CN102634447A - 一种微阵列透析室及利用该透析室的富集培养方法 - Google Patents

Abstract

一种微阵列透析室及利用该透析室的富集培养方法，其特征在于：包括上盖板、下盖板及夹设固定在上、下盖板之间的中心板，在上、下盖板及中心板上分别设有上下严格对齐的微孔阵列，且各相邻微孔阵列间通过微孔滤膜隔离，中心板的各微孔被微孔滤膜隔离成独立的透析室。与现有技术相比，本发明的优点在于：一方面，中心板的众多微孔可确保微生物的高通量培养，另一方面，中心板的每个微孔内可植入适量的优势等级不同的菌种，经过各个微孔独立培养后，这些不同优势等级的菌种均能被培养出来，进而近似获得单克隆培养，并同时提高分离效率。此外，本发明还分析确定了该微阵列透析室的最佳接种比例样品在不同浓度梯度接种下的微生物多样性差异。

Description

一种微阵列透析室及利用该透析室的富集培养方法

技术领域

本发明涉及微生物培养装置及微生物培养方法，具体是指一种微阵列透析室及利用该透析室的富集培养方法。

背景技术

海洋微生物分布广、数量多，在海洋生态系统中起着特殊的作用，海洋环境中99％以上的微生物无法通过常规分离培养获得，一旦离开原环境都无法生长。已有研究表明，这些“非可培养微生物”在生态环境和地球能量及物质循环中起到了举足轻重的作用，因此，研究开发“非可培养微生物”的培养方法和技术一直以来都是微生物学研究的热点。

目前，研究人员已经开展了原位分离“非可培养微生物”技术的研究，其中，透析室培养技术为其主要的培养技术之一，相应地，也出现了多种透析室培养装置。如专利号为ZL 200620120442.0(授权公告号为CN 2937146Y)的中国实用新型专利所公开的《一种双向透析器》，该透析器用不锈钢制成，形状为长方形，其特征是由三个部分组成，其中，左、右侧室为培养基贮存室，中间室为细菌培养室，左右两室与中间室用透析模隔开。该双向透析器通过双向透析扩大了透析面，从而在培养基中的营养物质得以充分利用，但是，该双向透析器不适合用于原位环境培养，因为该双向透析器中的培养基贮存室处于相对封闭状态，在培养过程中，位于培养基贮存室内的营养物质会逐渐减少，培养效率必定会受影响。作为对这种相对封闭的透析室的改进，人们发明了不少能适合于原位环境培养的开放式的透析室装置，但是这些透析室装置都只有一个单一的透析室，使得一次只能培养一份样品，培养效率较低。而且，这些透析室的直径一般均为厘米级，透析室体积较大，在一个透析室内植入的菌株数量较多，这些植入同一透析室的菌株一般包括有不同优势等级的菌种，在培养过程中，透析室内不同优势等级的菌种之间经过优胜劣汰，其中的优势菌种得以生存并培养出来，其中的次优势菌种及非优势菌种因生长受到抑制而难以培养出来，即难以获得次优势菌种及非优势菌种的单克隆培养。此外，由于透析室内菌株数量较多，在一次培养过程中，培养出来的优势菌种往往也分好几种，从而还必须经过后续的分离操作将这些优势菌种分离开来，操作较为繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状，提供一种培养通量较高并能获得近似单克隆培养的微阵列透析室。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种能确定样品的最佳稀释培养浓度和能得出不同稀释培养浓度下微生物的多样化差异的富集培养方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该微阵列透析室，其特征在于：包括上盖板、下盖板及夹设固定在上、下盖板之间的中心板，在所述上、下盖板及中心板上分别设有上下严格对齐的微孔阵列，在上盖板的微孔阵列与中心板的微孔阵列之间夹设有第一微孔滤膜，在下盖板的微孔阵列与中心板的微孔阵列之间夹设有第二微孔滤膜，所述中心板的微孔阵列中的各微孔被所述的第一微孔滤膜和第二微孔滤膜隔离成独立的透析室。

进一步优选，所述微孔阵列中各微孔的孔径为1～2mm。当然，微孔阵列中微孔的孔径可以根据实验不同作相应调整，只要使中心板的每个微孔内能植入适量的菌株数量进行培养。

进一步优选，所述的上、下盖板及中心板均为长方形，在上、下盖板及中心板上沿各自长度方向分别设有两个所述的微孔阵列，且所述的微孔阵列为圆形，对应地，所述的第一微孔滤膜和第二微孔滤膜也均为圆形。这样，整个装置结构较为简单，同时也便于采用标准化的微孔滤膜。

作为上述方案的改进，所述微孔阵列的直径为25mm，所述第一微孔滤膜中各微孔的孔径及所述第二微孔滤膜中各微孔的孔径均为0.1μm。其中，微孔滤膜的微孔孔径可以根据实验不同作相应调整，但需保证已植入透析室的待培养菌株和位于透析室外的菌株均不能透过微孔滤膜，并同时使小分子营养物质能透过微孔滤膜而自由出入透析室。

作为上述方案的进一步改进，在所述上盖板的上表面及下盖板的下表面均开有圆形凹槽，所述上、下盖板上的微孔阵列分别成型于各自所在盖板的圆形凹槽的底部。设置凹槽后，上、下盖板的整体厚度可以增加，从而提高装置结构强度。

为了进一步提高结构强度，所述的上、下盖板及中心板均采用聚甲醛板。

一种利用上述透析室的富集培养方法，其特征在于包括如下步骤：

(一)、将样品按不同浓度梯度稀释后分别与一培养基充分混合并分别接种于所述透析室内，之后对不同浓度梯度稀释下的样品分别进行原位培养和模拟原位培养；

(二)、获取上述经原位培养和模拟原位培养后的样品，并分别溶解于灭菌生理盐水以制成原位培养下的原浓度菌液和模拟原位培养下的原浓度菌液，再将上述两原浓度菌液分别进行平板涂布培养；

(三)、结合稀释平板计数法和DAPI荧光染色计数法，分别计算在原位培养下和在模拟原位培养下所述透析室对应不同浓度梯度时的可培养率，并采用DGGE凝胶电泳检测技术分别分析样品在原位培养和模拟原位培养下对应不同浓度梯度稀释时的微生物多样化差别。

优选地，根据步骤(三)的可培养率求得最佳稀释培养浓度，并分析不同培养基在上述最佳稀释培养浓度下的可培养率和微生物多样性。这样，通过不同营养配比的培养基接种实验，来确定针对某特定样品的最佳培养基配比。

进一步优选，所述的DGGE凝胶电泳检测如下三个步骤：

①、采用化学裂解法与酶溶法相结合提取DNA；

②、将DNA模板稀释50倍后取0.2μL对16S rDNA V3-V5区序列进行PCR扩增；

③、对PCR产物进行DGGE电泳检测。

进一步优选，接种所述菌株的培养基为LB固体培养基，该LB固定培养基包括有0.7％琼脂、0.5％酵母提取物、1％胰蛋白胨及1％氯化钠。LB培养基是一种富营养培养基，它含有丰富的碳源、氮源、无机盐、维生素等，可适用于大多数微生物的生长。因此，在LB培养基内，大量的优势菌种快速繁殖，可培养率相对较高。

与现有技术相比，本发明的优点在于：由于该微阵列透析室的中心板微孔阵列中的各微孔在微孔滤膜隔离下形成独立的透析室，首先，中心板的微孔阵列中的众多微孔可确保微生物的高通量培养；其次，由于中心板的微孔的孔径较小，在每个微孔内可放入适量的菌株进行培养，优势菌种可能只存在于其中的部分透析室内，其中的另一部分透析室可能只含有次优势菌种及非优势菌种，在培养过程中这些次优势菌种及非优势菌种不会受到优势菌种的抑制，所以经过整个微阵列透析室培养后，可近似获得各种不同优势等级菌种的单克隆培养；最后，由于每个独立的透析室一般只培养出某个优势等级的单一菌种，使得后续分离操作较为简单，分离效率较高。此外，本发明还通过样品在不同稀释培养浓度下的可培养率分析确定了该微阵列透析室的最佳接种比例，并还分析得出了样品在不同浓度梯度接种下的微生物多样性差异。

附图说明

图1为本发明实施例的立体结构示意图；

图2为图1所示微阵列透析室的俯视图(去掉螺丝)；

图3为图1所示微阵列透析室的立体分解图；

图4为本实施例的透析室富集效率培养流程图；

图5为本实施例的透析室在不同稀释浓度下的可培养率柱状图；

图6为本实施例的透析室采用不同培养基时的富集效率培养流程图；

图7为图6所示不同培养基的可培养率柱状图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对发明作进一步详细描述。

如图1至图3所示，本实施例中的微阵列透析室包括上盖板1、下盖板2及夹设固定在上、下盖板之间的中心板3。其中，上盖板1、下盖板2及中心板3均为长方形，上盖板1和下盖板2的尺寸均为80*40*8mm，中心板3的尺寸为80*40*2mm。在上盖板1的上表面和下盖板2的下表面沿各自长度方向均布有两个直径为25mm的圆形凹槽6，在上述圆形凹槽6的底部成型有圆形的微孔阵列4，上述圆形微孔阵列4的直径为25mm或略小于25mm；在中心板3的长度方向均布有两个圆形微孔阵列4，该两微孔阵列4的直径大小也为25mm或略小于25mm，且该位于中心板3的两微孔阵列4与位于上、下盖板的微孔阵列4上下严格对齐。当然，上、下盖板和中心板并不局限于上述尺寸，可以根据需要稍作调整。在中心板3的微孔阵列4与上盖板1的微孔阵列4之间夹设第一微孔滤膜51，在中心板3的微孔阵列4与下盖板2的微孔阵列4之间夹设第二微孔滤膜52，第一微孔滤膜51和第二微孔滤膜52结构相同且直径均为25mm，在第一微孔滤膜51和第二微孔滤膜52的隔离下，中心板3中的每一个微孔组成一个独立的透析室。

现有透析室的直径一般均为厘米级，采用现有的透析室来培养菌株，一个透析室内可植入大量的菌株，这些大量的菌株中往往既包括有优势菌种又包括次优势菌种和非优势菌种，所以，上述不同优势等级的菌种在一个较大的空间里培养，在培养过程中各菌种经过优胜劣汰后，优势菌种得以生存并被培养出来，而次优势菌种和非优势菌种受到抑制而难以培养出来，所以，最后的培养结果是仅仅只能获得优势菌种的单克隆培养。为了使中心板3的每个微孔中能植入适量的菌株进行培养，中心板3的微孔及上、下盖板的各微孔的孔径一般均为5mm以下，优选为1～2mm，在本实施例中，上述各微孔的孔径均为1mm，使样品稀释浓度达到最佳接种浓度时，植入中心板3的每个透析室内的菌株数量为5个左右。这样，优势菌种可能只存在于其中的部分透析室内，其中的另一部分透析室可能只含有次优势菌种及非优势菌种，在培养过程中这些次优势菌种及非优势菌种不会受到优势菌种的抑制，所以经过整个微阵列透析室培养后，可获得各种不同优势等级的菌种的单克隆培养。并且，由于每个独立的透析室一般只培养出某个优势等级的单一菌种，使得后续分离操作较为简单，分离效率较高。

此外，为了使植入透析室的待培养菌株和位于透析室外的菌株均不能透过微孔滤膜，并同时使小分子营养物质能透过微孔滤膜而自由出入透析室，本实施例中，微孔滤膜5中各微孔的孔径为0.1μm，当然，根据不同实验需要，可以选择使用不同孔径的微孔滤膜5。本实施例中，中心板3上的一个微孔阵列4具有192个微孔，即中心板3的一个微孔阵列具有192个独立的透析室，从而保证了高通量培养，当然，中心板3的一个微孔阵列中微孔的数量也并不局限于192个。

为了使上、下盖板及中心板能紧密地夹固为一体，本实施例中，在上、下盖板及中心板上均开有一组安装孔8，每组安装孔为六个，其中的四个安装孔位于四周，另外两个安装孔位于中间，这三组安装孔的对应孔位上下贯通，六颗螺丝7作为紧固件穿过对应的安装孔8后将上、下盖板及中心板紧固为一体，从而使中心板3的各微孔组成一个独立的透析室。此外，为了提高该微阵列透析室的结构强度，本实施例中，上、下盖板及中心板均采用结构强度较好的聚甲醛板。

该微阵列透析室的安装过程如下：先将待培养菌株接种于中心板的各透析室内，然后将上盖板1、第一微孔滤膜51、中心板3、第二微孔滤膜52及下盖板2自上而下通过螺丝上下紧固为一体，最后将紧固为一体的装置置于原位环境或模拟原位环境中进行培养。

本实施例对利用该透析室的富集培养方法进行了实验，本实验的样品取自淤泥和水样，实验中用到的主要仪器、培养基及试剂分别如下：

仪器设备主要包括曝气装置、高压灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、高速冷冻离心机、数显恒温水浴锅、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、PCR扩增仪、变性梯度凝胶电泳仪(DGGE)等。

主要培养基配比如下表所示。

实验试剂主要有DAPI荧光染色液、DNA抽提缓冲液、TE缓冲液、溶菌酶贮液、TBE(5×)缓冲液、PCR扩增体系、细菌16S rDNAV3-V5引物等。

在进行样品的接种培养之前，为了证明外界环境中的微生物无法进入这些微孔透析室，实验采用大肠杆菌来检测该微阵列透析室的通透性。具体实验方法如下：

一组微阵列透析室中接种无菌的LB固体培养基，组装后浸入加有大肠杆菌液的LB液体培养基中室温培养24小时。培养结束后取出中心板中的琼脂粒接种于无菌的LB液体培养基中培养24小时后，观察到无菌的LB液体培养基仍然清澈透明，说明了没有大肠杆菌生长。以此证明了大肠杆菌无法透过0.1μm微孔滤膜和接口缝隙进入透析室内。

通透性验证完毕后，进行富集培养，该富集培养方法具体包括如下三个步骤：

(一)、将样品按不同浓度梯度稀释后分别与一培养基充分混合并分别接种于所述透析室内，之后对不同浓度梯度稀释下的样品分别进行原位培养和模拟原位培养；

(二)、获取上述经原位培养和模拟原位培养后的样品，并分别溶解于灭菌生理盐水以制成原位培养下的原浓度菌液和模拟原位培养下的原浓度菌液，再将上述两原浓度菌液分别进行平板涂布培养；

(三)、结合稀释平板计数法和DAPI荧光染色计数法，分别计算在原位培养下和在模拟原位培养下所述透析室对应不同浓度梯度时的可培养率，并采用DGGE凝胶电泳检测技术分别分析样品在原位培养和模拟原位培养下对应不同浓度梯度稀释时的微生物多样化差别。

上述步骤(一)称为透析室富集培养过程，其具体操作如下：

首先将所有透析室组件及培养基进行高压灭菌，然后将泥样稀释后取等体积稀释后的泥水混合物与含有琼脂的LB固体培养基充分混合后接种到微阵列透析室中，使中心板的每个小孔内都容纳了含有微生物的培养基，待琼脂凝固后，用0.1μm的微孔滤膜覆盖每一个小孔。每一浓度梯度平行做两组，最后将上、下盖板组装拧紧后置于培养环境中培养两周。该培养环境包括原位培养和模拟原位培养，其中，实验室模拟原位培养期间需每天曝气为微生物生长提供充足的氧。

透析室培养对照实验：分别接种两组含有未稀释泥样的LB固体培养基标记为原样，以及两组未加泥样的LB固体培养基标记为空白。

上述步骤(二)称为透析室富集后平板接种培养过程，其具体操作如下：

微生物在微阵列透析室中培养结束后，将其进行拆分，取出琼脂粒进行下一步培养分析。用灭菌后的回形针从中心板中取出40～50粒小琼脂粒，刀片切碎后用灭菌生理盐水溶解于EP管中，再用25号Precision Glide注射器搅匀后备用。所制得的菌液取100μL按10²、10³、10⁴倍进行稀释，分别取100μL原浓度菌液和稀释后的菌液进行涂布培养。每一浓度梯度平行做三组后置于28℃恒温培养箱内培养。

上述步骤(三)称为可培养率测定及微生物的多样性分析过程，其具体操作如下：

可培养率即为单位体积样品中可培养的微生物数量与其微生物总数之比，研究透析室富集效率培养流程图参见图4所示，图4中，

A％——可培养率

M——稀释平板法培养计数所得的微生物数量

N——DAPI荧光染色计数所得的微生物数量

传统平板培养的可培养率：对泥样进行稀释平板计数可知传统平板培养的微生物数，记为M₀。对稀释泥样进行DAPI荧光染色计数可知泥样中所有微生物数量，记为N₀。根据公式可得传统平板培养的微生物培养率。

微阵列透析室的可培养率：稀释平板计数法确定微阵列透析室培养后所得的微生物数，记为Mx。通过DAPI荧光染色计数法确定微阵列透析室培养后所得的总的微生物数，记为Nx。计算得出微阵列透析室的可培养率。

可培养率的高低并不能证明其中微生物种类的多寡，为进一步证明微阵列透析室可以培养出“非可培养”的微生物，需对其进行多样性分析，本实验中通过DGGE凝胶电泳检测技术分析样品中的微生物多样性。

DGGE检测流程主要包括三部分：DNA提取，16S rDNA基因序列的PCR扩增，DGGE电泳分析PCR产物。本实施例中采用化学裂解法与酶溶法相结合来提取DNA产物；再将DNA模板稀释50倍后取0.2μL对16S rDNA V3-V5区序列进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行结果检测；最后再对PCR产物进行DGGE电泳检测。

此外，对于原位培养及模拟原位培养下的可培养率，本实施例分别作如下分析：

由于随着稀释倍数的增加，样品中的微生物数量随之减少，营养物浓度也降到很低。通过DAPI荧光染色计数可知在湖水样品中微生物的数量约为5×10⁶个/mL左右，由此可知，稀释倍数为10¹、10²、10³时的微生物数量约为500/μL、50/μL、5/μL。

如图5所示，透析室培养的可培养率计算结果如下：模拟原位培养中A原样％＝2％；A1％＝4％；A2％＝8％；A3％＝15％；A4％＝10％；A平板％＝1％。原位培养中A原样％＝5％；A1％＝7％；A2％＝10％；A3％＝19％；A4％＝13％；A平板％＝1％。

由图5可知，微生物的可培养率高低呈正态分布。稀释10³倍时，透析室中微生物可培养率最高，即该稀释浓度为最佳接种浓度。在一定的稀释范围内，稀释倍数越高，样品中的优势菌种相对较少，给“非可培养”微生物提供了有利地生长条件，而稀释倍数为10⁴时，微生物的可培养率开始降低，这可能是由于稀释倍数过高，透析室中微生物含量过少，最终导致培养出的菌落数也减少。

此外，由图5还可以得到，原位培养的可培养率始终大于实验室模拟的原位培养，但是两者相同浓度培养的微生物可培养率差别并不大，这也就证明了实验采取微阵列透析室模拟原位环境培养微生物是可行的。同时也说明了微阵列透析室模拟原位环境只能培养出一部分“非可培养”的微生物，还需要多方考虑各种影响因素，进一步的改进和优化模拟的环境条件。

另外，由DGGE检测可以推知如下结论：

i、当样品稀释浓度为10³倍，即达到最佳接种浓度时，可培养的微生物种类最为丰富。

ii、透析室培养后所得的微生物在后期续培养分离时，在一定梯度范围内稀释培养时，微生物多样性并没有减少，这证实了实验通过稀释平板计数法测定可培养率时所得到的可培养菌落种类和原微阵列透析室中没有显著区别。

iii、各稀释梯度接种于透析室培养后所得到的微生物种类差别显著，不同梯度培养中都有不同的可培养菌种出现。

最后，参见图6和图7所示，本实施例还对上述LB培养基、A培养基、C培养基、CY培养基、CYE培养基及Y培养基这六种培养基的可培养率差异进行了研究，在实验时，所有接种的泥样均稀释10³倍。

由图7给出的实验结果可知，CYE培养基的可培养率最高，CY次之，A培养基最低。从营养成分上分析，CYE培养基中配有胰蛋白水解酪氨基酸，酵母提取物，并加有灭菌后的湖水，拥有丰富的氮源、碳源、维生素等，可以满足大部分微生物的生长所需。而灭菌的湖水中可能含有某些微生物所必需的生长因子，可以促使一部分非可培养的微生物在此培养基环境中生长，致使可培养率较CY、LB培养基高。

相对应地，本实施例还对采用上述不同培养基时的微生物多样性进行了实验。由DGGE电泳图谱得到，在相同稀释倍数下，不同培养基所培养的微生物多样性也存在明显的差异，其中C培养基条件下微生物多样性最丰富，可培养的微生物种类最多。而结合上述可培养率的实验可知，C培养基中的微生物可培养率较低，这说明了在寡营养条件下，一些优势菌种无法大量增殖，促使一些相对劣势的菌种被培养出来。这也证明了自然界中“非可培养”微生物的主体地位。

Claims (10)

1.一种微阵列透析室，其特征在于：包括上盖板(1)、下盖板(2)及夹设固定在上、下盖板之间的中心板(3)，在所述上、下盖板(1、2)及中心板(3)上分别设有上下严格对齐的微孔阵列(4)，在上盖板(1)的微孔阵列与中心板(3)的微孔阵列之间夹设有第一微孔滤膜(51)，在下盖板(2)的微孔阵列与中心板(3)的微孔阵列之间夹设有第二微孔滤膜(52)，所述中心板(3)的微孔阵列中的各微孔被所述的第一微孔滤膜(51)和第二微孔滤膜(52)隔离成独立的透析室。

2.根据权利要求1所述的微阵列透析室，其特征在于：所述微孔阵列(4)中各微孔的孔径为1～2mm。

3.根据权利要求1或2所述的微阵列透析室，其特征在于：所述的上、下盖板(1、2)及中心板(3)均为长方形，在上、下盖板(1、2)及中心板(3)上沿各自长度方向分别设有两个所述的微孔阵列(4)，且所述的微孔阵列(4)为圆形，对应地，所述的第一微孔滤膜(51)和第二微孔滤膜(52)也均为圆形。

4.根据权利要求3所述的微阵列透析室，其特征在于：所述微孔阵列(4)的直径为25mm，所述第一微孔滤膜(51)中各微孔的孔径及所述第二微孔滤膜(52)中各微孔的孔径均为0.1μm。

5.根据权利要求1或2所述的微阵列透析室，其特征在于：在所述上盖板(1)的上表面及下盖板(2)的下表面均开有圆形凹槽(6)，所述上、下盖板(1、2)上的微孔阵列(4)分别成型于各自所在盖板的圆形凹槽(6)的底部。

6.根据权利要求1或2所述的微阵列透析室，其特征在于：所述的上、下盖板(1、2)及中心板(3)均采用聚甲醛板。

7.一种利用权利要求1所述的透析室的富集培养方法，其特征在于包括如下步骤：

(一)、将样品按不同浓度梯度稀释后分别与一培养基充分混合并分别接种于所述透析室内，之后对不同浓度梯度稀释下的样品分别进行原位培养和模拟原位培养；

(二)、获取上述经原位培养和模拟原位培养后的样品，并分别溶解于灭菌生理盐水以制成原位培养下的原浓度菌液和模拟原位培养下的原浓度菌液，再将上述两原浓度菌液分别进行平板涂布培养；

(三)、结合稀释平板计数法和DAPI荧光染色计数法，分别计算在原位培养下和在模拟原位培养下所述透析室对应不同浓度梯度时的可培养率，并采用DGGE凝胶电泳检测技术分别分析样品在原位培养和模拟原位培养下对应不同浓度梯度稀释时的微生物多样化差别。

8.根据权利要求7所述的富集培养方法，其特征在于根据步骤(三)的可培养率求得最佳稀释培养浓度，并分析不同培养基在上述最佳稀释培养浓度下的可培养率和微生物多样性。

9.根据权利要求7或8所述的富集培养方法，其特征在于步骤(三)中所述的DGGE凝胶电泳检测包括如下三个步骤：

①、采用化学裂解法与酶溶法相结合提取DNA；

②、将DNA模板稀释50倍后取0.2μL对16S rDNAV3-V5区序列进行PCR扩增；

③、对PCR产物进行DGGE电泳检测。

10.根据权利要求7所述的富集培养方法，其特征在于所述菌株的培养基为LB固体培养基，该LB固体培养基包括有0.7％琼脂、0.5％酵母提取物、1％胰蛋白胨及1％氯化钠。

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