CN102631388A

CN102631388A - 原人参三醇组皂苷组合物及其在制备抗帕金森药物中的用途

Info

Publication number: CN102631388A
Application number: CN2012100954985A
Authority: CN
Inventors: 窦德强; 李东微; 李冀; 康廷国
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2012-04-02
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明公开了一种人参三醇组皂苷组合物、及其在制备免疫增强药物中的用途，该人参三醇组皂苷组合物至少包括重量百分比为5-60%的人参皂苷-Re，百分比为5-60%的人参皂苷-Rg₁。本发明中的人参三醇组皂苷组合物在抗帕金森病方面比单体人参皂苷的活性强，生物利用度高，而且制备方法简单，价格便宜。

Description

原人参三醇组皂苷组合物及其在制备抗帕金森药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种中药及其应用，具体是以原人参三醇组皂苷为活性成分的药物组合物及其在制备抗帕金森药物中的用途。

背景技术

帕金森病(PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元渐进性死亡为病理特征的中枢神经系统退行性疾病。目前治疗手段主要以西药为主，但只改善症状，不能控制其进程，长期应用疗效减弱且毒性增大。而中药治疗具有毒副作用小、协同作用强等优势而更具有开发前景。研究表明人参皂苷-Rg1、-Re、-Rg2及其代谢产物原人参三醇均具有抗帕金森作用（1.张均田.神经元-突触丢失与老年性痴呆.神经药理学报 2011,1(1):1-14；2.徐培培，曹颖琳，张万琴. 人参皂苷Re 对帕金森病小鼠保护作用—人参皂甙-Re抗黑质神经元凋亡的机制初探.中国天然药物 2004,2(3):171-175.）。原人参三醇组皂苷（Protopanaxatriol, PPT）主要由人参皂苷-Re和-Rg1组成，根据总皂苷的来源不同，二者的比例不同。如来源于人参茎叶总皂苷制备的PPT组皂苷中，-Re的含量较高，而来源于三七根总皂苷的PPT组皂苷中，-Rg1的含量较高。

PPT型皂苷包括人参皂苷-Re,-Rg1,Rg2,-Rh1等。我们的研究表明它们的水溶性都很小，生物利用度较低，限制了单体皂苷的临床开发与应用。人参皂苷-Re和-Rg1在水中的溶解度分别为1.2mg/ml和0.9mg/ml, 而其它的PPT型皂苷的极性较-Re的极性弱，溶解度更小。而PPT组皂苷的在水中溶解度可达400mg/ml以上。与单体皂苷-Rg1和-Re比较，二者在PPT中的生物利用度较单体皂苷高。我们曾经发现PPT组皂苷在免疫增强方面的活性强于单体皂苷（窦德强，丘鹰昆，康廷国，徐为群，于君丽. 人参三醇组皂苷组合物及其在制备免疫增强药物中的用途，专利号：ZL200810228727.X）。单体皂苷一般毒性较大，而且制备工艺较复杂，成本较高。原人参三醇组皂苷较单体皂苷制备成本为低。以上提示我们由于单体皂苷之间的协同作用，PPT组合物是否具有更好抗帕金森病的作用。经过我们研究发现PPT组皂苷在抗帕金森病方面明显好于单体皂苷。因此PPT组皂苷由于成本、生物利用度及活性较强等因素，具有更好的成药性，更适合成为抗帕金森症的药物，形成了本专利。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题而提供了一种原人参三醇组皂苷组合物，本发明中的原人参三醇组皂苷组合物在抗帕金森方面远远大于单体人参皂苷的活性。

本发明的另一目的是提供了一种原人参三醇组皂苷组合物在抗帕金森药物中的用途。

为实现上述目的而采用的技术方案如下：

原人参三醇组皂苷组合物，其特征在于该组合物中具有抗帕金森活性成份主要有人参皂苷-Re、人参皂苷-Rg₁、人参皂苷-Rg₂、人参皂苷-Rh₁，其重量百分比为人参皂苷-Re 5-60%、人参皂苷-Rg₁5-60%、人参皂苷-Rg₂0-30%、人参皂苷-Rh₁0-30%，混合配制成。

前述原人参三醇组皂苷组合物中，所述人参皂苷-Rg₂，即可以是20(S)-Rg₂，又可以是20(R)-Rg₂，或者是上述两种组分的组合。

上述原人参三醇组皂苷组合物中，所述人参皂苷-Rh1，即可以是20(S)-Rh₁或20(R)-Rh₁，或者是上述两种组分的组合。

为了克服现有制剂的上述缺点，我们制备了前述重量配比的原人参三醇组皂苷组合物，并对其提取物的抗帕金森作用进行评价，我们发现，上述原人参三醇组皂苷组合物的抗帕金森活性显著强于原人参三醇型单体皂苷，说明原人参三醇组皂苷组合物在抗帕金森方面的作用显著强于人参皂苷单体。由于原人参三醇组皂苷的毒副作用较单体皂苷低，更适合帕金森患者的长期使用。

本发明所述的原人参三醇组皂苷组合物还可以包括少量的其它组分：如人参皂苷-Rd或者不影响本组合物抗帕金森效果的其它杂质。

在本发明中，人参皂苷-Re、-Rg₁、-Rf、20(S)-Rg₂、20(R)-Rg₂、20(S)-Rh₁、20(R)-Rh₁均可以通过市场购买获得，按照上述比例直接混合后制得上述组合物。

本发明中的人参三醇组皂苷组合物还可以通过以下的方法获得：

一种原人参三醇组皂苷组合物的制备方法，具体步骤如下：

取人参茎叶（人参根、西洋参根和茎叶、三七根及茎叶）粗粉1000g，以10000毫升的水，提取2—3次，分别过滤，合并滤液，静置24小时，取上清液，上大孔树脂柱D101或HPD700分离后（树脂：生药量=2：1），分别用质量浓度为30—40%的乙醇和质量浓度为70—85%的乙醇洗脱，分别得到原人参三醇组皂苷洗脱液和原人参二醇组皂苷洗脱液。该人参三醇组皂苷洗脱液经浓缩至50℃下相对密相为1.0-1.30的浓缩液，喷雾干燥或减压干燥，干燥后即为成品。

前述原人参三醇组皂苷组合物在制备抗帕金森药物中的应用。

本发明中的上述比例的原人参三醇组皂苷组合物的抗帕金森病的活性远远大于人参单体皂苷，并提高了抗帕金森病作用的疗效，降低了毒副作用。另外，制备方法简单，生产成本低。

具体实施方式

实施例一原人参三醇型皂苷及原人参三醇组皂苷的水中溶解度

根据2010版药典（文献），称取研成细粉的供试品，于25℃±2℃一定容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒钟；观察30分钟内的溶解情况，如无目视可见的溶质颗粒或液滴时，即视为完全溶解。根据此法测定本实验室自制的原人参三醇组皂苷为易溶，溶解度约为429mg/ml，人参皂苷-Re、-Rg1、-Rg2和-Rh1在水中的溶解度约为1.2mg/ml、0.9mg/ml、0.4mg/ml和0.3mg/ml。

实施例二

原人参三醇组皂苷组合物，是由50%人参皂苷-Re和50%人参皂苷-Rg1混合制成。

实施例三

原人参三醇组皂苷组合物，是由人参皂苷-Re 40%、人参皂苷-Rg₁35%、人参皂苷-Rg₂15%、人参皂苷-Rh₁10%混合配制成。

实施例四

原人参三醇组皂苷组合物，是由40%人参皂苷-Re、40%人参皂苷-Rg₁、10%人参皂苷-Rg₂和10%人参皂苷-Rh₁混合配制成。

实施例五

原人参三醇组皂苷组合物，是由人参茎叶粗粉提取制成具体工艺如下：取人参茎叶粗粉1000g，以10000毫升的水，提取2—3次，分别过滤，合并滤液，静置24小时，取上清液，上大孔树脂柱D101或HPD700分离后（树脂：生药量=1：1），分别用质量浓度为30—40%的乙醇（洗脱剂为树脂体积的4倍量）和质量浓度为70—85%的乙醇洗脱（洗脱剂为树脂体积的4倍量），分别得到原人参三醇组皂苷洗脱液和原人参二醇组皂苷洗脱液。该人参三醇组皂苷洗脱液经浓缩至50℃下相对密相为1.0-1.30的浓缩液，喷粉干燥，干燥后即为成品。收率为3-5%，经HPLC含量测定(HPLC, ODS 柱，流动相乙腈-水梯度，203nm检测)，该组合物含人参皂苷-Re 52.3 %、人参皂苷-Rg₁12.2 %、20(S)-人参皂苷-Rg₂ 2.1%、20(R)-人参皂苷-Rg₂ 1.6%、人参皂苷-Rh₁ 1.2%、20(R) -人参皂苷-Rh₁0.6%，上述百分比为重量百分比，余量为人参茎叶中含有的原人参二醇型皂苷（2-3%）及其他成分。

实验例1 原人参三醇组皂苷和人参单体皂苷的抗帕金森作用比较

1.实验材料：C57BL/6小鼠购自大连医科大学动物实验中心，所用原人参三醇组皂苷为采用上述工艺自制。

2.动物分组：将100只C57BL/6小鼠随机分为十组：空白组、模型组、高低剂量三醇组和单体皂苷组-Re、-Rg1、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1（本实验室自制，纯度＞98%），每组10只。

2.造模及给药方法：高低剂量原人参三醇组和单体皂苷组分别每天给药一次，连续给药13天。高低剂量原人参三醇组组皂苷分别给药25mg/kg、12.5mg/kg，各单体皂苷组分别给药25mg/kg。与给药后第9天开始，模型组、高低剂量三醇组和各单体皂苷组皮下注射MPTP （购于Sigma公司，批号：1001054803） 25 mg/kg，每天一次，连续5 d。空白组以腹腔注射等量生理盐水代替MPTP，每天一次。同时每天进行动物行为学实验考查。

3.行为学考查

3.1 悬挂实验(Traction test)：

目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将受试小鼠悬挂于一水平电线上，电线直径约为0.2mm。从小鼠双前爪抓住电线开始计时，小鼠掉落则计时结束。25秒以上的记6分；20-25秒记5分；15-20秒记4分；10-15秒记3分；5-10s记2分；0-5s记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠抓住电线越牢固；说明小鼠肢体运动协调情况越好，反之，则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重。结果见表1。

表1 悬挂实验得分结果 ( ±s)

剂量（mg/kg）

第9天

第10天

第11天

第12天

第13天

空白组

--

6.00±0.00

5.67±1.15

5.38±1.70

5.58±1.11

5.47±0.75

模型组

--

5.40±1.07

3.50±1.12

2.00±1.41^△△

2.30±1.34^△△

1.70±0.95^△△

三醇组

12.5

5.75±0.71

3.67±1.06

2.83±1.14^▲

3.75±1.49^▲

3.17±1.17^▲

三醇组

25

6.00±0.00

4.33±1.25

4.12±1.96^▲

3.83±1.47^▲

4.23±1.85^▲▲

-Re

25

6.00±0.00

3.78±1.09

3.11±1.21^▲

3.96±1.32^▲

3.32±1.12^▲

-Rg1

25

5.90±0.11

3.41±1.45

4.10±1.17^▲

2.84±1.53

2.56±0.88

20(S)-Rg2

25

5.73±0.73

3.67±1.46

2.33±1.47

2.75±1.54

2.33±0.96

20(R)-Rg2

25

6.00±0.00

3.33±1.32

2.28±1.94

2.30±0.84

2.20±1.15

20(S)-Rh1

25

6.00±0.00

3.66±0.98

2.06±1.42

2.35±1.21

1.79±1.56

20(R)-Rh1

25

5.64±0.90

3.68±1.06

2.33±1.34

2.46±1.12

1.88±1.71

注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）； ▲与模型组比较，有差异（p<0.05），▲▲与模型组比较，有显著差异(p<0.01)。

3.2 爬杆实验(Pole test)：

目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将一直径为2.5 cm的软木球固定于一根长50 cm，直径1 cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录小鼠爬完杆子所需要的时间。然后按以下标准记分：0-3 秒内完成上述动作的记6分；3-6 秒内完成的记5分；6-9秒内完成的记4分；9-12秒内完成的记3分；12-15秒内完成的记2分；15秒以上的记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠爬完杆子的全程所用的时间越少，说明小鼠肢体运动协调情况越好，也说明小鼠对爬杆实验越来越熟练，结果见表2。

表2 爬杆实验得分结果(

±s)

剂量（mg/kg）

第9天

第10天

第11天

第12天

第13天

空白组

--

6.00±0.00

4.30±0.52

4.75±0.46

5.12±0.35

4.83±0.75

模型组

--

4.80±0.41

3.50±1.38

3.38±1.41^△

3.00±1.07^△△

2.50±0.84^△△

三醇组

12.5

4.90±0.32

4.20±1.32

4.00±0.92

4.38±0.74^▲

3.83±0.98^▲

三醇组

25

4.60±0.52

4.80±0.41

4.88±0.83^▲

4.00±0.76^▲

4.33±0.82^▲

-Re

25

5.90±0.31

3.90±1.12

3.58±0.96

4.13±0.76^▲

4.23±0.56^▲

-Rg1

25

6.00±0.00

4.50±0.52

4.67±1.07^▲

4.20±0.88^▲

3.80±0.65^▲

20(S)-Rg2

25

5.53±0.36

3.88±1.06

3.50±0.82

3.15±0.54

2.73±1.21

20(R)-Rg2

25

6.00±0.00

3.50±0.67

3.20±0.92

2.90±0.83

2.84±1.08

20(S)-Rh1

25

5.60±0.67

3.38±0.45

3.67±1.22

2.67±0.41

2.45±0.57

20(R)-Rh1

25

6.00±0.00

3.67±0.87

3.20±0.75

2.83±0.76

2.50±0.33

注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）； ▲与模型组比较，有差异（p<0.05）；

3.3 游泳实验(Swim test)：目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将受试小鼠放入一个20 cm x 30cm×20 cm 规格的水箱中，水温为22℃～25℃。记录1min内小鼠漂浮的时间。评分标准如下：在1min内，漂浮时间在10s内的记6分；20s内的记5分；30s内的记4分；40s内的记3分；50s内的记2分；超出50s 的记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠游泳的时间越多；说明小鼠肢体运动协调情况越好，反之，则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重。结果见表3。

表3游泳实验得分结果(

±s)

剂量（mg/kg）

第9天

第10天

第11天

第12天

第13天

空白组

--

6.00±0.00

5.80±0.45

6.00±0.00

模型组

--

5.70±0.52

4.30±0.82

4.50±1.22^△△

4.33±1.03^△△

3.83±0.75^△△

三醇组

12.5

6.00±0.00

5.62±0.52^▲

5.50±0.71^▲▲

5.00±0.82^▲

5.14±0.90^▲▲

三醇组

25

6.00±0.00

5.40±0.70^▲

5.88±0.35^▲▲

5.75±0.46^▲▲

5.80±0.42^▲▲

-Re

25

6.00±0.00

5.50±0.67^▲

5.58±0.45^▲

5.53±0.95^▲▲

5.24±0.83^▲▲

-Rg1

25

5.83±0.48

4.73±0.58

4.38±0.69

5.82±1.02^▲▲

4.78±0.83^▲

20(S)-Rg2

25

6.00±0.00

4.45±0.96

4.55±0.57

4.50±0.65

3.62±1.25

20(R)-Rg2

25

5.67±0.96

4.20±0.76

4.03±0.85

4.30±0.54

3.40±1.04

20(S)-Rh1

25

5.70±0.52

4.45±0.55

4.56±0.64

3.84±1.65

3.96±0.66

20(R)-Rh1

25

6.00±0.00

4.30±0.83

4.04±0.28

4.21±0.87

3.87±0.71

注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）； ▲与模型组比较，有差异（p<0.05）；▲▲与模型组比较，有显著差异(p<0.01)

行为学实验结果表明，原人参三醇组皂苷提取物可明显增强小鼠的悬挂指数、爬杆指数和游泳指数，具有显著改善MPTP模型C57BL/6小鼠行为学的作用，其作用强于人参皂苷-Re等单体皂苷。

实施例2 原人参三醇组皂苷抗帕金森病的血清药理学研究

1.实验材料

方法采用SD大鼠，雌雄各半，体重200±20克，购自大连医科大学。人参单体皂苷和原人参三醇组皂苷为本实验室自制、人参茎叶皂苷三醇组，由本实验室自制。称取人参皂苷-Re、-Rg1、-20(S)-Rg2、-20(R)-Rg2、 -20(S)-Rh1、 -20(R)-Rh1适量，分别配制成4mg/mL溶液，待用。称取人参茎叶三醇型皂苷适量，配制成4mg/mL的溶液，待用。

2．方法

2.1 药物血清的制备

大鼠适应性饲养3天，自由饮水进食。随机分为各单体皂苷组、三醇组和空白组：每次分别给各单体皂苷、高剂量三醇组溶液12.5mg/kg和低剂量三醇组溶液6.25mg/kg，每天灌胃给药2次，连续给药7次；空白组给予等量生理盐水。于末次给药后0.5h摘眼球取血，静置0.5h后，3000rpm/min离心10min，分离血清，然后56℃灭活30min以除去可能存在的生物活性物质，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。

2.2细胞分组与处理

人母神经细胞瘤系细胞（SH-SY5Y细胞，购于中科院上海细胞库）。用含10％灭活胎牛血清、青霉素100U·mL-1、链霉素100μg·mL-1的 DMEM F-12培养液培养SH-SY5Y细胞，隔天更换培养液，培养至单层细胞约80%汇合时，传代培养，用对数生长期的细胞进行实验。调整细胞密度为1×10⁵接种于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂的培养箱中，培养16h待细胞贴壁。将细胞随机分为3组：实验组、模型组和空白血清组，每组设3个复孔。模型组不加任何血清；空白血清组只加空白血清；实验组分别加入含体积分数5%、10%和20%含药血清的完全培养基，空白血清组只加相应体积分数的空白血清；于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h后，实验组和模型组同时加入1mM的MPP⁺(购于sigma公司，批号：72111)，继续培养48h。3组细胞每孔加5mg/mL MTT 10μL，培养4h，吸去孔内培养基，每孔加DMSO 100μL，待结晶充分溶解，酶标仪检测 492nm处各孔的吸收值(OD值)(参考波长620nm)，计算细胞存活率。

细胞存活率％=实验组OD值／对照组OD值×100％

统计学处理数据以均数±标准差(

±s)表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学处理。

3、结果

预先加入体积分数为5%、10%和20%的空白血清组细胞存活率分别为（42.24%±1.71%）、（42.53%±1.09%）和（37.01%±0.97%），预先加入高、低剂量的三醇组含药血清的存活率显著增加，与模型组有显著统计学意义，预先加入体积分数为5%和10%的人参皂苷-Re和-Rg₁含药血清组的存活率显著增加（p<0.001，与模型组比较），而预先加入体积分数为20%的人参皂苷-Rg₁含药血清组的存活率明显增加（p<0.01，与模型组比较），以上结果表明，一定体积分数的人参皂苷三醇组、人参皂苷-Re和-Rg₁含药血清对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞有明显的保护作用。

表1 不同体积分数的含药血清对抗MPP⁺细胞毒性后的SH-SY5Y细胞存活率(

±s)

* p<0.05， ** p<0.01 ，*** p<0.001 with model group

上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims

1.原人参三醇组皂苷组合物，其特征在于该组合物中具有免疫增强功能的活性成份主要有人参皂苷-Re、人参皂苷-Rg₁、人参皂苷-Rg₂和人参皂苷-Rh₁，其重量百分比为人参皂苷-Re 5-60%、人参皂苷-Rg₁5-60%、人参皂苷-Rg₂0-30%、人参皂苷-Rh₁0-30%。

2.根据权利要求1所述的原人参三醇组皂苷组合物，其特征是由50%人参皂苷-Re和50%人参皂苷-Rg1混合制成。

3.根据权利要求1所述的原人参三醇组皂苷组合物，其特征是由人参皂苷-Re 40%、人参皂苷-Rg₁35%、人参皂苷-Rg₂15%、人参皂苷-Rh₁10%混合配制成。

4.根据权利要求1所述的原人参三醇组皂苷组合物，其特征是由40%人参皂苷-Re、40%人参皂苷-Rg₁、10%人参皂苷-Rg₂和10%人参皂苷-Rh₁混合配制成。

5.根据权利要求1所述的原人参三醇组皂苷组合物，其特征是由人参茎叶粗粉提取制成：

取人参茎叶粗粉1000g，以质量浓度为70%的乙醇进行提取，收集提取液，静止24小时，取上清液回收乙醇至无醇味，上大孔吸附树脂柱AB-8分离，树脂：生药量=5：1，分离后先用40%质量浓度的乙醇洗脱，再用质量浓度为70%的乙醇洗脱得原人参三醇组皂苷洗脱液，原人参三醇组皂苷洗脱液经浓缩至相对密度为1.0-1.3的浓缩药液，再干燥得原人参三醇组皂苷提取物，收率为10%，经HPLC含量测定，HPLC, ODS 柱，流动相乙腈-水梯度，203nm检测，该组合物含人参皂苷-Re 52.3 %、人参皂苷-Rg₁12.2 %、20(S)-人参皂苷-Rg₂ 2.1%、20(R)-人参皂苷-Rg₂ 1.6%、人参皂苷-Rh₁ 1.2%、20(R) -人参皂苷-Rh₁0.6%，上述百分比为重量百分比，余量为人参茎叶中含有的原人参二醇型皂苷（2-3%）、色素及其它成分。

6.根据权利要求1、2、3或4所述的原人参三醇组皂苷组合物，其特征是能用于制备抗帕金森病药物。