CN102641292A

CN102641292A - 促血管及周边组织修复或再生的制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102641292A
Application number: CN2011100419261A
Authority: CN
Inventors: 顾丽娅; 杨子江; 顾茂健
Original assignee: Individual
Current assignee: Beikang Medical Technology Co Ltd; Shengtaiyingnuo Jiaxing Medical Technology Co ltd
Priority date: 2011-02-21
Filing date: 2011-02-21
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2031-02-21
Also published as: CN102641292B

Abstract

本发明涉及一种促进血管及周边组织再生或修复的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，进而在低血清条件培养上述MSC细胞，最后分离MSC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的促进血管及周边组织再生或修复的制剂能够显著的促进血管组织的新生或受损血管组织的修复。

Description

促血管及周边组织修复或再生的制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种可以促进血管及周边组织修复或再生的制剂及其制备方法。

背景技术

各类血管疾病，例如冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常；脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩；外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压，糖尿病，慢性炎症，缺血性肠炎，表皮缺血，颈动脉闭塞，及局部或系统性缺血引起的梗塞性痴呆等都是致死率或发病率很高的疾病，在各类血管疾病中，动脉粥样硬化所导致的血栓及血管堵塞是最常见和最重要的发病机理。而由于干细胞具有的促进血管再生和器官功能恢复的特殊功效，因此，干细胞疗法是近年来在治疗各种血管疾病中最受人期待的新发展方向。

干细胞是一种具有多向分化潜能和自我复制能力的早期未分化细胞。它的特性有：具有自我复制能力和多向分化潜能；终生保持未分化或低分化特征；缺乏分化标记；分化情况受所处微环境的影响；通过对称性和非对称性分裂两种方式生长；具有分裂的慢周期性；绝大多数干细胞处于G0期等。按发生学来源可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是来源于早期中胚层的一种具有多向分化潜能的成体干细胞。MSC理论上可分化为所有中胚层来源的细胞，例如内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞等，并且具有低免疫活性，同种异体移植不会产生免疫排斥。

MSC广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，也可从胎儿脐血中分离得到，还存在于胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肝脏、脂肪、肌肉、皮肤等多种组织中。MSC不仅具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定。其中多向分化潜能被认为是MSC最重要的生物学特征之一。目前认为MSC在体内的分化主要取决于所处的环境，在梗塞心肌处就分化为心肌，在愈合的伤口处则主要分化为成纤维细胞。在体外的诱导分化则取决于诱导物，在不同的诱导条件下，可分化为不同的组织细胞。

MSC已经被证明可以分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞等血管结构，此外，MSC还能在移植的局部分泌一些促血管生成的生长因子和细胞活素，如血管内皮生长因子。MSC在体内外均可增加局部血管内皮生长因子的水平，从而促进局部血管的新生。MSC移植还可以减少心肌细胞的凋亡，并改善心脏功能。此外，尚有实验证实植入MSC后可以增加局部胰岛素样生长因子的表达，同样也具有很强的促血管生成作用。因此，MSC移植后的促血管生成作用推测应包括两个方面：①MSC能分化为新生的血管内皮、血管壁平滑肌及管壁胶原细胞。②MSC移植后分泌促血管生成物质。

事实上，移植的MSC在参与缺血组织修复中分泌出的生长因子和细胞活素，可借由MSC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于受损血管及周边组织的修复和再生，从而恢复缺血性坏死的组织的相应功能。因此，MSC在体外人工环境中分泌的促血管及周边组织修复或再生的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂，用于克服现有药物的不足，为临床治疗缺血性疾病提供一种新的治疗药物。

上述缺血性疾病主要指由于动脉粥样硬化或其他类血栓，血脂异常导致的血管阻塞类缺血性疾病，具体包括并不局限于：在冠状动脉中产生粥状硬化所引起的冠心病，心绞痛、心肌梗塞、心律失常；脑动脉硬化引起的中风，脑缺血、脑梗塞，脑萎缩；外周动脉粥样硬化引起的肢端缺血，坏疽，坏死，间歇性跛行；以及继发性高血压，糖尿病，慢性炎症，缺血性肠炎，表皮缺血，颈动脉闭塞，及局部或系统性缺血引起的梗塞性痴呆等。

本发明的目的还在于提供一种制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法，该方法步骤为：

1)从健康人血液中通过白细胞置换(leukapheresis)获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物(lipoaspirate)中直接提取MSC；

2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；

3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；

4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促血管及周边组织修复或再生制剂。

本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。可选步骤中所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为：将所获得的骨髓或外周血液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque(GE healthcare)、Histopaque-1077(Sigma)，或其他公司同类产品，优选为Histopaque-1077；适用温度范围为15到25℃，优选为25℃。具体操作为：将含有骨髓或外周血及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞其内所含多种细胞亚群，呈多形性。

本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并可添加有heparin(0-100U/ml)。培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养。

本发明所述制备能够有效的促进促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞的步骤为以下所述方法①至④中的一种：

方法①：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

方法②：将单核细胞与fibrin微球(直径50-250微米，可由商业途径获得，如Forticell Bioscience)共同培养1-2天，每100-1000mg fibrin微球可吸附1×10⁶至1×10⁸个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选(

由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

方法④：将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50-100ml)在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶(collagenase type I，II，Sigma-Aldrich)消化(酶的浓度范围0.05％-0.1％)，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种：

方法①：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

方法②：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并可添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)；并可添加有heparin(0-100U/ml)；培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

在按照上述方法①或②培养完成后，收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去MSC细胞。

本发明所述制备能够有效的促进血管及周边组织再生或修复的制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括：

①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。

②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管及周边组织生长因子及细胞活素如MCP-1，EGF，MMP-9，MMP-2，PDGF，SDF-1，FGF，VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics)，细胞活素阵列(cytokine array)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-Plex^TM细胞因子测试。

③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。

附图说明

图1：本发明所述促血管及周边组织修复或再生制剂对成体内皮细胞的存活影响及对成纤维细胞的刮伤愈合和迁移功效。

图2：本发明所述促血管及周边组织修复或再生制剂对大鼠动脉环微血管新生及周边组织新生功效。

具体实施方式

以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。

实施例1.单核细胞的制备。

将抽取出的骨髓或者由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液加入密度梯度剂Histopaque-1077(Sigma)，每15mL Histopaque中加入30mL骨髓提取液或者外周血白细胞悬液。将骨髓提取液或外周血白细胞悬液在梯度剂的存在下于400G的速度下常温离心30分钟。分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含骨髓系单核细胞的悬浮液。

实施例2.MSC细胞的获取。

针对I类MSC细胞的获取方法：将骨髓或外周血单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

针对II类MSC细胞的获取方法：将骨髓或外周血单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选(

由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，去除悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养21天。所获II型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

针对III类MSC细胞的获取方法：将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50-100ml)在pH＝7.4，0.9％的医用生理盐水中洗净，用II型胶原酶(collagenase type II)消化(质量浓度0.075％)，消化条件为于37℃下震荡30分钟。将消化并过滤出的单核细胞在添加有10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米1×10⁶个细胞的密度培养2天，将贴壁细胞继续培养21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，大量表达细胞表面受体CD90，CD105及CD73，并且不含CD14，CD34，CD45等造血干细胞及单核细胞受体。

实施例3.促血管及周边组织修复或再生制剂的获取。

将实施例2所获得的各型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％的环境中在0.9％的医用生理盐水中培养2天(每平方厘米2×10⁵个细胞)，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的MSC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为0.2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除并分装于-80℃冷库冷藏备用。视具体情况，每1x10⁶个MSC细胞可以制备2-5ml所述促血管及周边组织修复或再生制剂。

实施例4.促血管及周边组织修复或再生制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。

实施例3所制得的促血管及周边组织修复或再生制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokine array)鉴定(由R&D Systems购买)，此促血管及周边组织修复或再生制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子：MCP-1、EGF、IL-6、IL-8、MMP-9、SDF-1、HGF、VEGF以及PDGF。通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)，其中有效成分的含量为，MCP-1：5-50ng/ml；IL-8：1-5μg/ml；SDF-1：0.5-5ng/ml；IL-6：5-20ng/ml；PDGF-BB：0.1-10ng/ml；VEGF：1-20ng/ml。其他成分组成见表1。

表1.本发明所述促血管及周边组织修复或再生制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)

ANG-1	IGF-II	MCP-4	SDF-1
				ANG-2	IL-1	M-CSF	Sfrp

bFGF	IL-11	MMP-13	TB4
				b-NGF	IL-12	MMP-2	TGFbeta
EGF	IL-6	MMP-9	TIMP-1
				FGF-7	IL-7	PA	TNFalpha
G-CSF	IL-8	PDGF	TSP-1
				GM-CSF	LIF	PIGF	TSP-2
HGF	MCP-1	RANTES	VEGF
				IGF-I	MCP-2	SCF	VEGF-D

实施例5.体外检测促血管及周边组织修复或再生制剂对成体内皮细胞的存活影响。

将人脐静脉内皮细胞HUVEC(此细胞可通过商业途径购买，例如：ATCC细胞库)以每孔3×10³个细胞的密度接种于96孔板中，在含10％人血清白蛋白或自体血清及添加有1％的生长因子添加剂EGM(由瑞士Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1)的EBM-2培养基下中培养24小时，弃去原培养基，将细胞重新置于本发明所述的促血管及周边组织修复或再生制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白或自体血清的PBS，pH＝7.4)中，于37℃，5％二氧化碳浓度的细胞培养箱中继续培养24小时，用

NF细胞增殖试剂盒(由Invitrogen公司购买)检测活细胞含量(结果见图1A)。结果显示，此促血管及周边组织修复或再生制剂能够显著增加HUVEC细胞在低血清环境中的存活率，在发明所述的促血管及周边组织修复或再生制剂中培养的HUVEC细胞的存活量为阴性对照组的2.36±0.24倍(*：p＜0.05)。

使用Annexin V染色法对HUVEC细胞在低血清培养下的细胞凋亡率进行检测(结果见图1B)，其中凋亡细胞被Annexin V特异性染色后用流式细胞仪计数。结果显示，本发明所述的促血管再生或新生制剂能够显著的降低HUVEC细胞在低血清环境中的凋亡率，在发明所述的促血管再生或新生制剂中培养的HUVEC细胞的凋亡率仅为阴性对照组的56.3±2.8％(*：p＜0.05)。

实施例6.体外检测促血管及周边组织修复或再生制剂对成纤维细胞的刮伤愈合(Scratch woundhealing)功效及迁移功效。

将成纤维细胞(fibroblast)细胞(此细胞可通过商业途径购买，如Promocell GmbH)以每孔1×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中，在含10％人血清白蛋白或自体血清的DMEM/F12培养基下中培养24小时，弃去原培养基并用移液管尖将在板底的细胞层上划出一道细胞空白区域，将细胞重新置于本发明所述的促血管及周边组织修复或再生制剂或阴性对照培养基(即只含有1％人血清白蛋白或自体血清的PBS，pH＝7.4)中继续培养10小时后检测此刮伤愈合(Scratch wound healing)的程度(即面积比；结果见图1C)。结果显示，本发明所述的促血管及周边组织修复或再生制剂能够显著的加快fibroblast细胞在低血清环境中的刮伤愈合速度，相比对照组的愈合速度(刮伤面积减少40.4±2.8％)，本发明所述的促血管再生或新生制剂促血管及周边组织修复或再生制剂能够更有效的减小83.4±3.6％的刮伤面积(*：p＜0.05)。

实施例7.大鼠动脉环微血管新生及周边组织新生功效检测。

将大鼠腹腔主动脉切成1毫米的环状，置于24孔板中，并用1mg/ml浓度的胶原蛋白包被，置于37℃下凝胶化5分钟。将包被后的主动脉环置于500μl本发明所述的促血管及周边组织修复或再生制剂或阴性对照培养基内(即只含有1％人血清白蛋白或自体血清的PBS，pH＝7.4)培养10天，计算主动脉环外伸展出的再生或新生微型血管状结构的数量(结果见图2)。结果显示，本发明所述的促血管及周边组织修复或再生制剂具有激发血管新生或再生的功效，培养10天后，促血管及周边组织再生制剂组(图2B)中的新生微型血管状结构的数量显著多于阴性对照培养基(图2A)，(p＜0.05)。此新生微型血管状结构的构成(图2C)为内皮细胞(BS-1 lectin特异性染色)，平滑肌细胞(SMA特异性染色)及成纤维细胞(未染色)的混合组织。

Claims

1.一种促进血管及周边组织再生或修复的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：

1)从健康人血液中通过白细胞置换获取外周血单核细胞，或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物中直接提取MSC；

2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的健康人血液或骨髓的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置换。

3.根据权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的从血液中或骨髓中通过密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂为Ficoll-Paque、Histopaque-1077或其他同类产品，温度为15～25℃，离心力为200g-500g，时间20-40分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液。

4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基为M119、DMEM、F12、RPMI-1640中的一种，并添加有heparin(0-100U/ml)，培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清，在预设条件为培养温度37℃，二氧化碳浓度为5-7％的细胞培养箱中培养。

5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的培养单核细胞以获得MSC细胞的方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：

方法①：将单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。

方法②：将单核细胞与fibrin微球共同培养1-2天，每100-1000mg fibrin微球可吸附1×10⁶至1×10⁸个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7-21天，获I型MSC。

方法③：将单核细胞通过CD14，或CD45特异性抗体进行磁珠分选，筛选出不含CD14或CD45的单核细胞亚群，将此CD14^-或CD45^-单核细胞亚群以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7-21天，获II型MSC。

方法④：将人脂肪吸取物50-100ml在pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水中洗净，用I型和II型胶原酶消化(酶的浓度范围0.05％-0.1％)，消化步骤为置于37℃条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5×10⁵至2×10⁶个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7-21天，获III型MSC。

6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的一种：

方法②：将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的一种，并添加有0.5-1％的生长因子添加剂EGM、EGM-MV、EGM-2或EGM2-MV中的一种；或添加有内皮细胞生长因子ECGF(10-100μg/ml)；并可添加有heparin(0-100U/ml)；培养基中另可含有质量比为5％至20％的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为0.5％至2％，温度为37℃的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)或0.9％的医用生理盐水，并可添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于，不添加1％的医用人血清白蛋白或自体血清。

8.根据权利要求1-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述MSC细胞为I型MSC细胞。

9.一种由权利要求1-8任一所述的方法制备获得的制剂。

10.权利要求9所述的制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。