CN102639153B - 用亲水α‑羟基膦酸共轭物处理水不溶性纳米微粒，这样改性的纳米微粒及其作为造影剂的用途 - Google Patents

用亲水α‑羟基膦酸共轭物处理水不溶性纳米微粒，这样改性的纳米微粒及其作为造影剂的用途 Download PDF

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Abstract

本申请公开用具有亲水部分的α‑羟基膦酸共轭物处理水不溶性纳米微粒，特别是可用于诊断成像比如MR和X‑射线成像的金属和金属化合物的纳米微粒，以使纳米微粒充分亲水以用于诊断成像。公开的改性亲水纳米微粒中有这样的：其中改性共轭物的亲水部分是基于环氧乙烷的聚合物和共聚物和两性离子，纳米微粒由过渡金属氧化物比如超顺磁性氧化铁和氧化钽构成。公开充分亲水以形成稳定含水胶体混悬液的纳米微粒。还公开用改性亲水纳米微粒作为造影剂的诊断成像比如MR和X‑射线。

Description

用亲水α-羟基膦酸共轭物处理水不溶性纳米微粒，这样改性 的纳米微粒及其作为造影剂的用途
背景
本发明主要涉及处理纳米微粒，特别是基于过渡金属氧化物的纳米微粒，以致使其足够亲水以形成稳定的含水混悬液，因此可用于需要亲水性的应用，比如在诊断成像比如MRI和X-射线中的造影剂，涉及所述处理产生的亲水纳米微粒，涉及所述稳定的含水混悬液和在所述成像中所述亲水纳米微粒作为造影剂的用途。纳米微粒，即直径适当地测量为纳米的微粒，已被视为具有广泛多种最终用途。这些用途有些需要一定程度的亲水性，但有些纳米微粒的基础材料可能缺乏这种属性。例如，用作MR和X-射线成像造影剂的具有适当成像性质的纳米微粒通常基于缺乏合适亲水性的过渡金属氧化物。因此已试图改变这些纳米微粒的表面性质以与含水介质更可相容，使这些纳米微粒能够形成稳定的含水混悬液。但是，在一些应用比如作为造影剂时，还期望纳米微粒具有单分散性粒度分布，通过在基于碳水化合物的生物基质中与羧酸根基团络合导致多分散性粒度分布(比如不均匀聚集物)的任何表面处理都是有问题的。此外，在一些应用比如体内用作造影剂时，期望表面处理具有充分限定的可再现结构和经得起安全试验。基于甲硅烷的表面处理可能有问题，因为它们可发生自缩合，阻碍这些目标。
此外，需要不因纯化而遭受亲水性降级和在含有电解质的含水介质中表现混悬稳定性的亲水纳米微粒。例如，在制备体内用于人受试者的造影剂时，通常将候选纳米微粒过滤，预期在等渗含水介质即含有约150mM NaCl的介质中显示混悬液稳定性。已尝试单独用磷酸盐基材料(比如聚磷酸)或者连接亲水部分(比如聚乙二醇)，采用磷酸盐粘附于过渡金属氧化物以赋予纳米微粒这种类型的亲水性。在这方面，优选具有基本中性ζ电位的亲水部分体内用于人受试者以避免与人组织的不良相互作用。但是，这样的尝试尚未得到这样亲水改性的纳米微粒以便过滤后在150mM NaCl含水介质中作为胶体混悬液表现期望的稳定性。例如，这样的尝试尚未得到这样的混悬液，其在30kDa截止(cut off)的切向流过滤和在这样的含水介质中贮存超过1周后，通过动态光散射(DLS)测量表现基本稳定(流体力学直径(DH)不增加)的粒度。
简述
本发明涉及以下发现：α-羟基膦酸与亲水部分经携带α-羟基的碳原子连接的共轭物作为水不溶性纳米微粒，特别是基于过渡金属氧化物的纳米微粒的亲水性改善剂的优越性能。共轭物连接(linkage)保护α-羟基膦酸的所有3个羟基，据信这使共轭物对纳米微粒超级粘附。在一些实施方案中共轭物具有以下结构I：
其中S是间隔基，L是S与R之间的连接，R是亲水部分，m和p是1-5，n和o是0-5。在一些实施方案中，S是直接键、未被取代或取代的脂族或环脂族基团、未被取代或取代的芳基、杂脂族基团或杂芳基，有时是长度为1-10个碳原子的直链烷基，L是直接键、羰基、醚基、酯基、仲胺或叔胺、季胺基、酰氨基、氨基甲酸酯基或脲基。合适的纳米微粒不是典型意义的溶于水的那些，其中个体溶质分子以糖或食盐在水中的方式均匀地分散在溶剂中。因此本发明包括用α-羟基膦酸共轭物处理在水中具备一定程度可悬浮性的纳米微粒和所得的粘附共轭物的纳米微粒。
特别关注的是共轭物不包括对人组织可具有不良反应的基团或部分。因此，方便的是当粘附于纳米微粒时，共轭物表现约-40mV-40mV，优选约-15mV-15mV的ζ电位，尤其关注的是当这样粘附时其表现基本中性的ζ电位。这通过利用两性离子或非离子部分作为亲水部分方便地完成。
亲水部分可以为单体或聚合物，但方便的是它们具有基本中性的净离子电荷。在聚合物亲水部分中，尤其关注的是至少部分基于环氧乙烷单元的那些聚醚，比如环氧乙烷/环氧丙烷共聚物和聚乙二醇。不带净电荷的单体亲水部分，特别是两性离子，方便地用于处理将用于人受试者体内的纳米微粒的共轭物中，因为表征它们的安全性评价时更容易。其中尤其关注的是基于4-哌啶羧酸的那些。
对于用于处理将用于人受试者体内的纳米微粒的共轭物，还方便的是α-羟基膦酸与亲水部分之间的连接是烃，即在结构I中A是单键。这将这样处理的纳米微粒与人组织之间任何相互作用的机率减到最小。在这方面，特别关注的是以下结构II和III的共轭物：
共轭物优选充分亲水，以便当将其以约2个共轭物每纳米微粒的比率处理纳米微粒时，使纳米微粒能够以约500nm或更小的DH(通过DLS测定)在含水介质中形成稳定的胶体混悬液。特别方便的是它使这样处理的纳米微粒足够亲水，以便在等体积正辛醇与0.1MpH7.0 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液之间表现小于1的分配系数对数值。
用共轭物处理以实现更大亲水性的纳米微粒优选基于过渡金属和过渡金属化合物，比如氧化物、碳化物、硫化物、氮化物、磷化物、 硼化物、卤化物、硒化物、碲化物及其组合。特别关注的是氧化物。据信氧化物结构促成α-羟基膦酸的粘附。过渡金属化合物可用于制备用于MR和X-射线成像的造影剂。元素周期表第三周期的过渡金属可用于形成表现顺磁性和方便地表现超顺磁性从而可用作MRI造影剂的化合物。尤其方便的是基于氧化铁和任选钴、铜、锰、镍或其组合的超顺磁性纳米微粒。其中，最方便的是基于磁铁矿、磁赤铁矿或组合的直径约15nm或更小且表现超顺磁性的纳米微粒。这些统称为超顺磁性氧化铁(SPIO)微粒。原子数大于34的过渡金属和锌可用于制备可用作X-射线造影剂的化合物。其中特别关注的是铪、钼、银、钽、钨和锆，最方便的是钽，特别是氧化钽。
亲水改性的纳米微粒通常具有通过DLS测量为500nm或更小的DH。方便的是它们的DH为50nm或更小，更优选30nm或更小，最优选DH为3-30nm。如果亲水改性的纳米微粒预定作为例如MRI或X-射线造影剂体内用于人受试者，则特别方便的DH为约8nm或更小。
亲水改性的纳米微粒方便地通过使其与共轭物反应制备。方便的方法是在有机溶剂比如四氢呋喃(THF)中形成纳米微粒的胶体混悬液，然后将其在相同或不同的有机溶液中与共轭物有机溶液混合。然后可将混合物在提高温度保持延长时间直至反应基本完成。通常方便的是保持50℃或更高温度16小时或更久。
很容易获得亲水改性纳米微粒的稳定的单分散性含水胶体混悬液。此类混悬液应当优选稳定对抗过滤(比如对30kDa截止的切向流过滤)和添加电解质，比如添加NaCl以使水性介质等渗，即约150mMNaCl。优选混悬液在1周或更久贮存期稳定，更优选不仅稳定对抗沉积还对抗悬浮纳米微粒的DH增长，如通过DLS测定。如果混悬液打算体内用于人受试者，方便的是通过添加NaCl、葡萄糖或其组合使其等渗。
稳定的单分散性含水胶体混悬液方便地通过将胶体混悬液稀释在有机溶剂中制备。方便的方法是简单地稀释一种或多种有机溶剂， 其中已通过添加水使纳米微粒与共轭物反应。另一种方法是使在有机溶剂中的纳米微粒的胶体混悬液与在水中的共轭物反应。在任一情况下方便的是，通过过滤或者用溶剂比如己烷有机提取或组合除去未反应的反应物。在溶剂提取后可通过应用部分真空除去水相中的任何挥发物。然后可通过对着30kDa滤器的切向流过滤纯化亲水改性纳米微粒。
亲水改性纳米微粒可方便地作为造影剂用于诊断成像。此类诊断成像的常用类型是MR和X-射线成像。在任一情况下，方便的是使用具有约-15mV-15mVζ电位的亲水改性纳米微粒。在人受试者体内成像中的方便方法是静脉内给予纳米微粒，优选作为稳定的等渗含水混悬液。如果将通过MR成像，纳米微粒应当包含顺磁性、优选超顺磁性物质，最优选它们应当为氧化铁基的，比如磁铁矿或磁赤铁矿。如果将通过X-射线成像，纳米微粒应当包含原子数大于34的金属或者锌的过渡金属化合物，优选金、铪、钼、银、钽、钨或锆，最优选它们应为氧化钽基的。在特别关注的实施方案中，亲水改性纳米微粒具有8nm或更小的DH，经肾脏从受试者身体清除。
附图
当参考附图阅读以下详述时，将更好地理解本发明的这些及其它特征、方面和优点，其中同样的字符代表图中各处同样的部分，其中：
图1是用于制备亲水纳米微粒的合适α-羟基膦酸的通用结构式。
图2是用于制备亲水纳米微粒的特别关注的α-羟基膦酸的结构式，其中Me是甲基。
图3是具有附着的亲水部分R的α-羟基膦酸的合成途径。
图4是显示于图2的特别关注的α-羟基膦酸的合成途径。
图5是具有附着的亲水部分R的α-羟基膦酸(其合成在图3说明的类型)被附着于超顺磁性氧化铁SPIO纳米微粒的附着的假设图示。
图6A是根据实施例12不含造影剂的肿瘤T1加权图像(TE＝4.1ms)。
图6B是根据实施例12，在给予实施例4纳米微粒造影剂后30分钟的肿瘤T1加权图像(TE＝4.1ms)。
图6C是图6A与图6B之间差异的差异图(difference map)。
图6D是根据实施例12不含造影剂的肿瘤T2 *-加权图像(TE＝18.4ms)。
图6E是根据实施例12，在给予实施例4纳米微粒造影剂后30分钟的肿瘤T2 *-加权图像(TE＝18.4ms)。
图6F是图6D与图6E之间差异的R2 *弛豫差异图，表明肿瘤与肌肉组织之间的明显区别。
详述
将本发明共轭物广泛限定为具有多种连接和亲水部分。关键特征是共轭物具有在化学和立体上可及的α-羟基膦酸的3个羟基。虽然结构具有手性中心，预期所有个体对映体和可能的外消旋混合物将适合对水不溶性纳米微粒赋予亲水性。
这些共轭物在α-羟基膦酸结构与亲水部分之间可具有任何通常已知的化学连接，包括基于碳、氮、氧和硫的那些连接。特别关注的基团是烃、羰基、酯、醚、仲胺或叔胺、季胺、脲、氨基甲酸酯和酰胺。将用共轭物处理的纳米微粒的预期最终用途可影响连接基团的选择。例如如果纳米微粒将用于体内，特别是人受试者体内，则可期望避免比如可导致与组织成分(比如蛋白质)相互作用的四元基团的连接。从惰性的观点来看最关注的连接基团是烃。
亲水部分可以是已知与水具有良好相容性的部分中的任何一种，包括称为表面活性剂的部分。它们可以是阴离子、阳离子或非离子的。亲水部分可以是碳水化合物(比如单糖、二糖或寡糖)、非碳水化合物单体多元醇、具有环氧乙烷基团的聚醚、非碳水化合物聚合物(与具有环氧乙烷基团的聚醚不同，其具有侧接的羟基，比如聚乙烯醇)、聚(乙烯亚胺)、脂族或环脂族胺及其组合。
在一些实施方案中，亲水部分基于环氧乙烷，特别关注的是聚(环 氧乙烷)，特别是分子量等于或小于约5000道尔顿的那些，尤其是分子量等于或小于约2000道尔顿的那些。特别关注的是分子量约350道尔顿的聚(环氧乙烷)。
亲水部分还可以是具有一个或多个带正电部分、一个或多个带负电部分和在带电部分之间的间隔基团的两性离子。为了本申请的目的，带正电部分和带负电部分的组合，如果在生理pH值它们表现为基本无净电荷，则视为两性离子。合适的带正电部分包括质子化伯胺、质子化仲胺、质子化叔烷基胺、季烷基胺、质子化脒、质子化胍、质子化吡啶、质子化嘧啶、质子化吡嗪、质子化嘌呤、质子化咪唑、质子化吡咯或其组合，合适的带负电部分包括去质子化羧酸、去质子化磺酸、去质子化亚磺酸、去质子化膦酸、去质子化磷酸、去质子化次膦酸或其组合，合适的间隔基团包括未被取代和取代的脂族、环脂族和芳基基团，杂脂族基团，杂芳基，醚、酰胺，酯，氨基甲酸酯，脲，或其组合。在一个实施方案中，间隔基团包括长度为1-10个碳原子的直链烷基。
如果纳米微粒的预期最终用途与用具有净离子电荷的粘附α-羟基膦酸共轭物改性的亲水纳米微粒可相容，亲水部分可以是上文讨论适合形成两性离子的任何带正电部分或任何带负电部分。
将用共轭物处理的纳米微粒的预期最终用途可影响亲水部分的选择。例如如果纳米微粒将用于体内，特别是人受试者体内，可期望避免可导致与组织成分(比如蛋白质)相互作用的亲水部分比如离子基团。关于体内使用，特别关注的是基本没有净电荷的亲水部分比如两性离子和具有环氧乙烷单元的聚醚。关于人受试者使用，特别方便的是容易和可再现地表征安全性评价的亲水部分，比如单体部分。特别方便的亲水部分为基于4-哌啶羧酸的那些，它们既是单体也作为两性离子不携带净电荷。关于其中较不担心毒性的应用，比如细胞培养物体外接种，聚(乙烯)亚胺可能是适当的亲水部分。
特别适合的两性离子公开于2008年12月29日提交的美国专利 申请12/344,604，通过引用结合到本文中。这些包括的亲水部分含有阳离子氮和阴离子的基于羧酸、磷酸和磺酸的基团，比如N，N-二甲基-3-磺基-N-(3-丙基)丙-1-胺鎓、3-(甲基)丙基)氨基)丙-1-磺酸、3-(丙基氨基)丙-1-磺酸、2-(乙氧基(羟基)磷酰氧基)-N，N，N-三甲基乙胺鎓、2乙基(羟基)磷酰氧基)-N，N，N-三甲基乙胺鎓、N，N，N-三甲基-3-(N-丙酰基氨磺酰基)丙-1-胺鎓、N-((2H-四唑-5-基)甲基)-N，N-二甲基-丙-1-胺鎓、N-(2-羧乙基)-N，N-二甲基-丙-1-胺鎓、3-(甲基丙基)氨基)丙酸、3-(丙基氨基)丙酸、N-(羧甲基)-N，N-二甲基-丙-1-胺鎓、2-(甲基氨基)乙酸、2-(丙基氨基)乙酸、2-(4-丙基氨基甲酰基)哌嗪-1-基)乙酸、3-(4丙基氨基甲酰基)哌嗪-1-基)丙酸、2-(甲基(2-丙基脲基)乙基)氨基)乙酸和2-(2-(丙基脲基)乙基)氨基乙酸。
合适的基于亲水聚醚的亲水部分公开于1999年6月29日颁发的美国专利5,916,539，其通过引用结合到本文中。这些包括具有各种末端基团(包括氨基和羟基)的各种分子量的聚乙二醇(PEG)以及与聚丙二醇(PPG)的共聚物。
共轭物优选充分亲水，以致当将其与纳米微粒以2摩尔共轭物：1摩尔纳米微粒的金属基础反应时，它可使纳米微粒能够形成稳定的含水混悬液。在这方面，纳米微粒将通常基于过渡金属化合物比如氧化物或过渡金属本身。方便的是用元素金属的摩尔规定反应比，因为这可从纳米微粒在有机溶剂中的起始混悬液的元素分析容易获得。已知纳米微粒的化学组成及其在处理之前的平均大小，可粗略计算每纳米微粒的共轭物的量。特别方便的是共轭物足够亲水，以给予以该比率处理的小于15nm氧化铁或氧化钽纳米微粒充分的亲水性，以致在等体积正辛醇与0.1M pH 7.0MOPS缓冲液之间表现小于1的分配系数对数值。
特别关注的是，具有粘附α-羟基膦酸共轭物的改性亲水纳米微粒充分亲水，以形成稳定的含水胶体混悬液，其在切向流过滤和在室温贮存1周后，如通过动态光散射(DLS)在150mM NaCl水中测定，流 体力学直径(DH)无实质改变。
将用共轭物处理的纳米微粒可以是，可形成共轭物α-羟基膦酸部分将粘附其上的500nm或更小微粒的任何水不溶性材料。关注的是使用在MR或X-射线成像中具有造影剂用途的纳米微粒。但是，也关注用于其它最终用途(比如注入细胞培养物用于转染基因)的纳米微粒。
关于用作MRI造影剂，纳米微粒的基础应当是顺磁性的金属或其化合物，特别关注的是超顺磁性的那些。这些金属方便地选自元素周期表III周期的过渡金属，从锰开始至锌结束。特别关注的材料基于氧化铁。尤其方便的材料是称为SPIO的那些。这些材料具有通式[Fe2 +O3]x[Fe2 +O3(M2+O)]1-x其中1≥x≥0。M2+可以是二价金属离子比如铁、锰、镍、钴、镁、铜、锌或其组合。当金属离子(M2+)是亚铁离子(Fe2+)且x＝0时，材料是磁铁矿(Fe3O4)，当x＝1时，材料是磁赤铁矿(γ-Fe2O3)。
一般，当不成对自旋的含晶体区足够大以致可将它们视为热力学独立时出现超顺磁性，单畴微粒称为磁畴。这些磁畴表现大于其单个不成对电子总数的净磁偶极。在不施加磁场的情况下，所有磁畴都是无规定向，没有净磁场。施加外磁场引起所有磁畴的偶极矩重新定向，产生净磁矩。在一些实施方案中，这些材料展示尖晶石结晶结构，如通过透射电子显微镜(TEM)分析显示。
为了用作X-射线造影剂，纳米微粒的基础应当是比通常见于活体的材料实质上更不透射线的金属或其化合物。方便的是使用在约50mM浓度有效原子数大于或等于34的材料。此类材料可能得到约30Hounsfield单位(HU)或更大的适当的造影增强，这是特别关注的最小增强。可提供这种性质的过渡金属元素实例包括钨、钽、铪、锆、钼、银和锌。氧化钽是适合用于X-射线成像应用的核心组成的一种特别实例。尤其关注的是产生约100Hounsfield-约5000Hounsfield单位CT信号的材料。
其上已粘附α-羟基膦酸的改性亲水纳米微粒可作为造影剂用于诊断成像。在此类应用中，将这些纳米微粒给予受试者，在一些实施方案中为哺乳动物受试者，然后使受试者经受成像。这些纳米微粒在MR和X-射线成像中具有特殊用途，但它们还可用作超声或放射性示踪剂成像中的造影剂。
当用于诊断成像，特别是哺乳动物受试者更特别是人受试者的诊断成像时，通常将其上已粘附α-羟基膦酸的改性亲水纳米微粒吸收在药学上可接受的载体中，载体可包含或不包含一种或多种赋形剂。如果将通过注射特别是胃肠外注射给药，载体通常是已通过添加约150mM NaCl、5％葡萄糖或其组合达到等渗的含水介质。它通常还具有约7.3-7.4的生理pH。给药可以是血管内(IM)、皮下(SQ)或最常见是静脉内(IV)。但是，还可通过植入贮库给药，其然后将纳米微粒缓慢释放至受试者的血液或组织。
或者，可通过摄食给药用于胃肠(GI)道成像，或者吸入给药用于肺和气道的成像。
对人受试者的给药，特别是IV给药，要求其上已粘附α-羟基膦酸的改性亲水纳米微粒在所用量无毒，且不含任何传染物比如细菌和病毒，而且不含任何热原。因此，这些纳米微粒应当对必需的纯化程序稳定且不遭受亲水性降级。
可将这些纳米微粒作为具有适当同渗质量摩尔浓度和pH的稳定含水胶体混悬液、作为适合稀释和调节的浓缩含水胶体混悬液或者作为适合复原的粉剂比如通过冻干获得的粉剂，递送至给药部位。
实施例1
PEG-350共轭物的合成
PEG-350单(甲醚)乙醛的合成。向含有PEG-350单(甲醚)(3.438g，9.82mmol)溶于CH2Cl2(98mL)中的溶液内加入戴斯-马丁高碘酸盐(Dess-Martin Periodinane)(5.00g，11.79mmol)，将所得溶液在室温搅拌20小时。在反应期间形成精细的白色沉淀物，在反应结束时将其用硅 藻土垫过滤除去。真空除去滤液的溶剂以得到悬浮于黄色油状物中的白色固体。将固体用乙醚研磨，用硅藻土垫过滤除去固体。真空除去滤液的溶剂得到产物PEG-350单(甲醚)乙醛(3.42g，100％)，为黄色油状物。1H NMR(CDCl3)δ9.73(t，J＝4Hz，1H)，4.16(d，J＝4Hz，2H)，3.65(m，24H)，3.38(s，3H)ppm.IR(净)2873，1732，1455，1350，1109，1040，948，851，749cm-1.
α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸二乙酯的合成。向含有PEG-350单(甲醚)乙醛(3.71g，10.7mmol)溶于四氢呋喃(53mL)的溶液内加入亚磷酸二乙酯(1.77g，12.8mmol)。使溶液冷却至0℃，加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(1.94g，12.8mmol)。在0℃搅拌10分钟后，将rxn加温至室温，再搅拌24小时。真空除去溶剂以得到深黄色油状物，将其用柱层析(100％CH2Cl2→15％MeOH/85％CH2Cl2)纯化以得到3.30g(64％)期望的α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸二乙酯产物，为黄色油状物。1H NMR(CDCl3)δ4.19(m，6H)，3.65(m，24H)，3.38(s，3H)，1.34(m，6H)ppm.31P NMR(CDCl3)δ23.1ppm.IR(净)3343，2872，1725，1453，1248，1105，965，850，791cm-1。
α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸的合成。向含有α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸二乙酯(3.61g，7.43mmol)溶于二氯甲烷(74mL)的溶液内加入三甲基溴甲硅烷(3.41g，22.3mmol)，将所得溶液在室温搅拌2小时。真空除去溶剂以得到褐色油状物。使所得油状物溶于丙酮(74mL)和水(0.5mL)中，将所得溶液在室温搅拌1.5小时。然后真空除去溶剂以得到期望的α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸产物(2.66g，84％)，为金色油状物。1H NMR(CDCl3)δ3.65(m，24H)，3.38(s，3H).31P NMR(CDCl3)δ24.0ppm.IR(净)3460，2870，1727，1456，1351，945，849cm-1.
实施例2
PEG-1900共轭物的合成
PEG-1900单(甲醚)乙醛的合成。向含有PEG-1900单(甲醚)(16.32 g，8.60mmol)溶于CH2Cl2(86mL)的溶液内加入戴斯-马丁高碘酸盐(4.00g，9.44mmol)，将所得溶液在室温搅拌20小时。在反应期间形成精细的白色沉淀物，在反应结束时将其用硅藻土垫过滤除去。真空除去滤液的溶剂以得到白色固体，使其从THF/己烷中再结晶以得到期望的产物(11.6g，71％)，为白色固体。1H NMR(CDCl3)δ9.74(t，J＝1Hz，1H)，4.17(d，J＝1Hz 2H)，3.83(m，2H)，3.65(m，170H)，3.39(s，3H).
α-羟基PEG-1900单(甲醚)膦酸二乙酯的合成。向含有PEG-1900单(甲醚)乙醛(10.74g，5.66mmol)溶于四氢呋喃(57mL)的溶液内加入亚磷酸二乙酯(0.938g，6.79mmol)，接着加入1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(1.03g，6.79mmol)。将反应物在室温搅拌72小时。真空除去溶剂以得到橙黄色固体，使其从THF/己烷中再结晶以得到期望的产物(11.08g，96％)，为灰白色固体。1H NMR(CDCl3)δ4.18(m，4H)，3.64(m，172H)，3.38(s，3H).
α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸的合成。向含有α-羟基PEG-1900单(甲醚)膦酸二乙酯(11.08g，5.44mmol)溶于二氯甲烷(54mL)的溶液内加入三甲基溴甲硅烷(2.49g，16.3mmol)，将所得溶液在室温搅拌3小时。真空除去溶剂以得到褐色油状物。使所得油状物溶于丙酮(54mL)和水(0.5mL)中，将所得溶液在室温搅拌16小时。然后真空除去溶剂以得到橙色固体，使其从THF/己烷中再结晶以得到期望的产物(10.77g，86％)，为灰白色固体。1HNMR(CDCl3)δ4.12(m，2H)，3.65(m，170H)，3.38(s，3H).
比较实施例3
亲水磷酸酯的合成
PEG-350单(甲醚)磷酸二苯酯的合成。向含有PEG-350单(甲醚)(8.54g，24.4mmol)溶于CH2Cl2(80mL)的溶液内加入三乙胺(3.68g，36.6mmol)，接着加入4-N，N-二甲氨基吡啶(0.298g，2.44mmol)。使所得溶液冷却至0℃，滴加氯磷酸二苯酯(7.87g，29.3mmol)，将反应物在0℃搅拌10分钟。然后使反应物加温至室温，再搅拌16小时。加 入10％HCl(80mL)猝灭反应物，分离所得各层。将有机层用水(80mL)和盐水(80mL)洗涤，用无水MgSO4干燥。过滤和真空除去溶剂得到期望的产物(14.2g，100％)，为金色油状物。1H NMR(CDCl3)δ7.34(m，4H)，7.22(m，6H)，4.38(m，2H)，3.73(m，2H)，3.64(m，24H)，3.54(m，2H)，3.38(s，3H).
PEG-350单(甲醚)磷酸的合成。向含有PEG-350单(甲醚)磷酸二苯酯(14.2g，24.4mmol)溶于乙酸(108mL)的溶液内加入氧化铂(IV)水合物(200mg)，将所得混悬液加热至50℃，置于H2气氛下直至氢吸收停止。将反应物用硅藻土垫过滤以除去催化剂，真空除去溶剂以得到期望的产物(10.49g，100％)，为澄清的黄色油状物。1H NMR(CDCl3)δ4.20(m，2H)，3.67(m，24H)，3.56(m，2H)，3.39(s，3H).
实施例3
超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米微粒的合成。向100mL三颈圆底烧瓶装内装入Fe(acac)3(0.706g，2.0mmol)和无水苄醇(20mL)。将所得溶液用氮气鼓泡，在氮气气氛下加热至165℃4小时。然后将所得5nm氧化铁微粒(如通过DLS测定)的胶体混悬液冷却至并贮存于室温。
实施例4
α-羟基PEG-350单(甲醚)膦酸酯涂布的超顺磁性氧化铁纳米微粒的合成。向以1mgFe/mL在THF中的实施例3超顺磁性氧化铁纳米微粒胶体混悬液内加入实施例1的α-羟基膦酸共轭物(比率为1mol共轭物每mol Fe)，将所得混悬液在50℃加热16小时。然后将反应物冷却至室温，用水稀释，将褐色含水溶液用己烷洗涤3次。真空除去水层中任何残余的挥发物，将所得纳米微粒用切向流过滤对着30kDa分子截止滤器用H2O洗涤纯化。
实施例5
α-羟基PEG-1900单(甲醚)膦酸酯涂布的超顺磁性氧化铁纳米微粒的合成。用实施例2的共轭物代替实施例1的共轭物重复实施例4。
比较实施例2
α-羟基PEG-350单(甲醚)磷酸酯涂布的超顺磁性氧化铁纳米微粒 的合成。用比较实施例1的共轭物重复实施例4。
实施例6
5-溴代1-戊醛的合成。将草酰氯(2.42mL，0.022mol)与无水二氯甲烷(40mL)在250mL圆底烧瓶中混合。将烧瓶用氮气覆盖，使溶液在干冰/丙酮浴中冷却至-78℃。搅拌反应混合物，将无水二甲基亚砜(3.4mL，0.044mol)缓慢加入烧瓶内，接着加入5-溴代-1-戊醇(3.34g，0.020mol)，将反应混合物在-78℃搅拌15分钟。将三乙胺(14.0mL，0.1mol)缓慢加入反应混合物内。当三乙胺添加完成时，将反应物在-78℃搅拌5分钟。将反应物从干冰丙酮浴取出，加温至室温，在室温搅拌18小时。
将水(100mL)加入反应混合物内。在500mL分液漏斗中剧烈振荡两相混合物。将水层取出，用二氯甲烷(100mL)提取。将该二氯甲烷与来自反应混合物的二氯甲烷合并。将合并的二氯甲烷溶液依次用各100mL的1％HCl(水)、水、饱和NaHCO3(水)和饱和NaCl(水)洗涤。将二氯甲烷溶液用硫酸镁干燥，过滤回收二氯甲烷溶液。真空除去溶剂得到黄色液体(1.80g)。通过1H NMR证实主要产物是5-溴代1-戊醛。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ9.81(m，1H)，3.43(m，3H)，2.50(m，2H)，2.0-1.4(m，8H)。反应产物不再纯化即用于实施例7。
实施例7
(5-溴代-1-羟基-戊基)膦酸二乙酯的合成。在250mL圆底烧瓶中使5-溴代戊醛(1.64g，0.010mol)溶于乙醚(15mL)内。将反应物用氮气覆盖。将高氯酸锂(7.92g，0.075mol)加入反应物内，在冰浴中使反应溶液冷却至0℃。将氯三甲基甲硅烷(0.631mL，0.010moles)加入烧瓶内，接着加入亚磷酸三甲酯(2.1mL，0.012mol)。将反应混合物在室温搅拌18小时。
在室温18小时后将水(40mL)加入反应物内，接着加入二氯甲烷(40mL)。将有机相转移至分液漏斗，依次用水(40mL)和盐水(40mL)洗涤。将二氯甲烷溶液用硫酸镁干燥和过滤以回收二氯甲烷溶液。真 空除去溶剂得到黄色油状物(3.01g)。通过1H NMR和31P NMR表征油状物，证实主要产物是(5-溴代-1-羟基-戊基)膦酸二乙酯。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.25-4.00(m，4H)，3.00-3.43(m，2H)，1.78-1.95(m，2H)，1.78-1.61(m，3H)，1.61-1.41(m，2H)，1.40-1.25(m，6H).31P NMR(600MHz，CDCl3) 26.5(s，1P)，24.2-24.7(m，0.3P).反应产物不再纯化即用于实施例8。
实施例8
5-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸二乙酯的合成。在300mL圆底烧瓶中使(5-溴代-1-羟基-戊基)膦酸二乙酯(3.02g，0.0099mol)溶于无水甲苯(100mL)内。将三乙胺(2.08mL，0.015mol)加入反应混合物内，接着加入六氢异烟酸乙酯(1.84mL，0.012mol)。将混合物加热回流18小时。真空除去溶剂得到橙色胶。使胶溶于二氯甲烷(100mL)中，依次用饱和含水NaHCO3(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将二氯甲烷溶液用硫酸镁干燥和过滤回收。真空除去溶剂得到橙色液体(1.70g)。
将橙色液体通过硅胶柱层析纯化。将硅胶柱(40g)洗脱，溶剂梯度为30分钟内从100％二氯甲烷改变为二氯甲烷中的20％体积甲醇。将含有产物的流分合并，真空除去溶剂得到黄色液体(0.66g)。通过1HNMR表征黄色液体，主要产物鉴定为5-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸二乙酯。1H NMR(400mHz，CDCl3)δ4.9-4.5(s，1H)，4.2-4(m，5H)，3.8-3.7(m，1H)，2.9-2.7(m，2H)，2.4-2.1(m，3H)，2.1-1.9(m，2H)，1.9-1.8(m，2H)，1.8-1.3(m，8H)，1.3-1.2(m，5H)，1.2-1.1(m，3H)。反应产物不再纯化即用于实施例9。
实施例9
5-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸的合成。在100mL烧瓶中使5-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸二乙酯(0.66g，0.0017mol)溶于二氯甲烷(25mL)内。将三甲基溴甲硅烷(0.69mL，0.0052mol)加入反应混合物内。将反应物在室温搅拌过夜。在搅拌过夜后，真空除去溶剂得到橙色胶。使胶溶于丙酮(20mL)中。加入水(0.4mL)。胶沉淀。真空除去溶剂得到红色胶(0.6g)。通过1H NMR表征胶，确定产物为5-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ4.3-4.1(m，2H)，3.9-3.4(m，3H)，3.4-2.5(m，7H)，2.5-1.35，(m，11H)，1.35-1.2(m，3H).
实施例10
-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸酯涂布的氧化钽纳米微粒的合成。将含有异丁酸(0.242g，2.75mmol)和水(0.08g，4.44mmol)的无水甲醇溶液(17mL)通过用N2鼓泡脱气40分钟。向其滴加Ta2(OEt)5(1g，2.46mmol)，将反应混合物在N2气氛下搅拌5小时以得到3-4nm纳米微粒的混悬液。将5-(4-(乙氧基羰基)哌啶-1-基)-1-羟基戊基膦酸(0.088g，0.205mmol)在甲醇(0.5mL)中的溶液滴加入氧化钽纳米微粒混悬液(1mL)内，在N2下在70℃加热过夜。冷却至室温后，将水(～3mL)滴加入反应混合物内。在旋转蒸发器上减压蒸发除去甲醇后，加入1M NH4OH(0.33mL)，将反应物在50℃搅拌过夜。将反应混合物用3500Da截留分子量(molecular weight cut-off)的再生纤维素膜对DI水(3×2L)透析24小时。通过DLS确定在水中大小为7nm。
实施例11
SPIO纳米微粒胶体混悬液的表征。评价实施例4和5和比较实施例2中切向流过滤结果所得胶体混悬液的稳定性和ζ电位。
用150mM NaCl在水中作为悬浮介质通过动态光(DLS)散射测量流体力学直径(DH)。将来自切向流过滤的纯化SPIO混悬液稀释在150mM NaCl水溶液中，穿过100nm滤器以除去灰尘，然后用Brookhaven ZetaPALS进行DLS分析。在DLS测量期间进行稀释以得到20,000计数每秒的最小值。在制备改性纳米微粒后立即进行测量和在室温贮存2周后进行测量。在贮存后DH显著增加是纳米微粒已聚集的指示，因此该特定胶体混悬液不稳定。
在用10mM NaCl将来自切向流过滤的纯化SPIO混悬液稀释14×并使稀释的SPIO溶液穿过100nm滤器以除去灰尘后，用Brookhaven ZetaPALS测量ζ电位。所有三种胶体混悬液的ζ电位都在通常公认是中性的范围±15mV范围内。
结果在表1列出。
表1
实施例12
通过MRI使体内肿瘤成像。所有涉及动物的程序都在GE全球研究机构动物护理和使用委员会(GE Global Research Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案下完成。通过皮下注射在0.1mLHank’s平衡盐水溶液中的2×106Mat B III细胞(ATCC#CRL1666，ATCC，Manassas，VA)在雌性Fischer 344大鼠(～150g)中诱发肿瘤。注射部位位于肩胛骨之间的背侧。植入后9天使肿瘤成像，此时肿瘤直径为～1cm。
成像在临床3T GE MR750扫描仪上用定制的～6cm螺线管接收RF线圈进行。为了准备成像，将大鼠通过分别IP注射75和5mg/kg剂量的氯胺酮和地西泮麻醉。一旦不动，就将24规格(gauge)导管放在侧面尾静脉内，连接盐水预处理的微孔导管线延伸部分和活塞。导管、线和活塞的死体积是～0.5mL。然后将准备的动物置于RF线圈内，位于扫描仪的腔内。采集注射前图像集，然后不移动桌或动物，将PEG-350α-羟基膦酸酯涂布的超顺磁性氧化铁纳米微粒经活塞注射接着盐水冲洗(～0.8mL)。紧接着注射后(注射后～30秒开始)，在～30分钟动态采集期自始至终收集图像集，得到～16个造影后时间点的收集物。用于注射时，SPIO剂以10mg Fe/mL浓度在生理盐水中，在注射前无 菌过滤，测试内毒素的存在。以3mg Fe/kg体重剂量给予该剂。
采用允许以10倍回波收集图像的3D快速梯度回波脉冲序列。成像板经图形指示界面放置以便肿瘤位于经轴层面中心，覆盖度包括深度上肿瘤的主要部分。脉冲序列参数如下：脉冲序列：3D ME fGRE；TE：从4.1至68ms，间隔7.1ms；TR：75.5ms；倾倒角：25度；带宽：62.5MHz；矩阵：256×256；层面厚度：0.9mm；视野：8cm，得到0.31×0.31×0.9的体素大小。序列采集时间是～2min。
用建立在IDL平台(IDL版本6.3，ITT Corp.，Boulder，CO)上的定制软件工具(CineTool版本8.0.2，GE Healthcare)分析图像数据集。简言之，图像分析工具允许手动描绘注射前系列的3D感兴趣区(ROI)，接着通过对所有时间点绘出的ROI内每个体素进行指数回归计算T2 *时间常数。代表性图像和差异图在图5给出。
虽然本文只说明和描述本发明的某些特征，但本领域技术人员将想到许多变体和改变。因此，应理解附属权利要求打算覆盖落在本发明真实精神内的所有此类变体和改变。

Claims (13)

1.一种组合物，其包含：
其上粘附至少一种α-羟基膦酸酯部分的水不溶性纳米微粒，所述至少一种α-羟基膦酸酯部分具有式：
其中S是间隔基，L是S与R之间的连接，R是聚合物亲水部分，m和p是1-5，n和o是0-5。
2.权利要求1的组合物，其中R为基于环氧乙烷单元的聚合物亲水部分。
3.权利要求1或2的组合物，其中聚合物亲水部分基于环氧乙烷，且其中聚(环氧乙烷)的分子量等于或小于5000道尔顿。
4.权利要求1-3中任一项所要求的组合物，其中纳米微粒为基于氧化铁的超顺磁性纳米微粒。
5.权利要求1-4中任一项所要求的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
6.用作适合注入人受试者的MRI造影剂的权利要求5的组合物。
7.其上粘附α-羟基膦酸酯部分的水不溶性纳米微粒用于制造用于诊断成像的造影剂的用途，其中α-羟基膦酸酯部分具有式：
其中S是间隔基，L是S与R之间的连接，R是聚合物亲水部分，m和p是1-5，n和o是0-5。
8.权利要求7的用途，其中R为基于环氧乙烷单元的聚合物亲水部分。
9.权利要求8的用途，其中聚合物亲水部分基于环氧乙烷，且其中聚(环氧乙烷)的分子量等于或小于5000道尔顿。
10.权利要求7-9中任一项的用途，其中纳米微粒为基于氧化铁的超顺磁性纳米微粒。
11.一种制备其上粘附α-羟基膦酸酯部分的水不溶性纳米微粒的方法，其包含：
a.提供纳米微粒在悬浮剂中的混悬液；和
b.使所述混悬液与所述α-羟基膦酸酯部分接触；
其中α-羟基膦酸酯部分具有式：
其中S是间隔基，L是S与R之间的连接，R是聚合物亲水部分，m和p是1-5，n和o是0-5。
12.权利要求11的方法，其中R为基于环氧乙烷单元的聚合物亲水部分。
13.权利要求12的方法，其中聚合物亲水部分基于环氧乙烷，且其中聚(环氧乙烷)的分子量等于或小于5000道尔顿。
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