CN102634501A

CN102634501A - 一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法

Info

Publication number: CN102634501A
Application number: CN2012101350588A
Authority: CN
Inventors: 张斌
Original assignee: SUZHOU BAIQU FOOD CO Ltd
Current assignee: SUZHOU BAIQU FOOD CO Ltd
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法，本发明为了进一步提高解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)发酵产凝乳酶的活力，对影响解淀粉芽孢杆菌凝乳酶活力的培养温度、摇床转速、培养基初始pH及发酵时间等主要因素进行了优化试验，确定最佳发酵条件，在100mL三角瓶中装25mL发酵培养基，接种量3.5%，培养温度36℃，培养基最初pH为6.0，发酵时间为20h，摇床转速为120r/min，凝乳酶活力可达最高值。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法。

背景技术

干酪又称奶酪，富含多种营养成分，又容易消化吸收，且不易致肥，被营养学家誉为“乳业皇冠上的珍珠”，它是一种在牛奶或羊奶中加入适量乳酸菌发酵剂和凝乳酶制剂，使奶中的蛋白质凝固，排除乳清，并经一定时间的成熟而制成的食品，凝乳酶则是奶酪生产过程中使牛奶凝固的关键性酶。其传统来源是从未断奶的小牛皱胃中提取，是一种酸性蛋白酶，其主要的生物学功能是有限剪切Phe105-Met106 连接的κ-酪蛋白，导致牛乳凝结，被广泛用于乳酪业。随着奶酪产业的发展，动物凝乳酶已经无法满足现代工业对凝乳酶的需求，而植物凝乳酶虽然来源广泛，但是其蛋白水解力强，并且受时间地点等的限制难以发展，因此利用微生物凝乳酶是目前最有前途的发展方向。

目前工业上微生物凝乳酶主要采用米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等真菌发酵生产。细菌较丝状真菌具有体积小、生长周期短、成本低、发酵产物易于提取分离等特点，能在人工控制的条件下进行生产，而高蛋白水解能力是细菌来源的凝乳酶成为商品凝乳酶的主要障碍，因此凝乳酶活力高，蛋白水解活力低的细菌凝乳酶作为小牛凝乳酶的代用品在工业化生产中具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法，本专利为了进一步提高解淀粉芽孢杆菌( Bacillus amyloliquefaciens) 发酵产凝乳酶的活力，对影响解淀粉芽孢杆菌凝乳酶活力的培养温度、摇床转速、培养基初始pH 及发酵时间等主要因素进行了优化试验，确定最佳发酵条件，在100mL 三角瓶中装25 mL 发酵培养基，接种量3.5%，培养温度36℃，培养基最初pH 为6.0，发酵时间为20 h，摇床转速为120 r/min，凝乳酶活力可达最高值。

1. 一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法，其特征在于，在100 mL摇瓶中配制一定体积的发酵培养基，接入一定量的解淀粉芽孢杆菌种子液，在恒温振荡器中培养温度24～38℃，摇瓶转速60-260 r/min，然后进行凝乳活力和蛋白水解活力的测定。

2. 步骤1里的种子培养基：马铃薯葡萄糖肉汤培养基:马铃薯浸粉0.5%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，121℃灭菌20min。

3. 步骤1里的发酵培养基：铃薯浸粉0. 5%，葡萄糖1.13%，酵母浸粉1.76%，CaCO₃ 0. 32%，121℃灭菌20 min。

4. 步骤1所述的解淀粉芽孢杆菌接种量最佳为3.5%。

5. 步骤1所述的培养温度最佳为36℃。

6. 步骤1所述的摇床转速最佳为120 r/min。

7. 步骤1所述的最佳装液量为25 mL

8. 步骤1所述的培养基初始pH最佳为6.0。

9. 步骤1所述的凝乳活性的测定方法为，取5mL 100g /L 的脱脂乳，40℃保温5min 后加入0. 5 mL经适当稀释的发酵液混合，振荡使它们混合均匀。准确记录从加入酶液到乳凝固的时间( s) 。凝乳酶活力( milk － clotting activity， MCA ) 定义为:40min 凝固1mL 10%脱脂乳的酶量为1 个酶活力单位( Soxhelt Unit，Su) 。MCA = ( 2400 × 5 × D) / ( T × 0. 5)式中: MCA 为凝乳酶活力/ ( Su /mL)；T 为凝乳时间/s；D 为稀释倍数。

10. 步骤1所述的蛋白水解活力的测定方法为：底物是牛乳全酪蛋白，用pH 6.5 0.1M 磷酸盐缓冲液配制2% 酪蛋白溶液，1mL 底物溶液加入0.1 mL 酶液，在40℃ 孵育1 h，立即加入1.1mL 0. 4 M TCA 溶液终止反应，涡旋混匀后在室温下放置20 min，然后12000 r/min 离心10 min，上清液中多肽含量用Lowry 法测定。一个酶活力单位定义为每分钟生成100 μg 多肽所需的酶的量。

附图说明

图1接种量对凝乳酶活力的影响。

图2不同培养温度对凝乳酶活力的影响。

图3摇床转速对凝乳酶活力的影响。

图4装液量对凝乳酶活力的影响。

图5培养基初始pH 对凝乳酶活力的影响。

具体实施方式

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

本专利所用的菌株为解淀粉芽孢杆菌，购买于ATCC，编号为：01855。

实施例1

本实施例说明接种量对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的影响，在发酵培养基其他条件相同的情况下，将解淀粉芽孢杆菌分别按分别以1%、1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%、11.5%的接种量接种入发酵培养基中。

由图1可以看出，接种量对解淀粉芽孢杆菌发酵产酶影响不大，但接种量小于1% 时明显抑制菌株产酶，当接种量为3.5%时凝乳酶活力最大，随着接种量的增加，凝乳酶活力缓慢降低，但变化不大，因此，接种量为3.5%时较适宜。

实施例2

本实施例说明不同培养温度对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的影响，在发酵培养基其他条件相同的情况下，培养温度分布控制在24-38℃。

由图2可以看出，在28-36℃的范围内培养，该菌株都能进行良好的生长和产酶，且在36℃时凝乳酶活力、蛋白水解活力及二者比值均达到最大值，当培养温度超过36℃时，凝乳酶活力和蛋白水解活力都在下降，但凝乳酶活力影响更大些，因此，选定36℃为最佳培养温度。

实施例3

本实施例说明摇床转速对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的影响，在发酵培养基其他条件相同的情况下，摇床转速依次采用60 r/min、100 r/min、120 r/min、140r /min、180 r/min、220 r/min、260 r/min。

由图3可以看出，摇床转速为120 r/min 时，凝乳活力与蛋白水解活力均达到最大值，且二者比值最大，其后随着摇床转速的增大，凝乳活力和蛋白水解活力缓慢下降，变化不大，因此选择摇床转速为120 r/min较适宜。

实施例4

本实施例说明装液量对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的影响，在发酵培养基其他条件相同的情况下，100 mL三角瓶中的装液量依次采用5 mL、15 mL、25 mL、35 mL、45 mL、55 mL进行发酵培养。

由图4可以看出，装液量为25 mL时，凝乳活力和蛋白水解活力都达到最大值，随着装液量的增加，蛋白水解活力稍有下降，而蛋白水解活力降低得更为明显。因此，选择装液量为25 mL较适宜。

实施例5

本实施例说明培养基初始pH对解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的影响，在发酵培养基其他条件相同的情况下，培养基初始pH 依次采用3、4、5、6、7、8，以自然pH ( 6. 8) 为对照进行发酵培养。

由图5可以看出，培养基的初始pH不同，所产酶的凝乳活力和蛋白水解活力差别较大，培养基在酸性3.0-6.0 的范围内，凝乳活力与蛋白水解活力变化较大，当初始pH 为6.0 时，凝乳酶活力与蛋白水解活力均达到最大值，培养基在中性至碱性7.0-8.0 的范围内，凝乳酶活力与蛋白水解活力均比较稳定，因此，将培养基的初始pH 控制在6.0 较好。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵的方法，其特征在于，在100 mL摇瓶中配制一定体积的发酵培养基，接入一定量的解淀粉芽孢杆菌种子液，在恒温振荡器中培养温度24～38℃，摇瓶转速60-260 r/min，然后进行凝乳活力和蛋白水解活力的测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养基: 马铃薯葡萄糖肉汤培养基:马铃薯浸粉0. 5%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl 0. 5%，121℃灭菌20 min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基: 马铃薯浸粉0. 5%，葡萄糖1.13%，酵母浸粉1. 76%，CaCO₃ 0. 32%，121℃灭菌20 min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于解淀粉芽孢杆菌接种量为3.5%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养温度为36℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于摇床转速为120 r/min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于最佳装液量为25 mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于培养基初始pH为6.0。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于凝乳活性的测定方法为，取5 mL 100 g/L 的脱脂乳，40℃保温5 min 后加入0. 5 mL经适当稀释的发酵液混合，振荡使它们混合均匀；准确记录从加入酶液到乳凝固的时间( s)；凝乳酶活力( milk-clotting activity，MCA )定义为:40 min 凝固1 mL 10%脱脂乳的酶量为1 个酶活力单位( Soxhelt Unit，Su)；MCA = ( 2400×5×D) / ( T×0. 5)式中: MCA 为凝乳酶活力/ ( Su/mL)；T 为凝乳时间/s；D 为稀释倍数。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于蛋白水解活力的测定方法为：底物是牛乳全酪蛋白，用pH 6.5 0.1M 磷酸盐缓冲液配制2% 酪蛋白溶液，1 mL 底物溶液加入0.1 mL 酶液，在40℃ 孵育1 h，立即加入1.1 mL 0. 4 M TCA 溶液终止反应，涡旋混匀后在室温下放置20 min，然后12000 r/min 离心10 min，上清液中多肽含量用Lowry 法测定；一个酶活力单位定义为每分钟生成100 μg 多肽所需的酶的量。