CN102643331A - 一种适用于肺癌分子影像诊断的小分子肽探针及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于肺癌分子影像诊断的小分子肽探针及其制备方法。所述小分子肽探针由放射性同位素^99mTc标记小分子肽后所得，所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种，该小分子肽能与肺癌细胞特异性结合。本发明的小分子肽探针可在体内对肺癌细胞示踪成像，适用于肺癌患者的分子影像诊断及鉴别诊断，可增加肺癌成像的敏感性和特异性，对提高肺癌的早期阳性诊断率有重要的临床意义。

Description

一种适用于肺癌分子影像诊断的小分子肽探针及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及适用于肺癌分子影像诊断的特异性小分子肽探针及其制备方法，以及其在制备肺癌影像诊断试剂中的应用。

背景技术

肺癌已成为我国人群特别是城市居民中发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，目前肺癌高死亡率的主要原因是因为80%以上的肺癌就诊时已属晚期，失去了最佳的治疗时机，而I期肺癌患者的5年生存率可达80%以上。肺癌的早期诊断将有助于提高肺癌患者生存率和降低死亡率。临床肺癌诊断的主要手段目前仍是影像技术，随着现代影像检查设备和技术的不断改进和发展，明显提高了肺癌早期诊断的阳性率，但无论CT、PET，还是MRI技术，对于肺癌早期诊断的特异性和敏感性均有待于提高。分子影像学的创建为肺癌高特异性和敏感性诊断方法的建立提供了一个非常重要的研究平台，分子探针是分子影像技术的关键因素，也是分子影像学研究的先决条件。目前研究最为广泛的分子探针根据所用影像学技术的不同，可分为：（1）核医学探针。同位素标记α_vβ₃整合素和VEGF的分子探针在动物模型中显示了令人满意的肿瘤血管成像。（2）MRI探针。Gd-DTPA标记α_vβ₃整合素单克隆抗体或小分子肽RGD，MRI显示兔或裸鼠动物模型肿瘤血管，发现标记α_vβ₃整合素单克隆抗体能显著提高MRI的敏感性。（3）光学探针。由于光学成像技术的穿透力有限，光学探针仅用于小动物模型的研究。

小分子探针相对于大分子抗体探针，具有分子量小，组织穿透性好，更易到达靶细胞，无免疫源性，可大批量合成，制作成本低及易于标记等特点，因此，小分子探针较大分子探针有更好的临床应用前景。目前已应用于临床影像研究的小分子探针有（1）生长抑素探针适用用于胃肠道和支气管神经内分泌癌、垂体腺瘤、副神经节瘤等诊断；（2）CCK探针用于甲状腺髓样癌诊断；（3）蛙皮素探针适用于乳腺癌和前列腺癌的诊断；（4）RGD探针适用于各种实体肿瘤的血管显像。迄今为止国内外尚未见有关肺癌特异性分子探针的成功研究报道。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的一个目的是提供一种能与肺癌细胞特异性结合的小分子肽。

本发明的另一个目的是提供一种适用于肺癌分子影像诊断的特异性小分子肽探针及其制备方法。

本发明的另一个目的是提供上述小分子肽探针在制备肺癌影像诊断试剂中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

一种小分子肽，其为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种。

所述的小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO.1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

一种小分子肽探针，由放射性同位素标记小分子肽后所得，所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种。

所述小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO.1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

所述放射性同位素为^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F-FDG、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu中的任一种。

一种小分子肽探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）将小分子肽与螯合剂S-acetyl-MAG₃（巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯）偶联后得到小分子肽-MAG₃复合物；

（2）用放射性同位素标记小分子肽-MAG₃复合物得到小分子肽探针；

所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种；

所述放射性同位素为^99mTc。

所述小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO.1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

以上所述的小分子肽探针在制备肺癌分子影像诊断试剂中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的小分子肽能与肺癌细胞特异性结合，为肺癌的特异性诊断及治疗提供了新的方法；

（2）本发明利用放射性核素标记小分子肽制备的小分子探针，可在体内对肺癌细胞示踪成像，适用于肺癌患者的分子影像诊断及鉴别诊断，可增加肺癌成像的敏感性和特异性，对提高肺癌的早期阳性诊断率有重要的临床意义。

附图说明

图1 是小分子肽cNGEGQQc-MAG₃的质谱分析图。

图2  小分子肽cNGEGQQc-MAG₃的HPLC分析图。

图3采用纸层析法分析小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc的体外稳定性实验结果图（A是丙酮系统；B是氨水/乙醇/水混合物系统）。

图4 小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc在小鼠体内的分布情况图。

图5 ^99mTc-cNGEGQQc在兔体内的SPECT动态显像图（1帧/秒，采集1min）。

图6 ^99mTc-cNGEGQQc在兔体内的SPECT动态显像图（1帧/min，采集5min）。

图7 ^99mTc-cNGEGQQc在兔体内的SPECT动态显像图（1帧/5min，采集30min）。

图8利用ROI感兴趣区分析技术获取心脏、肝脾、肾脏和膀胱的时间-放射性曲线图（1为兔动态显像图各脏器ROI感兴趣区勾画；2为心脏的时间-放射性曲线图；3为脾脏的时间-放射性曲线图；4为肝脏的时间-放射性曲线图；5为肾脏的时间-放射性曲线图；6为膀胱的时间-放射性曲线图）。

图9静脉注射^99mTc-cNGEGQQc后1.5h兔前位及后位全身SPECT显像。

图10肺癌裸鼠模型（L78细胞）小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc SPECT显像图（箭头所示为移植瘤部位放射性浓聚情况）。

图11肺癌裸鼠模型（H1975细胞）小分子肽探针SPECT显像图（A图为尾静脉注射^99mTc-cNGEGQQc后2h的显像图；B图为尾静脉注射^99mTc-cNAQAEQc后2h的显像图）（箭头所示为移植瘤部位放射性浓聚情况）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1、利用固相合成方法制备小分子肽cNGEGQQc（SEQ ID NO.1）

（1）称取1g表面具有NH₂活性基团的树脂珠子，用二甲基酰胺洗涤3次，然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分肿胀；

（2）加入半胱氨酸和N,N'-二异丙基碳二亚胺，室温下反应2小时后，用DMF洗涤珠子5次，接着加入20%（v/v）的哌啶，在室温下反应5 min，再加入20%（v/v）的DMF，反应15 min，完全脱去Fmoc保护基；

（3）按步骤（2）方法依次偶联L型天冬酰胺-L型甘氨酸-L型谷氨酸-L型甘氨酸-L型谷氨酰胺-L型谷氨酰胺-D型半胱氨酸；

（4）将连接完最后一个氨基酸的珠子经25%（v/v）的三氟乙酸洗涤一次，蒸馏水洗涤3次；

（5）用无水氟化氢将小分子肽从树脂珠子上切下，同时脱除所有侧链保护基。还原产物在30%（v/v）乙酸高度稀释下用碘作氧化剂，使分子内2个半胱氨酸氧化形成二硫键。经Sephadex-G-15柱层析，透析和高效液相层析分离纯化，获得在反相高效液相层析（分析柱）为单一峰的高纯度产物。

2、小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc的制备

（1）小分子肽与螯合剂S-acetyl-MAG₃（巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯）偶联后得到复合物cNGEGQQc-MAG₃ [乙酰化巯基乙醇-GGG(D-Cys) cNGEGQQc(D-Cys)]，理论分子量为1125.05，质谱测量其分子量为1146.84（见附图1），HPLC法监测其纯度为96%（见附图2）。螯合剂S-acetyl-MAG₃与小分子肽的偶联采用下列技术路线： ① SATA（s-乙酰基巯基乙酰-N-羟基丁二酰亚胺）的合成：巯基乙酸和乙酸酐 (二者摩尔比为 1:1.1)在室温下反应 4d，反应产物以减压蒸馏 (115～125℃、2～3mmHg)纯化，得到高纯度的乙酰化巯基乙酸。75mmol乙酰化巯基乙酸与75mmol羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）溶解于150ml二氧杂环乙烷中，在4℃条件下与75mmol二环己基碳二亚胺（DCC）反应 16h，过滤去除二环已脲，溶剂经真空冻干后用异丙醇2次重结晶而得到SATA。②小分子短肽cNGEGQQc-MAG₃复合物的合成：按照上述1的方法，采用自动多肽合成仪常规固相法合成目标多肽cNGEGQQc，并在合成过程中直接在其N端连接3个甘氨酸，且在最后一个甘氨酸接完后，去保护，加入1倍摩尔量的SATA、7倍摩尔量的3mDIEA (二异丙基乙胺)及3倍摩尔量的HBTU (1-羟基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸盐) 和3倍摩尔量的HOBT（1-羟基苯并三唑）反应60min，茚三酮反应检测为黄色即可。然后用NMP (N-甲基吡咯烷酮) 、DCM（二氯甲烷）交替洗6次抽干。把切割液（1ml乙二硫醇，1ml苯甲硫醚，0.5g苯酚，0.4ml H₂O，0.1ml三异丙基硅烷）倒入树脂中，反应7h左右后抽滤，用乙醚沉淀、离心4次，最后晾干，纯化得cNGEGQQc-MAG₃，产物经HPLC 鉴定。即在合成cNGEGQQc过程中直接完成与MAG₃的偶联。

（2）采用间接标记法实现^99mTc标记复合物cNGEGQQc-MAG₃，具体方法参照文献进行（Winnard P, et al. Nucl Med Biol, 1997, 24：425-432），并略作改进。标记缓冲液为0.25 mol/L的NaHCO₃、0.18 mol/L氨水、0.125 mol/L醋酸铵混合液，反应总体积125μl，小分子肽（cNGEGQQc-MAG₃）含量为20μg，新鲜淋洗的^99mTcO₄ ^-淋洗液的放射性活度为3.7×10⁷Bq，摇匀后水浴箱中反应完成标记。

对影响标记结果的5个重要因素分别选取4种不同水平：酒石酸亚锡用量分别为0.25、1、5、10μg/ul；反应体系最终pH值分别为2、4、7.6、10.0；反应温度分别为25、37、75、100℃；反应时间分别为10、20、30、60min （反应过程中氮气密封）；转鳌合剂酒石酸钾钠的终浓度分别为0.5、1、3.5、10μg/μl，采用正交设计进行分析，以寻找最佳标记条件。因素与水平设计见表1，正交表及实验结果见表2。

经正交设计得出最佳标记条件为：转鳌合剂酒石酸钾钠的终浓度为3.5μg/μl；酒石酸亚锡用量为5μg/μl。反应体系pH 7.6，25℃反应30min完成标记。

3、小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc的标记质量和体外稳定性鉴定

采用纸层析法测定标记率，具体方法：将标记后的混合物在层析纸一端点样，分别放入展开剂乙醇∶氨水∶水(2∶1∶5)（系统1）和丙酮（系统2）中，待样品移至层析纸的另一端时，将层析纸取出晾干，并把层析纸按10等份剪下并放入试管中，用γ免疫计数器测定各试管的放射性，收集两个峰的放射性计数，计算每个峰的放射性百分率[放射性百分率=（放射性计数/总放射性计数）×100%]和标记率（标记率=系统1中标记肽和^99mTc的放射性百分率-系统2中^99mTc的放射性百分率）。选用最佳标记条件标记小分子肽，纸层析法测定标记率为84%~95%，重复性好。

为评价小分子肽探针的体外稳定性，采用纸层析法测定其放射化学纯度，放射化学纯度=系统1中标记肽和^99mTc的放射性百分率-系统2中^99mTc的放射性百分率。经HPLC纯化后的^99mTc-cNGEGQQc-MAG₃在室温下放置24 h，放置0h和24h后的放射化纯度分别为95%和91%，表明标记物在室温条件下稳定性良好；为进一步评价小分子肽探针在模拟体内环境中的稳定性，将小分子肽探针放置人新鲜血清中，37℃下温育24 h，其放射化学纯度由0h的95%，逐步下降至24h的85%，表明标记小分子肽探针在血清中稳定性良好（见附图3）。

4、小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc的体内生物学分布分析

（1）取健康雄性昆明小鼠15只，4-6周龄，体重19-21g，尾静脉注射2.96MBq（0.1ml）前述小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc，分别于注射后1、3、6、12、24h分别各处死3只小鼠，取血液及其它主要脏器，称重并测定放射性计数，经放射性衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率(%ID/g)。采用GE公司的Millennium VG SPECT，探头配备低能高分辨准直器，能峰中心为140 KeV，窗宽20%，矩阵128×128，放大倍数为1。

SPECT显像结果表明：在健康小鼠各个组织器官中，肾脏和肝脏的放射性明显高于其它脏器，其中又以肾脏的放射性最高，清除时间长，表明本发明小分子肽探针主要经肾脏代谢；随着观察时间的延长，各脏器的的放射性逐渐下降，胃肠的放射性变化比较平稳，说明小分子肽探针在体内稳定，没有游离^99mTc释出，肌肉组织对小分子肽探针的摄取也较少，小分子肽探针在小鼠体内的放射性分布结果详见表3和附图4。由于肺脏、肌肉及骨骼对本发明小分子肽探针的摄取较少，本底将较低，因此，在临床肺癌患者显像时，受周围组织的影响较少，肿瘤显像清晰。

（2）取健康雄性日本大耳兔2只，分别仰卧位固定于木制实验台上，探头视野中心对准兔胸腹部，确保整个兔身均在探头视野范围内，经耳缘静脉注射生理盐水稀释的前述小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc 0.5 ml（74 MBq）/只，立即以1帧/min采集60 min，并于90、120、180、240 min各预置计时2 min采集1帧，观察兔体内组织器官放射性影像的动态分布变化。对获得的兔后位系列动态图像进行感兴趣区（ROI）分析，对心前区、肝、脾、双肾及膀胱划感兴趣区，进行ROI分析，分别建立时间-放射性曲线（见附图5~9）。

5  小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc对人肺癌裸鼠动物模型中肿瘤诊断价值的评价

（1）人肿瘤裸鼠动物模型的建立。实验用细胞分别为：两种人非小细胞肺癌细胞包括NCI-H1975（腺癌）和L78（鳞癌）、MCF7（乳腺癌）、HT-29（大肠癌）及肝癌（HepG2），常规方法培养至对数生长期，胰蛋白酶消化，离心除去消化液，PBS洗涤2次，加入无血清培养液制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶/ml，分别于裸鼠背部皮下注射细胞悬液0.2ml，建立不同肿瘤细胞的动物模型，每种肿瘤各4只裸鼠模型，定期观察肿瘤生长情况及裸鼠的一般情况如精神、饮食及体重等，待肿瘤直径达1cm左右时，准备用于实验。

（2）小分子肽探针在肿瘤裸鼠动物模型中成像观察。采用SPECT成像技术对前述小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc在NCI-H1975、L78、MCF7、HT-29及HepG2裸鼠动物模型体内显像，每只小鼠注射0.1ml小分子肽探针，另取0.1ml ^99mTc标记非相关小分子肽（^99mTc-cNAQAEQc）作为对照。于鼠尾静脉注药后即刻、0.5h、1h、2h、3h、5h、6h、24h进行SPECT显像，连续追踪观察小分子肽探针在动物模型体内分布的变化，记录肿瘤开始显影时间及浓集高峰时间，分析二种不同肺癌及其它肿瘤成像的效果及特点。

注射小分子肽探针后SPECT平面显像可见，小分子肽探针主要浓聚于双侧肾脏和膀胱, 肝脏组织也有部分放射性摄取，此外肠道有少量摄取。膀胱内可见放射性浓聚，四肢和头胸部显像剂分布稀疏，随后膀胱内放射性持续浓聚，肿瘤（L78）的放射性分布呈减低趋势（见附图10）。

注射小分子肽探针30min后，肿瘤隐约显影，随着时间的延长, 肿瘤内小分子肽探针浓聚逐渐增多，图像清晰易辨。附图11为注射小分子肽探针后2h时显像，可见肿瘤（H1975）显像清晰，而注射^99mTc标记阴性小分子肽进行平面显像示肿瘤部位显像模糊。

（3）小分子肽探针在肿瘤裸鼠动物模型的体内生物分布

注射小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc后2h，肿瘤内放射性浓聚最明显，放射性标记物在肾脏的摄取最高，脑部的摄取最低。靶/非靶( T/NT) 摄取比值显示肿瘤与脑、肿瘤与肌肉的摄取比值较高，分别为10.32和4.76, 而肿瘤与血液摄取比值为1.46（见表4）。

由以上实验可见，小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc对两种非小细胞肺癌细胞（腺癌和鳞癌）的肿瘤病灶均有较好的成像效果，而作为阴性对照的非相关小分子肽在动物模型中未见显像。另外，小分子肽探针^99mTc-cNGEGQQc在乳腺癌、大肠癌及肝癌的动物模型中均无显像。表明本发明小分子肽探针能作为载体，将诊断型同位素^99mTc经过血液循环运送至肺癌移植瘤内，并与肺癌细胞发生特异性结合。

本实施例采用目前临床广泛应用放射性同位素^99mTc标记肺癌细胞特异性小分子肽制备的肺癌分子影像探针，根据本发明建立的标记方法为基础，可以不断更换造影剂如¹¹¹In、¹⁸F-FDG、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu等，从而获得适用于SPECT、PET/CT、MRI等影像设备的理想肺癌分子影像探针。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110>  南方医科大学珠江医院

<120>  一种适用于肺癌分子影像诊断的小分子肽探针及其制备方法

<130> 

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列

<223>  Cys为D型半胱氨酸

<400>  1

Cys Asn Gly Glu Gly Gln Gln Cys

1               5

Claims (8)

1.一种小分子肽，其为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种。

2.根据权利要求1所述的小分子肽，其氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO.1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

3.一种小分子肽探针，由放射性同位素标记小分子肽后所得，所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种。

4.根据权利要求3所述的小分子肽探针，其特征在于，所述小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO.1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

5.根据权利要求3所述的小分子肽探针，其特征在于，所述放射性同位素为^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F-FDG、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu中的任一种。

6.一种小分子肽探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）将小分子肽与螯合剂S-acetyl-MAG₃（巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯）偶联后得到小分子肽-MAG₃复合物；

（2）用放射性同位素标记小分子肽-MAG₃复合物得到小分子肽探针；

所述小分子肽为含有XGXG结构的8肽分子，其中，G表示L型甘氨酸，X为20个氨基酸中的任一种；

所述放射性同位素为^99mTc。

7.根据权利要求6所述的小分子肽探针的制备方法，其特征在于，所述小分子肽的氨基酸序列为cNGEGQQc（SEQ ID NO.1），其中，c表示D型半胱氨酸，N表示L型天冬酰胺，G表示L型甘氨酸，E表示L型谷氨酸，Q表示L型谷氨酰胺。

8.权利要求3～5任一项所述的小分子肽探针在制备肺癌分子影像诊断试剂中的应用。

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