CN102634518A

CN102634518A - 棉花表面受体蛋白基因Gbvdr3的启动子及其应用

Info

Publication number: CN102634518A
Application number: CN2012101113667A
Authority: CN
Inventors: 张保龙; 王坤波; 杨郁文; 刘方; 陈天子
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences; Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences; Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-04-17
Also published as: CN102634518B

Abstract

本发明涉及棉花表面受体蛋白基因Gbvdr3的启动子及其应用，属于生物技术领域。本发明通过染色体步移法（Genomewalking）获得了一个海岛棉黄萎病抗性相关基因Gbvdr-3的启动子pgbvdr-3，PLACE软件分析显示该启动子含有许多与抗病、胁迫和光调控相关的元件。GUS染色结果表明GUS基因主要在根部、花器官和种子中表达，荚中基本不表达，说明该启动子是一个组织特异性启动子。

Description

棉花表面受体蛋白基因Gbvdr3的启动子及其应用

一、技术领域

本发明涉及棉花表面受体蛋白基因Gbvdr3的启动子及其应用，属于生物技术领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性，抗逆性和其他有益的生产性状。

二、背景技术

表面受体蛋白（RLP）基因具有跨膜结构域和胞外富含亮氨酸重复（LRRs）结构域。它们通过胞外LRR结构域与胞外信号分子，如离子、小分子或多肽等的特异结合来进行跨膜传递信号的功能。这类基因的生物学功能包括参与抗病抗逆反应，植物形态建成等。RLP参与的抗病反应属于植物的先天免疫，即识别微生物相关分子模式（MAMP或PAMP）后介导基础抗性。参与植物抗病反应的表面受体蛋白（RLP）基因包括，番茄黄萎病抗性基因Ve1和Ve2（Kawchuk et al, 1999; Fradin et al, 2009; Fradin et al, 2011）；番茄叶霉病抗性基因Cf-9（Jones et al, 1994）;烟草和番茄的绿色木霉抗性基因LeEIX2（Ron et al, 2004），苹果黑星病抗性基因HcrVfa1，HcrVfa2（Belfanti et al, 2004; Malnoy et al, 2008）；拟南芥AtRLP52和AtRLP30分别与白粉病和丁香假单胞杆菌抗性相关（Ramonell et al, 2005；Wang et al, 2008）等。

RLP类基因在染色体上的结构具有明显的特征，它们多以基因家族形式存在，如大部分Cf基因以成簇的方式分布在染色体上（Kruijt et al, 2004）；Ve1和Ve2位于同一个基因位点（Kawchuk et al, 1999）；LeEIX位点含有3个同源基因（Ron et al, 2004）；苹果的黑星病抗性位点Vf含有HcrVfa1, HcrVfa2，HcrVfa3和HcrVfa4这4个同源基因（Malnoy et al, 2008）。相当多的研究成果证明不同的基因家族成员可能识别不同的病原小种并诱导专一性的抗性反应。如Cf-2, Cf-4, Cf-4E, Cf-5, Cf-9和9DC分别识别叶霉病的效应因子 Avr2, Avr4, Avr4E, Avr5 和 Avr9（Jones DA et al，1994；Thomas CM et al, 1997; Kruijt M et al, 2004）。同一个位点的基因家族成员有些对已有的病理小种不存在抗性，它们可能在基因进化过程中发挥一定的作用。如Ve位点中只有Ve1基因起抗病作用（Fradin EF et al, 2009）；LeEIX位点中只有LeEIX2有抗病作用（Ron M et al, 2004）；Vf位点中只有HcrVfa1和HcrVfa2有抗病作用（Belfanti E et al, 2004; Malnoy M et al, 2008）。

除了参与植物的基础抗性，这类基因还参与器官发育，形态建成等。拟南芥CLV2参与茎尖和根分生组织形成（Fiers et al, 2005；Jeong et al, 1999）；玉米的FEA2维护茎尖分生组织（Taguchi-Shiobara et al, 2001）；拟南芥TMM参与气孔的发生与发育（Yang and Sack, 1995; Nadeau and Sack, 2002）。

正是由于表面受体蛋白（RLP）基因的生物学功能复杂多样，其启动子也必定随其功能变化具备特定的表达特征。位于基因5' 端上游的启动子是基因转录调控的中心，是一种重要的顺式作用元件，它能决定基因转录的方向和效率。对于基因功能的研究，启动子的研究是必不可少的。另外一方面，在组织特异性启动子调控下，外源基因在某些特定的器官或组织中表达，不但可以避免植物能源的不必要浪费、减轻对作物农艺性状的影响，还可以使外源基因的表达产物在特定部位积累，增强转基因的效果，并表现出发育调节的特性。利用组织特异性启动子或诱导型启动子来驱动相关基因的表达成为转基因育种有效的途径之一。

Gbvdr3是来源于黄萎病抗性材料H7124的一个表面受体蛋白基因，与番茄Ve1具有一定的相似性，该基因对黄萎病诱导具有响应。本发明提供了Gbvdr3的启动子序列。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是：提供了一个棉花组织特异性启动子，该启动子在植物的根、花器官和种子中能够特异表达。可以利用本发明启动子构建成各种植物表达载体，应用于转基因研究以及抗病、抗虫育种工作中。

技术方案

本发明所提供的是一个棉花组织特异性启动子pgbvdr-3，来源于海岛棉H7124(Gossypium Barbadense L)，是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列；

2）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE (15mM NaCl, 1mM NaH₂PO₄, 0.1mM EDTA) 、 0.1×SSC (15mM NaCl, 1.5mM 柠檬酸钠)、0.1％ SDS（十二烷基磺酸钠）的溶液中，65℃条件下洗膜。序列表中的SEQ ID NO.1由1024个碱基组成。自5’端第1022位碱基为转录起始位点, 记为+1。

本发明提供了含有本发明启动子的表达载体和宿主菌以及扩增启动子任一片段的引物。

本发明提供的是一个棉花组织特异性启动子pgbvdr-3，GUS染色发现该启动子能够驱动GUS基因在根，花药或种子中特异表达。pgbvdr-3的功能活性研究可为揭示Gbvdr3基因的表达模式以及功能机理打下基础，还可应用于棉花抗病、抗虫基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。

有益效果

1. 本发明获得了一个来源于黄萎病抗性材料H7124的一个表面受体蛋白基因的启动子 pgbvdr-3。表面受体蛋白（RLP）基因的生物学功能复杂多样，其启动子也必定随其功能变化具备特定的表达特征。pgbvdr-3的分离与研究为进一步了解该基因功能奠定基础。

本发明获得了一个棉花组织特异性启动子 pgbvdr-3 。组织特异性启动子可以使目的基因在特定部位表达，避免CaMV35S给转基因植株造成的负担，增强转基因的效果。本发明中的启动子pgbvdr-3是一个组织特异性启动子。这样的启动子可以应用于作物抗病、抗虫育种和其他生产形状的改良。

表达有效。GUS组织化学染色结果显示该启动子在根部、花药和种子中表达量较高。这样的表达特性为该启动子的进一步利用奠定了基础。

四、附图说明

图1 pgbvdr-3载体构建示意图。

图2 pgbvdr-3转基因植株的分子鉴定。Ck1, Ck2: 未转基因对照株；1-8为转基因植株。

图3.转基因拟南芥不同组织的GUS组织化学染色结果.

A:根；B,C:花；D:种子以及荚

五、具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验所用的陆地棉(Gossypium Barbadense L)品种均为H7124（马峙英，王省芬，张桂寅. 河北省棉花黄萎病菌致病性的研究. 棉花学报, 1997, 9 (1)∶15～20），拟南芥品种为哥伦比亚型（Lin X, Kaul S, Rounsley S, Shea TP, Benito MI, Town CD, Fujii CY, Mason T, Bowman CL, Barnstead M, Feldblyum TV, Buell CR, Ketchum KA, Lee J, Ronning CM, Koo HL, Moffat KS, Cronin LA, Shen M, Pai G, Van Aken S, Umayam L, Tallon LJ, Gill JE, Adams MD, Carrera AJ, Creasy TH, Goodman HM, Somerville CR, Copenhaver GP, Preuss D, Nierman WC, White O, Eisen JA, Salzberg SL, Fraser CM, Venter JC. Sequence and analysis of chromosome 2 of the plant Arabidopsis thaliana. Nature 1999; 16; 402(6763):761-8.）。棉花与拟南芥都在培养箱中生长。光照强度为130μmol photons m^–2s^–1，湿度为65%。

（一）棉花Gbvdr3基因启动子pgbvdr-3的克隆以及序列分析

参照Paterson 等的方法（Paterson AH et al, 1993）提取H7124叶片的核基因组DNA，分别用限制性内切酶HindIII、DraI对所提取的核基因组DNA进行酶解。然后用染色体步行法克隆棉花抗性相关基因Gbvdr-3的启动子序列。采用clontech公司的GenomeWalker^TM 试剂盒并按试剂盒说明书进行操作，具体方法为：首先将上述经不同限制性内切酶酶解后产生的不同长度的DNA片段连接各自相应的接头，得到带有接头的基因组DNA文库；然后以含有接头的基因组DNA文库作为模板，在外侧接头引物

AP1：5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

和外侧基因特异引物

GSP1：5'- CAGCTTATCAAACGCAGAAGGAA-3'

的引导下，进行第一轮PCR扩增；

再以第一轮PCR扩增产物模板，在内侧接头引物

AP2：5'-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3'和内侧基因特异引物

GSP2：5'- CACTTTGACATTGAGCCGAAACC-3'的引导下，进行第二轮的PCR扩增。

第二轮PCR扩增结束后，用维特洁公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T Easy中 (Promega公司) ,转化E.coli JM109（大连宝生物公司）感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由ABI310 DNA测序仪完成 (Applied Biosystem Inc., Foster City, TX, USA)。两轮PCR扩增后，获得一个长度为1.2kb的DNA片段，具有序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。

与已克隆的Gbvdr3基因的cDNA序列进行比较，结果该1.2kb的DNA片段含有Gbvdr3cDNA序列5’端编码区的150个核苷酸，即5’端编码区部分重叠，表明所克隆到的片段就是目标基因的启动子序列，将该启动子命名为pgbvdr-3。而将上述重组载体命名为pGEM-TEasy- pgbvdr-3。

用PLACE软件（http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/）对Gbvdr3基因启动子的核苷酸序列（序列表中的SEQ ID NO.1）进行序列分析，发现该启动子含有一些与抗病相关的元件，如BIHD1OS（TGTCA），ELRECOREPCRP1（TTGACC），GCCCORE（GCCGCC），HSELIKENTACIDICPR1（CNNGAANNNTTCNNG），SEBFCONSSTPR10A（YTGTCWC），WBOXATNPR1（TTGAC）等，说明该启动子可能受病原菌的诱导；同时，该启动子含有多个光调控元件，如EBOXBNNAPA，GT1CONSENSUS，I BOX，INRNTPSADB等，越来越多的研究表明光与植物的抗病性关系十分密切，而相当多抗病基因的激活需要光照（Asai T et al., 2000; Brodersen P. et al., 2002; Fryer M.J. et al, 2003）同时该启动子还含有多个激素响应元件，如生长素和水杨酸诱导元件ASF1MOTIFCAMV（TGACG），赤霉素诱导元件CAREOSREP1（CAACTC），ABA诱导元件DPBFCOREDCDC3（ACACNNG）等，除此之外，还发现许多器官特异的元件，如花粉特异表达元件POLLEN1LELAT52（AGAAA），根毛特异元件RHERPATEXPA7（KCACGW），根特异表达相关元件ROOTMOTIFTAPOX1（ATATT）。启动子含有众多的光调控、激素响应和抗病相关的元件，这表明Gbvdr3基因在棉花抗性和胁迫诱导过程中受复杂因素的调控。

表1 启动子序列中的调控元件分析

（二）构建Gbvdr3启动子序列与GUS基因融合的重组载体并转化拟南芥

设计构建启动子载体的引物，

Gbvdr3-sal1promoter：5’-CACAGAAGTTGAACAAACTAGGCAT-3’；

Gbvdr3-bamh1promoter：5’- AGATAACAATGGCACTAGGTTGA-3’；

在引物中分别添加sal1和bamh1酶切位点。以H7124为模板扩增启动子片段，获得序列SEQ ID NO.1的片段，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化目的片段，测序验证所得到的PCR产物，用sal1和bamh1进行酶切，植物表达载体pBI101.1（Clontech公司）也用相同的酶双酶切，将以上所得酶切产物纯化后连接。将获得的启动子片段连接在β-葡聚醛酸酶(GUS)基因的上游5’端获得重组载体，命名为pBI- pgbvdr-3::GUS（图1），用冻融法将重组载体转化到农杆菌LBA4404（大连宝生物公司）中。用花浸染方法(Clough S J and Bent A F. 1998)转化拟南芥，分单株收获拟南芥种子。将所有种子在含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中生长。用PCR方法进一步检测转基因植株。收获转基因工程植株种子。

将转基因工程植株种子播种于含有40 mg/L卡那霉素的MS培养基。挑选绿色植株移栽至营养土中生长并应用PCR对转基因植株进行分子鉴定（图2），获得的转化株用于启动子功能以及特征研究。将转基因株系植株进行组织化学染色以检测GUS基因的表达位置和特征。

（三）GUS活性的组织化学定位分析和荧光定量测定

GUS活性的组织化学定位分析方法为：

取步骤二在温室中生长的pBI-pgbvdr-3::GUS拟南芥转基因幼苗全株，将植株根部洗净。参考Jefferson等的荧光组织化学定位法（Jefferson RA et al, 1987）测定GUS活性，具体方法为：GUS组织化学染色以5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-Dglucuronic acid (X-Gluc)作为底物。将整株拟南芥用90%的丙酮充分脱色处理后，浸泡在GUS反应液中（含50 mmol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.0）, 10mmol/L EDTA, 2 mmol/L 铁氰化钾，2 mmol/L 亚铁氰化钾，2.0 mmol/L X-gluc及0.2％ Triton X-100），37°C温育1~3天，直至着色达到足够强度。再将拟南芥植株用70-100％系列乙醇脱色以去掉叶绿素，最后解剖镜下镜检。GUS组织化学染色的结果如图3所示。

转基因植株根部显色较深，说明启动子可以使目的基因在根部高效表达。同时，在花器官的部分组织如花柱和雄蕊中也有较强的表达。另外，对果荚和种子的染色结果显示，果荚中没有表达，但是在种子中有一定的表达量。上述GUS荧光组织化学定位结果表明了pgbvdr-3为组织特异性启动子。

SEQ ID NO.1的片段：

Cacagaagtt gaacaaacta ggcataatat acatttggcg gcaacctaca caagacttat 60

Tttttctatt attgagaatt tattttagtg aagaacatgt caaagattaa atcctaatat 120

Tcttccatgg gcggatgcac aattcgccaa tacaatagtt tgtcagaagt tacaatttgg 180

Tgaattaact atcagaatgt gccagaacaa aaaacttcta cgtgctttca attcagatca 240

Tccagatttg gggtgtgaca tgaaaattta tggtaaccaa agtagtgcta cttggagcaa 300

Atttcatcag gattagattt ttgaagaaaa aggtctacgg tcaaggaaaa aagacagagt 360

Tgacagagcc tcaatgcatt gcaccaaaat gacagaaata gttgaataat gtaaggaaac 420

Ctaaaagttg agaaggcatc atggaaattt cccaagcctt cactgtgaag ttcaaagtta 480

Gacttgaagg cttcaagttg aagatatgaa ttcagattgt aatgattcaa tttggggaaa 540

Aaaatgaatg aattaaaacc caacattcag ccttattgaa taagtgagtt ttgtctcgat 600

Ggtctggtta tattaaattc aaggatgggc agcagttttg cgagaacacc actcaaagtc 660

Ttcgtatgat ttttccaagt tgctaaaaaa gaagctacaa acttcagcca aagtctattg 720

Aacaaaataa atgctaaaga aaatcccaca aaacaacgcg tcatgtactg atgctggctg 780

Cacacggttt gacggttctt tcttttgcct accatctcat ttctttgctt cttctctact 840

Ttcagagttt ccatcttccttcattctacattttgctaaaagggttggttttttaattgc

Tgccactgaaacaggttatgccgaaaactcgtggttgggcacttgcttcttctcaaccta

gtgccattgttatct

SEQUENCE LISTING<110> 江苏省农业科学院

中国农业科学院棉花研究所<120> 棉花表面受体蛋白基因Gbvdr3的启动子及其应用<130> 0<160> 7 <170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 975<212> DNA<213> 陆地棉(Gossypium Barbadense L)<220><221> gene<222> (1)..(975)<223>

<400> 1

cacagaagtt gaacaaacta ggcataatat acatttggcg gcaacctaca caagacttat 60

tttttctatt attgagaatt tattttagtg aagaacatgt caaagattaa atcctaatat 120

tcttccatgg gcggatgcac aattcgccaa tacaatagtt tgtcagaagt tacaatttgg 180

tgaattaact atcagaatgt gccagaacaa aaaacttcta cgtgctttca attcagatca 240

tccagatttg gggtgtgaca tgaaaattta tggtaaccaa agtagtgcta cttggagcaa 300

atttcatcag gattagattt ttgaagaaaa aggtctacgg tcaaggaaaa aagacagagt 360

tgacagagcc tcaatgcatt gcaccaaaat gacagaaata gttgaataat gtaaggaaac 420

ctaaaagttg agaaggcatc atggaaattt cccaagcctt cactgtgaag ttcaaagtta 480

gacttgaagg cttcaagttg aagatatgaa ttcagattgt aatgattcaa tttggggaaa 540

aaaatgaatg aattaaaacc caacattcag ccttattgaa taagtgagtt ttgtctcgat 600

ggtctggtta tattaaattc aaggatgggc agcagttttg cgagaacacc actcaaagtc 660

ttcgtatgat ttttccaagt tgctaaaaaa gaagctacaa acttcagcca aagtctattg 720

aacaaaataa atgctaaaga aaatcccaca aaacaacgcg tcatgtactg atgctggctg 780

cacacggttt gacggttctt tcttttgcct accatctcat ttctttgctt cttctctact 840

ttcagagttt ccatcttcct tcattctaca ttttgctaaa agggttggtt ttttaattgc 900

tgccactgaa acaggttatg ccgaaaactc gtggttgggc acttgcttct tctcaaccta 960

gtgccattgt tatct 975

<210> 2<211> 22<212> DNA<213> 人工<220><221> AP1<222> (1)..(22)<223>

<400> 2

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 3<211> 23<212> DNA<213> 人工<220><221> GSP1<222> (1)..(23)<223>

<400> 3

cagcttatca aacgcagaag gaa 23

<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 人工<220><221> AP2<222> (1)..(20)<223>

<400> 4

actatagggc acgcgtggtc 20

<210> 5<211> 23<212> DNA<213> 人工<220><221> GSP2<222> (1)..(23)<223>

<400> 5

cactttgaca ttgagccgaa acc 23

<210> 6<211> 25<212> DNA<213> 人工<220><221> Gbvdr3-sal1promoter<222> (1)..(25)<223>

<400> 6

cacagaagtt gaacaaacta ggcat 25

<210> 7<211> 23<212> DNA<213> 人工<220><221> Gbvdr3-bamh1promoter<222> (1)..(23)<223>

<400> 7

agataacaat ggcactaggt tga 23

Claims

1. 棉花表面受体蛋白基因Gbvdr3的启动子，是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

2）可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的条件为0.1×SSPE或 0.1×SSC、0.1％ SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

3. 根据权利要求1或2所述的启动子，其特征在于，该启动子能够使目的基因在根部、花药或种子中特异表达。

4.含有权利要求1～3之一所述启动子的表达载体。

5. 含有权利要求1～3之一所述启动子的宿主菌。

6. 权利要求1～3之一所述的植物基因启动子在植物抗病或抗逆性改良和植物品质改良中的应用。

7. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物是指双子叶植物。