CN102643798A - 大曲酒窖泥微生物总dna提取的前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，包括以下步骤：(1)称取适量窖泥，放入灭菌的离心管中，加入灭菌生理盐水，充分振荡，离心，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；(2)向上述样品加入无水乙醇，充分振荡，离心，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；(3)加入无菌超纯水，混合均匀，振荡洗涤样品，离心，弃去上清液；(4)将充分洗涤的窖泥样品用双层灭菌纱布包裹离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于-20℃冰箱，用于提取窖泥微生物总DNA。本发明处理方法简单，所需试剂少，可有效除去窖泥中乙酸乙酯、己酸乙酯、酒精等酯类、醇及其他有机酸，提取窖泥微生物总DNA效果好，效率高，其大小为23.1Kb左右。

Description

大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法

技术领域

本发明涉及环境样品DNA提取的预处理方法，特别涉及大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法。

背景技术

中国白酒是世界六大蒸馏酒(威士忌、白兰地、金酒、伏特加、朗姆酒、中国白酒)之一，其酿造历史悠久，酿造工艺独特。在大曲酒的酿造过程中，窖泥发挥着重要作用，是大曲酒发酵不可缺少的先决条件。

大曲酒酒质直接与窖泥的质量密切相关。按大曲酒酿造传统，50年以上的老窖可生产特头曲酒，20年左右窖龄的酒窖只能出产二、三曲。新窖泥为纯黄泥，熟化过程中，泥色逐渐由黄转乌，最后呈乌黑带灰色，间或出现红绿色彩，手感由初期的粘性绵软变为熟化后的质软无粘性。在此过程中，酿酒酒糟和窖池黄泥不断接触，香味物质、微生物、营养物质等组分互相渗透、不断积累，形成了独具特色的大曲酒窖泥。窖泥是各种有益微生物的载体和栖息场所，微生物在窖泥中不断繁殖，形成了丰富多样、生命活力旺盛的微生物类群，并构建了特殊的微生态体系。窖泥微生物参与的各种生香和发酵作用，实现了窖泥自身的新陈代谢。窖泥形成过程中，其中的有益微生物包括乳酸菌、己酸菌、甲烷菌、丁酸菌、产甲烷古菌等类群参与了大曲酒的生香过程，生成了包括乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等系列呈香物质，因而熟化后老窖泥带有浓郁的窖香，窖龄越长，酒质越好。

基于大曲酒窖泥在中国白酒酿造中的重要性，相关专家一直致力于研究该体系中微生物种群及其作用。目前，对窖泥中特殊微生物生态体系的研究，多采用传统的可培养微生物研究技术进行种群特性分析，由于窖泥环境的复杂性，加之大量微生物无法获得纯培养，利用传统可培养微生物研究技术只能认识大曲酒窖泥复杂微生物体系中的极少部分。采用现代分子生物学技术，从环境样品直接提取DNA进行研究，有利于全面揭示传统中国白酒窖泥的微生物种群特点。要开展窖泥微生物体系研究，首先必须获得高质量的窖泥样品总DNA，由于窖泥除了含有高浓度的乙醇及其他醇类外，还含有乙酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯等呈香物质以及其他有机酸、酯类和腐殖质等，这些物质严重干扰了窖泥微生物总DNA的提取。现有专利中，已有公开号为CN101684137A的中国发明专利介绍了从白酒大曲中提取微生物总DNA的方法，其核心在于提取DNA之前对含有大量杂质的大曲样品进行前处理。但因大曲和窖泥形成环境不同、组成成分差异大，提取总样品DNA时所采取的前处理方法也会不一样，迄今也未见提取窖泥DNA前处理的报道。

尽管从土壤样品中提取微生物总DNA的方法很成熟，土壤DNA提取试剂盒也已普遍应用，但因窖泥组成体系复杂，加之富含醇类、酯类、有机酸类、腐殖质等物质，严重影响了窖泥样品总DNA的提取效率和质量，采用现有方法获取高质量窖泥总DNA仍然相当困难。

发明内容

基于上述现状，针对窖泥本身的特点，本发明提供了一种有效提取窖泥样品微生物总DNA的前处理方法，可有效除去干扰窖泥DNA提取的醇类、酯类、有机酸及其他有机物，经过前处理的窖泥，采用土壤样品DNA常规提取方法，可顺利获得高质量的窖泥样品DNA。经检测，其大小为23.1Kb左右(图1a)，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.825，不需进一步纯化，即可进行16S rDNAPCR、PCR-DGGE分析，从而为系统研究窖泥微生物分子生态奠定了基础。

本发明涉及的提取大曲酒窖泥DNA的前处理方法如下：

一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，包括以下步骤：

(1)称取适量窖泥，放入灭菌的离心管中，加入灭菌生理盐水(按照质量百分比计，含0.4％-0.6％吐温-80)，充分振荡3-5min，4℃，9000r/min离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；

(2)向上述样品加入无水乙醇，充分振荡3-5min洗涤样品，4℃，9000rpm离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次；

(3)加入无菌超纯水，混合均匀，振荡3-5min，洗涤样品，4℃，9000rpm离心12min，弃去上清液；

(4)将充分洗涤的窖泥样品用双层灭菌纱布包裹离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于-20℃冰箱，用于提取窖泥微生物总DNA。

所述步骤(1)-(3)中，洗涤用灭菌生理盐水、无水乙醇、无菌超纯水的加入量，按窖泥与溶液的重量体积比1∶1-2比例添加。

所述方法，从经过预处理的大曲酒窖泥中提取微生物总DNA的步骤包括：

A：窖泥样品中加入DNA提取液，其中提取液的组成为100mM Tris-HCl，100mMEDTA，100mM磷酸盐缓冲液，1.5M NaCl，1％CTA；

B：反复冻融；

C：加入蛋白酶K和20％的SDS；

D：加入等体积的氯仿-异戊醇溶液(24∶1，V∶V)抽提，离心，收集上层液相；

E：加入0.1V的3mol/L NaAc和0.6V的异丙醇(4℃预冷)沉淀DNA；

F：75％的酒精洗涤沉淀，用30-50μl ddH₂O溶解沉淀。

本发明DNA提取中步骤B在-80℃和65℃水浴中反复冻融3次，每次20min，步骤C加入的蛋白酶K浓度为10mg/ml，37℃温育1h，加入20％SDS，65℃水浴保温1.5h，期间每隔15min上下颠倒1次，以使充分混合，然后10000转/分离心，收集中间液相层。步骤E加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的异丙醇(4℃预冷)，4℃静置过夜，步骤F中用75％酒精洗涤沉淀2次，10000转/分离心，弃上清，最后风干DNA样品，溶于30-50μl ddH₂O。

附图说明

图1(a)是经前处理的窖泥提取的DNA样品1％琼脂糖凝胶电泳检测图，(b)未经过前处理的窖泥提取的DNA样品1％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图2是细菌16S rRNA V3区PCR扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳检测图；

图3是细菌16S rRNA V3区扩增产物DGGE图谱。

图中编号：1，1’-400年窖池窖泥；2，2’-100年窖池窖泥；3，3’-40年窖池窖泥；4，4’-新建窖池窖泥。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

除特别说明外，实施例中百分比均为质量百分比。

实施例一

(1)样品预处理

称取10g窖泥，放入灭菌的50ml离心管中，加入10ml灭菌生理盐水(按照质量百分比计，含0.4％-0.6％吐温-80)，在涡旋振荡器上充分混匀5min，使块状窖泥样松散开，与生理盐水充分混合。洗涤过程中，用灭菌玻棒挑出漂浮在悬液表层或悬液中的稻壳等杂质，然后9000r/min，4℃，离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次。

在经过上述处理的窖泥样品中加入无水乙醇10ml，振荡混匀3min，充分洗涤，4℃，9000r/min，离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次。随后向窖泥样品加入20ml无菌超纯水，充分振荡洗涤窖泥样品，4℃，9000r/min，离心12min，弃去上清液。

用两层灭菌纱布包裹住离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于-20℃，用于提取窖泥微生物总DNA。

(2)窖泥总DNA提取

各称取0.4g预处理过的窖泥样品和未经过与处理的窖泥于2ml的EP管中，加入DNA提取液1000μl，DNA提取液组成为：100mM Tris-HCl，100mM EDTA，100mM磷酸盐缓冲液，1.5M NaCl，1％CTAB；DNA提取液使用前先预热，使白色沉淀溶解，并充分混匀；在涡旋振荡器上振荡，使EP管中的窖泥样品和提取液充分混合，然后将EP管放入-80℃的冰箱中冷冻15min，取出放入65℃的水浴中融化，反复冻融3次；加入40μl蛋白酶K(10mg/ml)混匀，放入37℃的水浴中温育1h，每15min摇动1次；随后向EP管中加入20％SDS溶液200μl，混匀，65℃水浴1.5h，每15min振荡1次；处理完毕，4℃，10000r/min离心15min，取出后吸800μl上清液，于另一EP管中，在该EP管等体积加入氯仿-异戊醇溶液(24∶1，V∶V)，使充分混合，4℃，10000r/min离心15min，吸600μl上清液于另一EP管，加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的异丙醇(4℃预冷)，4℃静置沉淀30min；4℃，10000r/min离心20min，弃上清，用30μl浓度为75％的酒精洗涤沉淀2次，风干后溶于30μl的ddH₂O，-20℃保存备用。

(3)DNA样品检测

制备1％琼脂糖凝胶，各取2μl窖泥DNA样品，加入载样缓冲液，点样，60V电泳40min，紫外成像系统检测供试DNA样品，拍照，记录。结果如图1，采用前处理的窖泥样品，顺利地提取出了高质量的窖泥总DNA，经检测，其大小为23.1Kb左右(图1a)，未经过前处理的窖泥则未提取到窖泥样品DNA(图1b)。

实施例二

(1)样品预处理

称取10g窖泥，放入灭菌的50ml离心管中，加入15ml灭菌生理盐水(按照质量百分比计，含0.4％-0.6％吐温-80)，在涡旋振荡器上充分混匀5min，使块状窖泥样充分分散。洗涤过程中，用灭菌玻棒挑出漂浮在悬液表层或悬液中的稻壳等杂质，然后9000r/min，4℃，离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次。

在经过上述处理的窖泥样品中加入无水乙醇20ml，混匀振荡3min，充分洗涤，4℃，9000r/min，离心12min，弃去上清液；同法重复洗涤样品1次。最后，在窖泥样品中加入无菌超纯水20ml，充分振荡洗涤窖泥样品1次，4℃，9000r/min，离心12min，弃去上清液。

随后用两层灭菌纱布包裹住离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，-20℃冰箱保存，用于提取窖泥微生物总DNA。

(2)窖泥总DNA提取

称取0.4g经预处理的窖泥样品于2ml的EP管，加入DNA提取液1000μl，DNA提取液组成为：100mM Tris-HCl，100mM EDTA，100mM磷酸盐缓冲液，1.5M NaCl，1％CTAB；DNA提取液使用前先预热，使白色沉淀溶解，并充分混匀；在涡旋振荡器上振荡，使EP管中的窖泥样品和提取液充分混合，然后将EP管放入-80℃的冰箱中冷冻15min，取出放入65℃的水浴中融化，反复冻融3次；加入40μl蛋白酶K(10mg/ml)混匀，放入37℃的水浴中温育1h，每15min摇动1次；随后向EP管中加入20％的SDS溶液200μl，混匀，65℃水浴1.5h，每15min振荡1次；处理完毕，4℃，10000r/min离心15min，取出后吸800μl上清液，于另一EP管中；等体积加入氯仿-异戊醇溶液(24∶1，V∶V)，使充分混合，4℃，10000r/min离心15min，吸600μl上清液于另一EP管，加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.6倍体积的异丙醇(4℃预冷)，4℃静置沉淀30mir；4℃，10000r/min离心20min，弃上清，75％酒精洗涤沉淀2次，风干后溶于30μl的ddH₂O，放于-20℃冰箱中保存备用。

(3)DNA纯度检测

吸取5μl窖泥DNA样品，稀释至1.2ml，用紫外分光光度计测定波长260nm和280nm的OD值，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.825，表明DNA提取过程中，蛋白质去除效果好。

实施例三

(1)16S rDNA V3区片段扩增

采用实施例一的方法提取窖泥DNA，对细菌16S rDNA V3区片段进行PCR-DGGE分析。选用细菌通用引物338f-GC/518r，以提取的窖泥总DNA为模板，扩增细菌16S rDNA

V3区片段PCR，反应体系50μl，包括2×PCR Mastermix 25μl，引物各1μl，模板DNA2μl；ddH₂O 21μl。

扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃1分钟，65℃-55℃(↓0.5℃/循环)，50秒，72℃1分钟，20个循环；94℃1分钟，55℃30秒，72℃1.5分钟，15个循环；最后72℃延伸7分钟。

(2)16S rDNA V3区片段扩增检测

扩增完毕，扩增产物1％琼脂糖凝胶，60V电泳30min，紫外凝胶成像系统检测16SrDNA V3区片段，电泳结果表明，其片段大小为250bp(图2)，符合扩增要求。

(3)DGGE分析

PCR扩增产物DGGE分析采用8％凝胶浓度，变性梯度为30％-60％，50℃50V预电泳30min，随后150V，60℃电泳5.5h。电泳结束，凝胶银染后用数码相机拍照(图3)。

Claims (1)

1.一种大曲酒窖泥微生物总DNA提取的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取适量窖泥，放入灭菌的离心管中，加入灭菌生理盐水，按照质量百分比计，生理盐水含0.4％-0.6％吐温-80，充分振荡3-5min，4℃，9000r/min离心12min，弃去上清液；同法洗涤样品2次；

(2)向上述样品加入无水乙醇，充分振荡3-5min洗涤样品，4℃，9000rpm离心12min，弃去上清液；同法洗涤样品2次；

(3)加入无菌超纯水，混合均匀，振荡3-5min，洗涤样品，4℃，9000rpm离心12min，弃去上清液；

(4)将充分洗涤的窖泥样品用双层灭菌纱布包裹离心管口，-70℃冷冻30min，低温真空抽干至粉状，保存于-20℃冰箱，用于提取窖泥微生物总DNA；

所述步骤(1)-(3)中，洗涤用灭菌生理盐水、无水乙醇、无菌超纯水加入量，按窖泥与溶液的重量体积比1∶1-2添加。

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