)或植物(NbDCL4)的同源基因序列共有的保守区域的设计引物通过PCR克隆另4个基因。对于单基因VIGS，从棉铃虫(CBM)全身样品的cDNA产物通过PCR扩增所有候选基因，并克隆入合成载体psTRV2001的XbaI和BamHI位点。对于共沉默载体，将第二基因的cDNA片段插入载体的KpnI和XhoI位点。用于克隆基因的引物显示于表1，其还包括克隆基因序列的参照。麻风树泻果素基因，编码麻风树特异性毒素，被用作CBM幼虫饲喂实验的非昆虫序列对照(美国临时专利申请号61/143,484，2009年1月9日提交；国际专利申请号PCT/SG2009/000481，2009年12月16日提交，公开为WO 2010/080071)。同时，δ-杜松烯合酶基因(DCS)，编码对于昆虫抑制性有毒植物化学剂棉酚重要的酶，被用作饲喂实验的阳性对照(美国临时专利申请号61/185,631，2009年6月10日提交；国际专利申请号PCT/SG2010/000220，2010年6月10日提交)。

反义和发夹结构构建∶当用psTRV2:Hatub质粒作为模板时，利用SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28(参见表1)所示的设计引物，PCR扩增HaTub的反义序列(显示为SEQ ID NO:29)。将扩增的PCR产物进一步克隆入合成载体psTRV2001的XbaI和BamHI位点。对于hpHatub发夹结构构建，利用SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31(参见表1)所示的PCR引物通过PCR扩增有义片段，并进一步克隆入pSK-内含子的BamHI和EcoRI位点(Guo等,2003)，接着插入用SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33(参见表1)所示的PCR引物扩增的反义片段。将hpHatub发夹结构亚克隆入psTRV2001的BamHI和XhoI位点得到psTRV:hpHaTub。

表1

基因引物和基因序列

RNA提取和cDNA合成∶将100mg叶或CBM组织在液氮中研磨，并用Trizol(Invitrogen)提取。按照(Qu等,2007)所述进行逆转录(RT)反应以获得cDNA。

农杆菌渗入∶通过电穿孔将合成的psTRV1，psTRV2载体及其衍生物引入农杆菌毒株AGL1。在28℃50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平中培养3ml培养物24小时。第二天，将培养物接种入LB培养基，其包含50mg/L卡那霉素，10mM 2-(N-磷酰二胺吗啉代)乙基磺酸(MES)和20μM乙酰丁香酮，在28℃振荡器中生长过夜。通过离心收集农杆菌细胞，并重悬于MMA溶液(10mM MES,10mM MgCl₂,200μM乙酰丁香酮)到最终OD₆₀₀为1.5。将不摇动的情况下将农杆菌悬液于室温下静置3-4小时。在渗入前，将包含psTRV1或psTRV2载体的农杆菌培养物按照1:1比例混合。通过注射器渗入用培养物浸润烟叶。对于注射器渗入，利用1ml无针注射器将农杆菌接种物输送到3或4片最新的完全伸展的叶片下侧。对于棉花真空渗入，将整株植物浸入农杆菌接种物，并进行80-90kPa真空2分钟，然后很快地解除真空，让接种物快速进入植物组织。在真空渗入后，过量的农杆菌细胞悬液用于浸润渗入植物的根系。渗入植物在25℃16小时光照/8小时黑暗光周期循环的生长箱中生长。

实施例2

昆虫靶标序列的鉴定

本实施例显示核苷酸序列的鉴定，当插入VIGS载体在宿主植物(其可以是棉铃虫(CBM)的食物)中产生重组病毒复制时，所述核苷酸序列可用于防治CBM种的有害动物。本实施例显示VIGS系统可用于快速筛选利用RNAi技术防治昆虫的基因。

昆虫p450单加氧酶在适应植物防御化合物和发展杀虫剂抗性方面起着重要作用。当棉铃虫依赖棉花生长时，它们需要升高水平的棉酚诱导的细胞色素P450(HaCYP6AE14)以将棉酚脱毒，如果给幼虫饲喂表达针对感兴趣靶标的VIGS载体的植物材料，HaCYP6AE14的下调可能降低幼虫的棉酚耐受性。

使用源自GenBank的CYP6AE14基因编码序列来构建在单链插入的VIGS载体中编码的核苷酸序列。利用如实施例1产生的CBM cDNA产物，使用SEQ ID NO:5所示的编码CYP6AE14序列一部分的859bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:5所示序列。为了在棉花中扩增棉铃虫有义CYP6AE14基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别对应于正向和反向基因组扩增引物以便产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:5所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2得到psTRV2:HaCYP6AE14。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaCYP6AE14载体)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与非昆虫序列对照(JcCurcin)相比，用sTRV:HaCYP6AE14(其包括SEQ ID NO:5所示的有义HaCYP6AE14基因序列)感染的棉株的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.05)(图3)。与对幼虫死亡率的HaCYP6AE14抑制作用不同，在相同时期对于用感染sTRV:GhDCS(其包括棉花δ-杜松烯合酶基因(DCS)，对于昆虫抑制毒性植物化学剂棉酚的生物合成非常重要的酶)的棉株的叶饲喂的幼虫组观察到幼虫死亡率的显著显著降低(p<0.05)。利用高效液相层析在感染sTRV:GhDCS(棉花VIGS专利)的棉花叶中检测到低得多的棉酚含量。与JcCurcin防治相比，更低的棉酚含量导致更高的存活率。

这些结果表明，合成的sTRV-VIGS系统可用于诱导所需内源昆虫基因的沉默以抑制有害动物侵袭。因为HaCYP6AE14只导致CBM幼虫生长的弱抑制作用，进行额外的筛选以发现其他有用基因，所述基因的沉默可以导致更高的抑制作用，并可用于在防治昆虫的生物技术应用中产生转基因植物。

实施例3

昆虫靶标序列的鉴定

本实施例显示核苷酸序列的鉴定，当插入VIGS载体在宿主植物(其可以是棉铃虫的食物)中产生重组病毒复制时，所述核苷酸序列可用于防治棉铃虫种的有害动物。

真核系统的生物能量代谢途径对于活生物体来说是基础和必要的功能。液泡H⁺-ATPase (V-ATPase)是自然界中最基本的酶之一。它在几乎每个真核细胞中维持足够的ATP水平，并给多种细胞器和膜提供能量。对大部分真核细胞来说，在编码V-ATPase的基因中的无义突变很可能是致死性的，因为这种酶对液泡系统的初始激发驱动穿过的液泡来源细胞器膜的重要次级运输过程。在果蝇中编码V-ATPase亚单位的基因的破坏也是致死性的。因此，V-ATPase可以是VIGS介导的昆虫抑制的有效靶标。

V-ATPase由数个亚单位组成。亚单位A，68-kDa亚单位A结合ATP，并催化其水解。为了研究昆虫生长中VATPase基因的抑制作用，我们首先克隆了假定的V-ATPase亚单位A棉铃虫基因同系物。我们利用TBLASTN，使用已知的菸草天蛾(Manduca sexta，GenBank登录号∶P31400)亚单位A的氨基酸序列检索GenBank棉铃虫(Helicoverpa armigera)EST数据库。棉铃虫EST序列BU038734和EE399876显示与天蛾幼虫V-ATPase催化亚单位A显著的同源性。基于这一信息，我们得到一个重叠群，具有896bp编码的C端结构域棉铃虫V-ATPase亚单位A蛋白。假定的棉铃虫VATP-A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:34所示。HaVATP-A基因的核苷酸序列分析显示编码区的89.4%同一性。棉铃虫V-ATPase亚单位A的氨基酸序列分析显示与天蛾幼虫VATPase亚单位A基因的86.3%同一性和93.9%相似性。

使用VATP-A基因编码序列来构建在单链插入的VIGS载体中编码HaVATP-A的核苷酸序列。利用如实施例1产生的CBM cDNA产物，使用SEQ ID NO:8所示的编码VATP-A序列一部分的763bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:8所示序列。为了在棉花和烟草中扩增棉铃虫有义VATP-A基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7分别对应于正向和反向基因组扩增引物以便产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:8所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2得到psTRV2:HaVATP。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaVATP载体)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。对于烟草植株，在接种后7-10天，使用农杆菌处理的植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与非昆虫序列对照(JcCurcin)相比，用sTRV:HaVATP(其包括SEQ ID NO:8所示的有义HaVATP基因序列)感染的棉株或烟草的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图3和图4)。与HaCYP6AE14相比，在HaVATP棉花处理组中观察到更好的昆虫抑制作用。

这些结果表明，合成的sTRV-VIGS系统可用于快速筛选需要的内源昆虫基因，它们的沉默可以抑制棉花和烟草中的有害动物侵袭。这些结果证明，VIGS系统也可用于其他重要作物来筛选用于RNAi防治有害动物侵袭的基因，例如水稻中的雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus)和小麦中的大麦条纹花叶病毒(Barley Stripe Mosaic Virus)。

实施例4

昆虫靶标序列的鉴定

几丁质是N-乙酰葡糖胺的β(1→4)同聚体，组成昆虫外骨骼。在昆虫中，几丁质支撑表皮和气管的外皮以及位于肠上皮细胞内层的围食膜基质。昆虫生长和形态发生严格依赖于重建含几丁质结构的能力。几丁质还必须被降解到一定程度以介导涉及昆虫蜕皮过程的步骤。几丁质酶是打断几丁质中糖苷键的消化酶。因此，几丁质酶蛋白形成的抑制可以是VIGS介导的昆虫抑制的有效靶标。

另一方面，编码昆虫几丁质酶的基因和cDNAs已被鉴定，并被表征为来自数种鳞翅类，双翅类和鞘翅类的昆虫。尽管在涉及很多昆虫种属的研究中先前只鉴定出一种(或有时候两种)几丁质酶基因，对果蝇，按蚊和近来赤拟谷盗的全测序基因组的数据库检索显示，这些昆虫中的每一种具有相当大家族的编码几丁质酶和几丁质酶样蛋白的基因，具有16-23个成员，这取决于所述种属。利用我们在昆虫中的快速VIGS系统，我们可以快速的对其进行鉴定，并分别鉴定出基因的功能。为了研究几丁质酶基因沉默在昆虫生长中的抑制作用，我们克隆出一种几丁质酶基因同系物。我们检索了GenBank，在棉铃虫基因组中发现至少5个几丁质酶基因。我们选择一种几丁质酶基因(GenBank登录号∶AY325496)作为一个例子。该几丁质基因全长cDNA序列显示于SEQ ID NO:35。

使用几丁质基因编码序列来构建在单链插入的VIGS载体中编码的核苷酸序列。利用如实施例1产生的CBM cDNA产物，使用SEQ ID NO:17所示的编码几丁质序列一部分的693bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:17所示序列。为了在棉花中扩增棉铃虫有义CHT基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16分别对应于正向和反向基因组扩增引物以便产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:17所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2得到psTRV2:HaCHT。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaCHT1载体)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。对于烟草植株，在接种后7-10天，使用农杆菌处理的植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与非昆虫序列对照(JcCurcin)相比，用sTRV:HaCHT(其包括SEQ ID NO:17所示的有义HaCHT基因序列)感染的棉株或烟草的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图3和图4)。与HaCYP6AE14和HaVATP相比，在HaCHT烟草处理组中观察到更好的昆虫抑制作用，而在棉花中还发现比HaVATP稍微弱一点的抑制作用。

实施例5

昆虫靶标序列的鉴定

谷胱甘肽-S-转移酶GSTs通过巯基与多种基质上亲电中心的作用，催化还原谷胱甘肽的偶联。这种脱毒素活性可以起转运蛋白作用以将内毒素脱毒来帮助昆虫在充满植保素的生存环境中存活。因此，该蛋白形成的抑制可以是VIGS介导的抑制的有效靶标。我们选择GST1基因(GenBank登录号∶EF033109)作为一个例子。该GST1基因全长cDNA序列显示于SEQID NO:36。

使用GST1基因编码序列来构建在单链插入的VIGS载体中编码的核苷酸序列。利用如实施例1产生的CBM cDNA产物，使用SEQ ID NO:26所示的编码GST1序列一部分的641bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:11所示序列.为了在棉花中扩增棉铃虫有义GST1基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:24和SEQID NO:25分别对应于正向和反向基因组扩增引物以便产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:26所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2得到psTRV2:HaGST1。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaGST1载体)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。对于烟草植株，在接种后7-10天，使用农杆菌处理的植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与非昆虫序列对照(JcCurcin)相比，用sTRV:HaGST1(其包括SEQ ID NO:26所示的有义HaGST1基因序列)感染的棉株或烟草的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图3和图4)。与hacyp6ae14，HaVATP和HaCHT相比，在HaGST1棉花和烟草处理组中观察到更好的昆虫抑制作用。

实施例6

昆虫靶标序列的鉴定

细胞骨架是包含在细胞质内的细胞“支架”或“骨架”。微管蛋白是所有真核生物细胞中许多细胞结构的重要结构组分，主要是在微管形成中。细胞中微管形成的抑制导致严重状况(诸如阻断细胞分裂等等)，导致终止发育。因此，微管蛋白形成的抑制可以是VIGS介导的抑制的有效靶标。

为了研究昆虫生长中微管蛋白基因的抑制作用，我们首先克隆了其α-微管蛋白假定的棉铃虫基因同系物。我们利用TBLASTN，使用已知家蚕(Bombyx mori)α-微管蛋白(NP_001036884)的氨基酸序列检索GenBank棉铃虫(Helicoverpa armigera)EST数据库。棉铃虫EST克隆BU038726显示与Bmtub的显著同源性。假定的棉铃虫Hatub基因的核苷酸序列是689bp，显示为SEQ ID NO:37。Hatub基因的核苷酸序列分析显示在蚕Bmtub编码区的89.4%同一性。棉铃虫Hatub的氨基酸序列分析显示与Bmtub的86.3%同一性和93.9%相似性。假定的Hatub基因的氨基酸显示于SEQ ID NO:38。

使用α-微管蛋白编码序列来构建在单链插入的VIGS载体中编码的核苷酸序列。利用如实施例1产生的CBM cDNA产物，使用SEQ ID NO:11所示的包括5'UTR和编码部分α-微管蛋白的编码区的506bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:11所示序列。为了在棉花和烟草中扩增棉铃虫有义tub基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10分别对应于正向和反向基因组扩增引物以便产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:11所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2得到psTRV2:Hatub。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:Hatub载体)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。对于烟草植株，在接种后7-10天，使用农杆菌处理的植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与非昆虫序列对照(JcCurcin)相比，用sTRV:Hatub(其包括SEQ ID NO:11所示的有义Hatub基因序列)感染的棉株或烟草的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图3和图4)。与HaCYP6AE14，HaVATP，HaCHT和HaGST1相比，在Hatub棉花和烟草处理组中观察到更好的昆虫抑制作用。

实施例7

昆虫小RNA途径的共沉默增强抑制功效

本实施例显示在无脊椎有害动物的食物中提供一种或更多种杀虫功效基因以及来源于无脊椎有害动物的单ss-RNA序列的协同作用。

如实施例6所示，提供用感染重组VIGS病毒的植物材料的饲喂导致有害动物中一种或更多种生物功能的抑制，从而能够实现杀虫功效，引起有害动物的死亡或其他可测量的特征(减轻有害动物侵袭特定环境或宿主的能力)。添加一种或更多种其他基因，每种彼此不同，并且每种均能通过不同于RNA实现其杀虫功效的各种途径的方式来实现其杀虫功效，可以实现有害动物防治水平的改善，并进一步降低有害动物发展出针对任意一种或更多种杀虫剂或RNA(当单独使用以实现有害动物的抑制时)的抗性的可能性。

小RNA(smRNA)调节多种多样的过程诸如无脊椎发育和分化。我们检验了smRNA生物合成途径的共沉默增强抑制功效的能力。

所有RNA沉默途径都需要从双链RNA (dsRNA)或单链病毒RNA内的高度结构化区域的切割以产生18-到26-nt smRNA。MicroRNA是重要的smRNA类型。miRNA是天然存在的RNAi途径触发剂，在许多生物体的基因调节中起重要作用。在miRNA的生物发生途径期间，各种生物体中的切酶-1(DCR1)或其同系物负责将pre-microRNA加工为成熟miRNA。当DCR1或其同源物被突变或下调或错误调节时，将在植物中产生严重的发育缺陷，诸如胚胎致死性和胚珠发育缺陷，和在人类中导致肿瘤。我们检验了VIGS系统共沉默假定的DCR1基因的能力，还探究了通过共沉默HaDCR1来增强候选基因沉默效果的可能性。我们使用标记基因Hatub来检查这种可能性。

使用DCR1基因编码序列来构建在插入用于共沉默的α-微管蛋白基因VIGS载体的单链中编码的核苷酸序列。利用如实施例1产生的CBM cDNA产物，使用SEQ ID NO:20所示的编码DCR1序列一部分的330bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:20所示的序列。为了在棉花和烟草中扩增棉铃虫有义HaDCR1基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19分别对应于正向和反向基因组扩增引物，用于产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:20所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2:Hatub得到psTRV2:Hatub+HaDCR1。将包含psTRV 1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaVATP载体或psTRV2:Hatub或psTRV2:Hatub+HaDCR1)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。对于烟草植株，在接种后7-10天，使用农杆菌处理的植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与只包括SEQ ID NO:11所示有义Hatub基因序列的sTRV:Hatub相比，用sTRV:Hatub+HaDCR1(其包括SEQ IDNO:20所示的有义HaDCR1基因序列加SEQ ID NO:11所示的有义Hatub基因序列)感染的棉株或烟草的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图3和图4)。添加HaDCR1的死亡率从只用Hatub的64.7%增加到79.4%。除此之外，Hatub+HaDCR1的死亡速率比只用Hatub早2-3天。

这些结果表明，至少就共沉默小RNA途径基因DCR1来说，两种昆虫不同途径的共沉默可以增强沉默功效。这种新策略可用于更有效的昆虫防治。

实施例8

植株病毒抗性系统的共沉默增加抑制功效

本实施例显示在无脊椎有害动物的食物中提供一种或更多种杀虫功效基因RNA序列(来源于无脊椎有害动物)以及植株宿主基因的沉默的协同作用。

如实施例2到实施例7所示，用感染重组VIGS病毒的植物材料的饲喂导致有害动物中一种或更多种生物功能的抑制，从而能够实现杀虫功效，引起有害动物的死亡或其他可测量的特征(减轻有害动物侵袭特定环境或宿主的能力)。添加一种或更多种宿主植物的其他基因(参与植物病毒复制，有害动物侵袭过程，植株抗性信号转导途径(茉莉酸，水杨酸)，针对昆虫的其他医学抗性，等等，每种彼此不同，并且每种均能通过不同于RNA实现其杀虫功效的各种途径的方式来实现其杀虫功效)，可以实现有害动物防治水平的改善，并进一步降低有害动物发展出针对任意一种或更多种杀虫剂或RNA(当单独使用以实现有害动物的抑制时)的抗性的可能性。

RNA沉默是抗病毒感染的天然植株防御机制之一。我们假定，利用VIGS的宿主病毒抗性系统的共沉默应当在昆虫中产生更有效的VIGS。

高等植物中抗病毒沉默的现有模型(举例来说使用拟南芥)，表明病毒基因组RNA的dsRNA复制中间物或单链病毒RNA内高度结构化的区域首先被RNase III-型切酶-样4(DCL4)或可选的DCL2切割以产生21-或22-核苷酸(nt)小干扰RNA(siRNA)(Baulcombe,2004)。该模型表明DCL4是一种重要的拟南芥病毒抗性基因(Deleris等,2006)。我们检验了TRV-VIGS系统沉默DCL4的能力，还探究了通过共沉默DCL4(一种重要的基因dsRNA代谢)来增强候选基因沉默效果的可能性。我们使用标记基因Hatub来检查这种可能性。

首先，我们证明单独的TRV:Hatub感染可以引起对棉铃虫的抑制性防治作用。其次，我们研究了烟草DCL4的共沉默是否可以增强沉默功效。

为了研究烟草DCL4基因共沉默在昆虫生长中的功效，我们首先克隆了假定的本塞姆氏烟草DCL4同系物。我们利用TBLASTN，使用已知拟南芥DCL4(AtDCL4)基因(At5g20320)的氨基酸序列检索GenBank EST数据库，限于茄科。两种EST，一种番茄(GenBank登录号BF051638)和一种常见烟草EST (GenBank登录号AM846087)，编码包含保守的核糖核酸酶III结构域的蛋白序列。将用于本塞姆氏烟草DCL4基因克隆的PCR引物设计为针对这两种EST序列之间的保守区域。通过pGEM-T-easy载体(Promega,U.S.A)克隆PCR产物，并进一步测序。利用如实施例1产生的本塞姆氏烟草cDNA产物，使用SEQ ID NO:23所示的编码NbDCL4基因序列一部分的395bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:39所示的序列。我们利用SEQ ID NO:23序列从本塞姆氏烟草cDNA序列数据库进一步发现了另一个EST序列(GenBank登录号:FM986783)。NbDCL4的一个重叠群(contig)如SEQ ID NO:39所示。使用NbDCL4基因编码序列来构建在插入用于共沉默的α-微管蛋白基因VIGS载体的单链中编码的核苷酸序列。将SEQ ID NO:23所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2:Hatub得到psTRV2:Hatub+NbDCL4，通过KpnI和XhoI位点。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaVATP载体或psTRV2:Hatub或psTRV2:Hatub+NbDCL4)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后7-10天，使用农杆菌处理的本塞姆氏烟草植株的新系统叶，农杆菌处理的植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在饲喂13天时，与只包括SEQ ID NO:11所示有义Hatub基因序列的sTRV:Hatub相比，用sTRV:Hatub+NbDCL4(其包括SEQ ID NO:23所示的有义NbDCL4基因序列加SEQ ID NO:11所示的有义Hatub基因序列)感染的棉株或烟草的叶饲喂的幼虫组观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图4)。添加NbDCL4的死亡率从只用Hatub的64.7%增加到84.2%。除此之外，Hatub+NbDCL4的死亡速率比只用Hatub早2-3天。

这些结果表明，参与dsRNA代谢的昆虫和宿主基因的共沉默可以增强沉默。这种新策略可用于更有效的昆虫防治。这可以通过以下解释，给昆虫饲喂这些植株后植物中聚积的更多dsRNA导致更高死亡率。

将VIGS对植物作用的增强与麻风树DCL4同源物(美国临时专利申请号61/143,484)的共沉默结合起来，植物DCL4同源物的共沉默可能是在植物或昆虫防治中增强VIGS功效的通用策略。

实施例9

胞吞介导的dsRNA摄取在VIGS防治昆虫中的作用

果蝇S2细胞通过主动途径摄取dsRNA，涉及受体介导的胞吞。该途径还参与抗果蝇C病毒和辛德毕斯病毒的抗病毒RNAi应答，通过引发整个生物体的保护性RNAi依赖免疫的全身传播沉默信号。为了检查CBM的这种途径是否也参与RNA介导的昆虫防治，我们挑选出一种参与dsRNA摄取并对针对病毒感染的RNAi抗性非常重要的基因：CG4572，通过先前实施例中使用的VIGS系统。

使用CG4572基因编码序列来构建在插入用于共沉默的α-微管蛋白基因VIGS载体的单链中编码的核苷酸序列。为了扩增来自棉铃虫的CG4572同源物，我们使用果蝇CG4572蛋白序列的氨基酸序列作为种子序列，利用TBLASTN检索GenBank昆虫EST数据库。通过这种方法发现来自诗神袖蝶(GE842295.1)和烟芽夜蛾(EY122719.1)的两种ESTs，并将其进一步用于设计简并PCR引物以针对来自不同昆虫物种的CG4572的保守序列模体。利用如实施例1产生的棉铃虫cDNA产物，使用SEQ ID NO:14所示的编码CG4572基因序列一部分的1075bp编码序列来构建引物对用于热扩增反应。SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的引物对能够扩增双链编码序列DNA扩增子，其中一条链显示SEQ ID NO:14所示序列。为了在棉花和烟草中扩增棉铃虫基因用于利用VIGS的功能分析，SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13分别对应于正向和反向基因组扩增引物以便产生来自棉铃虫cDNA产物的片段。将SEQ ID NO:14所示的DNA片段序列以有义方向插入psTRV2:Hatub得到psTRV2:Hatub+HaCG4572。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:HaVATP载体或psTRV2:Hatub或psTRV2:Hatub+HaCG4572)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

在接种后7-10天，使用农杆菌处理的本塞姆氏烟草植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在13天饲喂时，与只包括SEQ ID NO:11所示的有义Hatub基因序列的sTRV:Hatub相比，用感染sTRV:Hatub+HaCG4572(包括SEQ IDNO:14所示的有义HaCG4572基因序列加SEQ ID NO:11所示的有义Hatub基因序列)的棉花或烟草的叶饲喂的幼虫组未观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.01)(图3和图4)。

重要的是需要提及，尽管通过简单的监测各处理组的死亡率来确定杀死幼虫的潜能是重要的，但优选的通过Northern印迹或定量PCR来检查当饲喂sTRV2:HaCG4572植株时CBM中HaCG4572的表达是否被下调。

实施例10

病毒表达的反义RNA对昆虫是抑制性的

本实施例显示无脊椎有害动物食物中病毒表达的反义RNA的抑制作用。

使用反义α-微管蛋白基因序列来构建在单链插入的VIGS载体中编码的核苷酸序列。使用SEQ ID NO:29所示的编码部分α-微管蛋白的506bp序列来构建引物对(SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)，用于利用如实施例1所产生的psTRV2:Hatub质粒的热扩增反应。如实施例1所述构建反义Hatub表达病毒载体。使用反义Hatub基因来构建在插入psTRV2001的反义方向单链中编码的核苷酸序列以形成psTRV2:anti-Hatub。将包含psTRV1(具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:GhDCS(参见实施例1，作为阳性对照)或psTRV2:Hatub载体或psTRV2:Hatub或psTRV2:anti:Hatub)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草植株。

实施例11

病毒表达的发夹RNA对昆虫是抑制性的

本实施例显示，不仅单链有义昆虫RNA，而且反义昆虫RNA和发夹结构dsRNA可以制备为重组病毒，其可以在宿主植物中复制，可以是有害动物的食物并可用于防治有害动物。

将SEQ ID NO:11显示的有义单链DNA片段序列插入psTRV2得到实施例6描述的psTRV2:Hatub。

使用用于有义微管蛋白序列的类似策略从CBM扩增反义微管蛋白序列。使用SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的引物对(其分别对应于正向和反向基因组扩增引物)，从棉铃虫cDNA扩增棉铃虫反义tub基因，用于棉花和烟草中使用VIGS的功能分析。如实施例10所述，使用SEQ ID NO:29所示的扩增DNA片段序列来产生反义Hatub沉默载体psTRV2:反义-Hatub(psTRV2:anti:Hatub)。

使用发夹α-微管蛋白基因序列来构建在包含发夹结构的VIGS载体中编码的核苷酸序列。利用SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31所示的PCR引物通过PCR扩增有义片段，并进一步克隆入pSK-内含子的BamHI和EcoRI位点(Guo等,2003)，接着插入用SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示的PCR引物扩增的反义片段。将发夹-Hatub(hpHatub)发夹结构亚克隆入psTRV2001的BamHI和XhoI位点得到psTRV:发夹-Hatub(psTRV:hpHatub)。

将包含psTRV1（具有psTRV2:JcCurcin(作为非昆虫序列对照)或psTRV2:Hatub或psTRV2:反义-Hatub或psTRV2:发夹-Hatub)的农杆菌培养混合物真空渗入2-3个真叶棉花植株或5-6个真叶烟草(本塞姆氏)植株。

在接种后14天，使用农杆菌处理的棉花或本塞姆氏烟草植株的新系统叶饲喂CBM幼虫。在13天饲喂时，与非昆虫序列对照(JcCurcin)相比，用感染sTRV:Hatub或sTRV:反义-Hatub或sTRV:发夹-Hatub的棉花植株的叶饲喂的幼虫组中观察到显著更高的幼虫死亡率(p<0.05)(棉花显示于图5和本塞姆氏烟草显示于图6)。

这些结果表明，合成的sTRV-VIGS系统可用于诱导所需内源昆虫基因的沉默以抑制有害动物侵袭，通过插入昆虫基因的有义、反义和发夹结构。

实施例12

保守的昆虫靶标基因

本实施例列出其他昆虫目生物体中与本发明鉴定的cDNA序列具有保守性的靶标基因。

使用本发明中我们开发的方法，我们鉴定出6种昆虫基因，当在棉花和烟叶中通过重组病毒载体表达沉默时所述昆虫基因可以导致死亡。这些cDNA序列可用于发现其他昆虫目生物体(特别是针对重要作物的那些有害动物)中的潜在RNAi靶标基因，它们是编码V-ATPase A亚单位，α-微管蛋白，几丁质，GST和DCR1蛋白的那些序列，所述蛋白的核苷酸序列分别显示于SEQ ID NOs:8,11,17,26和20。同源物被定义为与6种CBM序列最显著的匹配，如NCBI Blast检索的最佳期望值所示。然后将CBM cDNA序列与包含来自GenBank的昆虫目中不同生物体所有公共cDNAs的序列数据库进行匹配。保留前100个匹配和比对。将获得的cDNA克隆进一步挑选为至少一个cDNA包含与CBM cDNA序列连续完全匹配的21-聚体。

利用6种CBM cDNA序列，从21种不同的生物体，包括数种有害动物种属，诸如二化螟(Asiatic Rice Borer)(Chilo suppressalis)，鉴定出具有最低21-聚体完全匹配区域的30个匹配。结果列于下面的表2，查询序列和命中物匹配的座标，匹配的同一性百分比，以及作为命中序列来源的昆虫种属。例如，来自具有称为Hatub的基因的SEQ ID NO:11的核苷酸序列的片段被鉴定为与烟草夜蛾幼虫(烟芽夜蛾(Heliothis virescens))的GenBank序列(具有登录号EY118187)的片段97%相同。

表2

棉铃虫基因的同源物

在描述本发明的背景(尤其是下列权利要求的背景)下，术语“一个(a)”和“一个(an)”和“the”以及类似对象的使用应解释为包括单数和复数，除非在本文中另外指出或根据背景明显矛盾。术语“包括(comprising)”，“具有(having)”，“包含(including)”和“包含(containing)”应理解为开放式的术语(即，表示包括但不限于），除非另作说明。本文数值范围的描述仅仅旨在作为分别涉及属于所述范围的每个单独值的简写方法，除非本文另外指出，每个单独值被包括进说明书就好像它是在本文单独描述的。例如，如果公开了范围10-15，那么11，12，13，和14也被公开。本文描述的所有方法可以按照任何合适的顺序进行，除非本文另外指出，或另外根据背景明显抵触。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言（例如，“诸如”）的使用仅仅是为了更好的说明本发明，不是为了给本发明的范围做出限制，除非另有要求。说明书中没有语言应理解为指示任意未要求的要素是实施本发明必需的。

应理解本发明的方法和组合物可以整合入各种形式的实施方案，本文只公开了其中一些。本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知用于实施本发明的最佳方式。在阅读上述说明书后，这些实施方案的变化对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。本发明人预期有经验的技术人员酌情使用这类变化，本发明人认为可以在本文具体描述之外实施本发明。因此，本发明包括适用法律许可的所附权利要求中叙述的主题的所有改变物和等同物。此外，本发明包括上述元件采用其所有可能变化的任何组合，除非本文另外指出，或根据背景明显抵触。

本发明具有数种实施方案，并且关于本领域技术人员已知的细节依赖于专利、专利申请和其他参考文献。因此，当本文引用或重复专利、专利申请或其他参考文献时，应理解其是为了所有目的以及为了所述提议而完整引入作为参考。

文献目录

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Claims

1.一种筛选有害动物基因的方法，以鉴定当所述有害动物基因的表达在有害动物中被沉默时能导致有害动物死亡的有害动物基因，所述方法包括：

(a)将包含第一所需基因序列的核酸插入到病毒的病毒诱导基因沉默(VIGS)载体内以产生改造的VIGS载体，所述病毒可以感染所需宿主，其中所述第一所需基因是待筛选的有害动物基因；

(b)用改造的VIGS载体接种宿主以产生被感染的宿主；

(d)给有害动物饲喂具有RNA的宿主组织；和

(e)确定RNA对有害动物是否有毒性，

其中有害动物毒性鉴定出所述有害动物基因为当该有害动物基因表达在有害动物中被沉默时导致有害动物死亡的有害动物基因。

2.权利要求1的方法，其中所述病毒是DNA病毒。

3.权利要求1的方法，其中所述病毒是RNA病毒。

4.权利要求3的方法，其中RNA病毒是含有两种RNA分子的RNA病毒，并且其中一种RNA分子是VIGS载体。

5.权利要求4的方法，其中RNA病毒是烟草脆裂病毒(TRV)。

6.权利要求4或5的方法，其中用改造的VIGS载体和含有其它RNA分子的载体接种所述宿主。

7.权利要求1-6中任意一项的方法，其中所述宿主是植物，并且所述宿主组织是植物叶。

8.权利要求1-7中任意一项的方法，其中所述核酸还包括第二所需基因的序列，所述第二所需基因是植物宿主抗性基因。

9.权利要求8的方法，其中所述宿主抗性基因选自由RNase III切酶样4(DCL4)基因、RNase III切酶样2(DCL2)基因、RNase III切酶样3(DCL3)基因、ARGONAUTE1(AGO1)、ARGONAUTE71(AGO7)、RNA依赖性RNA聚合酶1(RDR1)、RNA依赖性RNA聚合酶6(RDR6)、基因沉默阻抑基因1(SGS1)、基因沉默阻抑基因3(SGS3)、和沉默缺陷基因3(SDE3)所组成的组。

10.权利要求1-7中任意一项的方法，其中所述核酸还包括第二所需基因的序列，所述第二所需基因是有害动物小RNA生物合成基因。

11.权利要求10的方法，其中所述有害动物小RNA生物合成基因选自由切酶-1(DCR1)基因、Pasha基因、Loquacious基因(Loqs)、ARGONAUTE1基因(AGO1)、ARGONAUTE2基因(AGO2)、ARGONAUTE3基因(AGO3)、Piwi基因、Stellate基因和Aubergine基因(Aub)所组成的组。

12.权利要求1-11中任意一项的方法，其中所产生的RNA是dsRNA。

13.权利要求12的方法，其中所述dsRNA是siRNA或被改造以形成siRNA。

14.权利要求13的方法，其中所述核酸作为发夹结构插入载体。

15.权利要求1-11中任意一项的方法，其中所产生的RNA是ssRNA。

16.权利要求15的方法，其中所述核酸以有义方向插入载体。

17.权利要求15的方法，其中所述核酸以反义方向插入载体。

18.权利要求1-17中任意一项的方法，其中所述序列选自由如下所组成的组:(a)第一所需基因5'UTR的一部分，(b)第一所需基因3'UTR的一部分，(c)第一所需基因编码序列的一部分，(d)第一所需基因5'UTR的一部分和第一所需基因编码序列的一部分，和(e)第一所需基因编码序列的一部分和第一所需基因3'UTR的一部分。

19.一种防治有害动物的方法，通过靶标有害动物序列在宿主中的病毒表达以改变有害动物基因在有害动物细胞或组织中的内源表达，所述方法包括：

(a)将包含待沉默的第一所需基因序列的核酸插入到病毒的病毒诱导基因沉默(VIGS)载体内以产生改造的VIGS载体，所述病毒可以感染所需宿主，其中第一所需基因是有害动物基因；

(b)用所述改造的VIGS载体接种宿主以产生被感染的宿主；和

其中在宿主中所产生的RNA被摄入时所述RNA引起有害动物中的基因沉默，由此防治有害动物。

20.权利要求19的方法，其中所述病毒是DNA病毒。

21.权利要求19的方法，其中所述病毒是RNA病毒。

22.权利要求21的方法，其中所述RNA病毒是包含两种RNA分子的RNA病毒，并且其中一种RNA分子是VIGS载体。

23.权利要求22的方法，其中RNA病毒是烟草脆裂病毒(TRV)。

24.权利要求22或23的方法，其中用改造的VIGS载体和含有其他RNA分子的载体接种宿主。

25.权利要求19-24中任意一项的方法，其中宿主是植物并且所述宿主组织是植物叶。

26.权利要求19-25中任意一项的方法，其中所述核酸还包括第二所需基因的序列，所述第二所需基因是植物宿主抗性基因。

27.权利要求26的方法，其中所述宿主抗性基因选自由RNase III切酶样4(DCL4)基因、RNase III切酶样2(DCL2)基因、RNase III切酶样3(DCL3)基因、ARGONAUTE1(AGO1)、ARGONAUTE71(AGO7)，RNA依赖性RNA聚合酶1(RDR1)，RNA依赖性RNA聚合酶6(RDR6)、基因沉默阻抑基因1(SGS1)、基因沉默阻抑基因3(SGS3)、和沉默缺陷基因3(SDE3)所组成的组。

28.权利要求19-25中任意一项的方法，其中所述核酸还包括第二所需基因的序列，所述第二所需基因是有害动物小RNA生物合成基因。

29.权利要求28的方法，其中所述有害动物小RNA生物合成基因选自由切酶-1(DCR1)基因、Pasha基因、Loquacious基因(Loqs)、ARGONAUTE1基因(AGO1)、ARGONAUTE2基因(AGO2)、ARGONAUTE3基因(AGO3)、Piwi基因、Stellate基因和Aubergine基因(Aub)所组成的组。

30.权利要求19-29中任意一项的方法，其中所产生的RNA是dsRNA。

31.权利要求30的方法，其中所述dsRNA是siRNA或被改造以形成siRNA。

32.权利要求31的方法，其中所述核酸作为发夹结构插入载体。

33.权利要求19-29中任意一项的方法，其中所产生的RNA是ssRNA。

34.权利要求33的方法，其中所述核酸以有义方向插入载体。

35.权利要求33的方法，其中所述序列是载体中反义方向的核酸。

36.权利要求19-35中任意一项的方法，其中所述有害动物基因选自由以下组成的组：棉酚诱导的细胞色素P450(CYP6AE14)、H⁺-ATPase(V-ATPase)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、切酶-1(DCR1)、α-微管蛋白和几丁质。

37.权利要求19-36中任意一项的方法，其中所述序列选自由以下所组成的组：(a)第一所需基因5'UTR的一部分，(b)第一所需基因3'UTR的一部分，(c)第一所需基因编码序列的一部分，(d)第一所需基因5'UTR的一部分和第一所需基因编码序列的一部分，和(e)第一所需基因编码序列的一部分和第一所需基因3'UTR的一部分。