CN102621119A - 多道荧光滤光器立方盒及荧光显微成像系统 - Google Patents

Abstract

一种多道荧光滤光器立方盒,包括包含激发滤光片组、发射滤光片组、二相色镜或分光镜，激发滤光片与发射滤光片分别固定于立方盒相邻的两个垂直平面上，二相色镜或分光镜位于激发滤光片与发射滤光片之间45度的夹角面上，在立方盒与发射滤光片的相对面上开有孔，其要点在于所述的激发滤光片组由至少两片激发滤光片等距离镶嵌在底衬上,底衬的两端固定于转轮上，所述的发射滤光片组由至少两片发射滤光片等距离镶嵌在底衬上，底衬的两端固定于转轮上。本发明可以在较小体积内很容易实现大量的滤片的存储，能够对多于10种荧光团进行观察，使用多道荧光滤光器立方盒的荧光成像设备可以既对空间高分辨率成像，还可以对光谱高分辨率成像。

Description

多道荧光滤光器立方盒及荧光显微成像系统

技术领域

本发明涉及一种荧光显微成像装置, 特别涉及到一种荧光显微成像装置中能够对激发光、发射光等进行频段修改的荧光滤光器立方盒装置以及包含该装置的多道荧光显微成像装置。

背景技术

荧光显微成像系统是目前生物医学研究、临床医学研究以及制药业研究的基础工具。激发荧光成像技术是在分子水平上对基因、蛋白、药物与细胞相互作用过程进行观察的最基本技术，在该成像技术中,是对生物样本中所感兴趣的目标物质及其随空间的分布进行观察，在生物荧光观察系统或成像系统,一般需要对某种目标物质(如疾病标志物)的一个或几个特征波段进行成像。在现代分子生物实验中,为了对感兴趣的目标物质进行对比度高、特异性高、或者说灵敏度高的观察,常常使用具有特异标定性能的荧光标志物,该荧光标定物与感兴趣的目标物质的结合, 使得结合产物在一定频率的激发光照射下产生特定的波长一般长于激光光波长的荧光。常见荧光标定物质所对应的激发光波长、受激荧光波长如表一所示，常见荧光发射团的激发波长分布为 320 到750纳米，所发射的荧光波长分布范围为380纳米到780纳米。

表一

荧光物质	激发(照明) 光（纳米）	探测光（纳米）
				DAPI,	345	455
HOECHST 33342	343	483
				Lucifer yellow	425	528
Fluorescein	495	519
				Texas Red	589	613
HOECHST 33258	345	478
				Acridine Orange	503	530/640
Catecholamine, Serotonin	400-410	455
				GFP
RFP
				DsRed
Cy5.5
				ICG
Quinacrine,	400-440	475
				Acriflavine, Thioflavin S	420-440	475
FITC	450-480	515
				Acridine Orange	503	530/640
Rhodamine, Propidium iodide, TRITC	410-550	590
				MitoTracker Red CMXRos
Alexa Fluor 488 phalloidin

如图1所示，荧光显微成像装置的工作原理如下：从包含有多种频谱成分的激发光源10来的光经过激发滤光片17过滤，激发滤光片17将光源10的长波部分或不需要频率部分过滤出去， 剩余的允许进入成像观察照明光路的短波激发光照射到二相色镜19上，被二相色镜19反射后J1进入物镜8，短波激发光经过物镜8的聚焦后照射到放置在载物台6载玻片样品7上，样品7是含有生物制品或其它含有荧光标定物质的制片，样品7的荧光团在短波激发光J1照射下，瞬间产生波长短于激发光波长的发射光J2，该发射光经过物镜8后穿过二相色镜19，透过二相色镜19的发射光经过发射滤片18后，经过系列反射镜或光学装置后进入左右目镜12允许用户进行观察。发射光也可以进入数字摄像或其它光电转换成像装置11成像，数值图像显示在计算机的屏幕上。另外，荧光显微成像装置也会包含普通照明光源1，滤色片插板2，视场光阑3，反射镜4、聚光镜5等，提供对样品普通明场观察所需要的明场照明。

如图2所示，盒体框架、激发滤光片17、发射滤片18和二相色镜19构成一个荧光滤光器立方盒，激发滤光片17和发射滤片18常常是在该盒子的两个互相垂直的表面，二相色镜或分光镜位于激发滤光片17与发射滤光片18之间45度的夹角面上,荧光滤光器立方盒构成荧光显微成像装置的一个核心部件, 理想的激发滤光片17或者发射滤光片18是只允许入射光中特定频谱波段光高透率穿过，而对其它频率波段的光进行高效率截断。

理想的二相色镜19对于波长较短的发射光是一个理想的反射镜，不会对发射光波形或强度进行修整，只是让激发光100%反射，起到由入射方向到反射方向改向作用。对角线放置的二相色镜19将水平入射激发光沿垂直方向反射出去照射到样品上（使得样品吸收激发光能量而发出波长较长的荧光）；而对于波长较长的来自于样品的发射光来说就像一个透明窗口，不会对发射光的波形进行修整或衰减，只是让发射光100% 透过。

传统的荧光显微成像装置含有并行的2到3个如图2所示的荧光滤光器立方盒，其中一个滤光器立方盒实现对样品明场照明下观察，另外1到2各个荧光滤光器立方盒实现对样品相应的1到2个荧光团的荧光观察。如中国专利CN00217112.0所公布的方法进行推拉的方式来改变不同的荧光滤光器立方盒进入照明/成像光路。传统方法是通过增加荧光滤光器立方盒的个数来增加对于可观察的荧光团的种类。

在生物荧光观察中,一般需要对用一个样品进行多种目标物质荧光标定,形成多种荧光发光团，对一种荧光团成像,就得有一个匹配的激发光滤光片、一个发射光(或探测光)滤光片以及一个二相色镜来对该荧光团随空间分布成像，之后将对应于第一种荧光团的激发光滤光片、发射光滤光片和二相色镜移出光路,而将对应的用于探测第二种荧光团的激发光滤光片、发射光滤光片和二相色镜移进光路,实现对第二种荧光团的观察，由于对应于一种荧光团,其激发光、发射光波段是匹配的, 所以一般采用插件式荧光滤光器立方盒,包含有激发滤光片,发射滤光片、二相色镜。将荧光滤光器立方盒插入到普通显微镜光路中, 就形成可以进行荧光观察的生物荧光显微镜，对多个荧光标定物进行观察, 就得有多个荧光滤光器立方盒。

使用插件式荧光滤光器立方盒来实现多路光信号过滤与使用两个独立的滤光轮盘相比,形成的系统体积小, 价格偏低等优点。如中国专利CN201110065302.3 “激发荧光分子成像系统及一次荧光成像方法”分别使用两个滤光轮盘: 激发滤光轮盘和发射滤光轮盘，滤光轮盘的体积随着滤光片个数的增加几乎是按二次方增加, 因此适用于多道荧光观察(道数多余3)的滤光轮盘体积庞大 因为轮盘半径较小时, 轮盘表面不能将各个滤片不重叠的展开，如果将其中一个或两个滤光轮盘改换成带通中心频率可调得LCTF 或AOF,所形成的荧光成像装置体积更大, 价格更贵, 透过率更低。

 要对一种荧光标定物进行观察, 就要有一个对应的荧光滤光器立方盒，为了方便观察不同的荧光团, 中国专利CN00217112.0 “一种用于荧光显微镜的光谱波段快速转换装置”公开一种将多个激发滤光片放置在激发滤光片架上,将激发滤光片架整体呈抽屉状自该孔插入荧光滤光器立方盒,这样用户在使用时,可以选择不同的激发滤光片插入到荧光滤光器立方盒的箱体中，该方法缺点是当激发滤片数量较大时,所形成的荧光滤光器立方盒体积大，另外用户也不能选择不同的发射滤片或二相色镜或分光镜, 而根据表一所示, 不同荧光团的激发光与发射光有对应关系,或者说每种荧光团的激发光/发射光波段对是不同的, 常常是当激发光滤片变换时, 发射光滤片也需要跟着变换，由于受到体积限制, 使用该方法实现多道荧光观察的荧光显微成像系统通常只能有2-3道,很难高于5道。

为适应多种荧光团观察的所需要的激发滤光片/发射滤光片/分色镜要求,美国专利US6252664 公开一种插件式荧光滤光器立方盒,该发明使用的带通滤光片在频率在200到400纳米波长范围内具有几个高通波峰,二相色镜允许波长在415-800纳米的(发射) 光通过，而对200-400纳米波段的发射光进行发射，该方法的缺点是需要特殊制造的滤光片，而且所观察的荧光数难以超过10种。  

发明内容

本发明目的在于克服上述荧光滤光器立方盒存在的缺点，提供一种结构紧凑的可以对多种荧光团进行观察的荧光滤光器立方盒。

本发明所采用的技术方案为一种多道荧光滤光器立方盒, 包括包含激发滤光片组、发射滤光片组、二相色镜或分光镜，激发滤光片与发射滤光片分别固定于立方盒相邻的两个垂直平面上，二相色镜或分光镜位于激发滤光片与发射滤光片之间45度的夹角面上，在立方盒与发射滤光片的相对面上开有孔，其要点在于所述的激发滤光片组由至少两片激发滤光片等距离镶嵌在底衬上, 底衬的两端固定于转轮上，所述的发射滤光片组由至少两片发射滤光片等距离镶嵌在底衬上，底衬的两端固定于转轮上。

本发明将原先平放的激发滤光片和发射滤光片卷曲起来，象胶卷一样，使一个荧光滤光器立方盒可以存有多个激发滤光片和发射滤光片，可以对多种荧光团进行观察，结构紧凑。

所述的固定激发滤光片的底衬上下两端边缘开有定位齿孔，在立方盒上固定有与定位齿孔相配合的定位装置。

所述的固定发射滤光片的底衬上下两端边缘开有定位齿孔，在立方盒上固定有与定位齿孔相配合的定位装置。

二相色镜或分光镜是二相色镜组或分光镜组，由至少两片二相色镜滤光片或分光镜等距离镶嵌在底衬上, 底衬的两端固定于转轮上。

所述的固定二相色镜的底衬上下两端边缘开有定位齿孔，在立方盒上固定有与定位齿孔相配合的定位装置。

上述的定位装置可以为与齿孔相啮合的齿轮，其原理结构与使用胶圈的相机相似。

激发滤光片、发射滤光片、二相色镜或分光镜所固定的底衬可以是相同的材料也可不同，但其结构与固定方式和胶卷相似，两端卷曲，中间处于使用状态中的部分是平整的，即位于立方盒表面、对角面上的部分是平整的。转轮可以是相同的，也可根据各自的实际情况而不同。

本发明的二相色镜或分光镜也是多个的，这也是本发明对现有技术一个大改进，有了多个二相色镜或分光镜就能方便地选择所需要的二相色镜或分光镜置于光路中，而不用更换系统。

所述的衬底是整块柔软可以重复卷曲的材料，激发滤光片、滤光片、二相色镜或分光镜镶嵌在柔软衬底的表面，底衬背面有高于激发滤光片、发射滤光片、或分光镜的支撑凸起物。

这样当衬底在轴轮带动下卷曲时,支撑凸起物与衬底的背面接触，而滤光片表面不与衬底材料背面有摩擦接触。

同样所述的衬底可以是多块带有定位齿孔的材料的组合, 相邻衬底之间由柔软带有定位齿孔的材料连接，激发滤光片、滤光片、二相色镜或分光镜镶嵌在柔软衬底的表面，底衬背面有高于激发滤光片、发射滤光片或分光镜的支撑凸起物。

所述的激发滤光片两端的转轮、滤光片两端的转轮和二相色镜或分光镜两端的转轮分别与电机转动轴相连。

方便使用时能通过计算机进行控制操作。

激发滤光片组带有计算机可以自动识别的标定相应滤片的标记;发射滤光片组带有计算机可以自动识别的标定相应滤片的标记;二相色镜或分光镜组带有计算机可以自动识别的标定相应滤片/分光镜的标记。

所述的标记为条形码或磁条。

在计算机广泛应用的现代，在激发滤光片、发射滤光片、二相色镜或分光镜带有计算机可以自动识别的标记，方便其在使用过程中可能通过计算机进行选择，为自动检测提供可能。

所述的发射滤光片组中包含一个空白透通孔, 允许发射光源的所有频率成分未经任何修改地通过。

二相色镜组或分光镜组包含一个空白透通孔, 不对任何入射的激发光进行反射，只是允许从样品来的光全部透过。

激发滤光片组包含的滤片为窄带带通滤片，滤片组的峰值透过滤覆盖300纳米到750纳米，单个激发滤片直径在10毫米到40毫米之间， 一般选择25毫米；在短波段（λ≤600纳米），单个激发滤光片的峰值透过率中心波长可以是逐渐递增的，一个激发滤光片与相邻激发滤光片的峰值透过率中心波长的差值的绝对值大于或等于5纳米， 滤片组可以包含2-46个激发滤片。

发射滤光片组包含的滤片为窄带带通滤片，滤片组的峰值透过滤覆盖380纳米到780纳米，单个发射滤片直径在10毫米到40毫米之间，一般选择25毫米；在短波段（λ≤600纳米），单个发射滤片的峰值透过率中心波长可以是逐渐递增的， 一个发射滤片与相邻居发射滤片的峰值透过率中心波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，发射滤片组可以包含高达2-41个发射滤片。

分光镜组包含的分光镜片为长波通过短波反射分光镜。二相色相镜组或分光镜组发射与透过分界波长覆盖300纳米到750纳米，单个分光镜片边长在10毫米到40毫米之间，一般选择26毫米x 36毫米矩形分光镜；在短波段（λ≤600纳米），单个分光镜片的发射与透过分界波长可以是逐渐递增的，一个分光镜片与相邻分光镜片发射与透过分界波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，分光镜组可以包含高达2-46个分光镜片。

综上所述，本发明可以在较小体积内很容易实现大量的滤片的存储。该发明的优点随着所需要观察的荧光团种的数量的增多而更明显的显现。本发明所设计的多道荧光滤光器立方盒激发滤光片、发射滤光片、二相色镜或分光镜的识别及选择操纵控制都做了与计算机对接的设计，因此利用本发明的多道荧光滤光器立方盒制作的多道荧光显微成像装置，可以通过计算机进行控制，能够对多于10种荧光团进行观察，使用本发明所提供的多道荧光滤光器立方盒的荧光成像设备可以既对空间高分辨率成像，还可以对光谱高分辨率成像。

附图说明

图1为使用传统的荧光滤光器立方盒的荧光显微成像系统

图2为现有的荧光滤光器立方盒示意图

图3为本发明的结构示意图

图4为使用本发明的多道荧光滤光器立方盒的荧光显微成像系统

图5为可卷曲的发射滤光片组的结构示意图

图6为图5的俯视图

其中：1普通照明光源  2滤色片插板 3视场光阑  4反射镜 5聚光镜  6载物台 7样品    8物镜  9立方盒  10激发光源 11光电转换成像装置 12左右目镜 13计算机17激发滤光片 18发射滤光片   19二相色镜或分光镜  21二相色镜的底衬22有机薄膜29激发滤光片转轮 32发射滤光片转轮   35二相色镜转轮   41标记  50孔   51激发滤光片的底衬  

52发射滤光片的底衬  53齿孔   64支撑凸起物。

具体实施方式

如图3、5、6所示，一种多道荧光滤光器立方盒,是对现有的荧光滤光器立方盒进行改进，将原先平放的激发滤光片、发射滤光片和二相色镜或分光镜卷曲起来，象胶卷一样，使一个荧光滤光器立方盒可以存有多个激发滤光片、发射滤光片和二相色镜或分光镜，可以对多种荧光团进行观察。它包括有盒体框架和固定于盒体框架上的激发滤光片组、发射滤光片组、二相色镜或分光镜组，激发滤光片17与发射滤光片18分别固定于立方盒9相邻的两个垂直平面上，二相色镜或分光镜19位于激发滤光片17与发射滤光片18之间45度的夹角面上，在立方盒9与发射滤光片18的相对面上开有孔50，激发滤光片组由至少两片激发滤光片17等距离镶嵌在可以卷曲的激发滤光片的底衬51上, 底衬51的两端固定于激发滤光片转轮29上，为了保证激发滤光片17在工作平面上平整，在底衬51上下两端边缘开有定位齿孔53，在立方盒上固定有与定位齿孔53相配合的定位装置；同样所述的发射滤光片组由至少两片发射滤光片18等距离镶嵌在可以卷曲的发射滤光片的底衬52上，底衬52的两端固定于发射滤光片转轮32上，同样底衬52上下两端边缘开有定位齿孔53，在立方盒上固定有与定位齿孔53相配合的定位装置；二相色镜或分光镜组由至少两片二相色镜滤光片19等距离镶嵌在可以卷曲的二相色镜的底衬21上, 底衬21的两端固定于二相色镜转轮35上，同理底衬21上下两端边缘开有定位齿孔53，在立方盒上固定有与定位齿孔53相配合的定位装置。

上述的定位装置可以为与齿孔相啮合的齿轮或限位毛刷，其原理结构与使用胶圈的相机相似。衬底孔齿、运动装置的牙齿凸起、以及一些限位毛刷可以防止滤光片组运动过程中打滑、或者沿垂直运动方向的震动。

激发滤光片、发射滤光片、二相色镜或分光镜所固定的底衬可以是相同的材料也可不同，但其结构与固定方式和胶卷相似，两端卷曲，中间处于使用状态中的部分是平整的，即位于立方盒表面、对角面上的部分是平整的。转轮可以是相同的，也可根据各自的实际情况而不同。

本发明的核心是将传统的荧光滤光器立方盒的激发滤光片17改变为含有多个激发滤光片17的激发滤光片组；类似的，将发射滤光片18改变含有多个发射滤光片18的发射滤光片组，将二相色镜19改为含有多个二相色镜19的二相色镜组。这样在没有改变荧光滤光器立方盒的个数下，实现对众多（≧5）的不同荧光团的观察。

本发明所提供的技术方案是使用可以卷曲的滤片支撑材料来组装激发滤片/发射滤片/二相色镜等，只让需要进入光路的一个激发滤光片17和一个发射滤片18分别在立方体的两个垂直的表面上，一个二相色镜在立方体的对角线上，而将其它的激发滤片组的其余激发滤片17、发射滤片组的其余发射滤片18、二相色镜组的其余二相色镜19等卷曲起来，以减小各自占有空间，实现结构紧凑之目的。 

图5、图6所示为可卷曲的发射滤片组的结构示意图，同样也可是激发滤片组、二相色镜组的结构示意图，使用多个柔软激发滤片17及柔软底衬组成柔软激发滤片组，使用多个柔软发射滤片18及柔软底衬组成柔软发射滤片组，或使用多个柔软二相色镜19及柔软底衬组成柔软二相色镜组。在底衬52上下两端边缘开有定位齿孔53，激发滤光片17、发射滤光片18和二相色镜滤光片19镶嵌在柔软衬底的表面，底衬背面有高于激发滤光片17、发射滤光片18、二相色镜滤光片或分光镜19的支撑凸起物64。当发射滤光片组卷曲起来时，其正面将要与其背面接触，为避免摩擦损坏光学发射滤光片18 ，可以在发射滤光片（柔软光学膜层）18上覆盖透明有机薄膜22（如环氧树脂）， 也可以是将发射滤光片（柔软光学膜层）18深深地嵌入在低于软底衬52的表面，使得发射滤光片（柔软光学膜层）18四周的底衬材料都高于光学膜层18的表面，发射滤光片四周的底衬材料也可以是一些间断性支撑凸起64，或可以是一面使用保护膜一面使用支撑凸起，还可以是别的方法，激发滤光片组和二相色镜组的截面也类似（图略）。支撑凸起物64仅起到隔离作用，也可布置于底衬表面，即底衬表面有高于激发滤片17、发射滤片18、或分光镜19的支撑凸起物64, 当衬底在轴轮带动下卷曲时, 支撑凸起物与衬底背面接触而滤光片表面不与衬底材料背面接触（图略）。

 这些滤镜的具体制造方法可如中国专利申请CN201110379628.3 “一种可编程多光谱软底衬滤光片系统”所公布方法。先使用物理方法在真空环境下在普通耐高温底衬材料如玻璃底衬上镀介电系多层膜、或者介电金属膜系多层膜、或者全金属膜系多层膜。这些光学多层膜本生都是柔软可以弯曲的，只是为了耐镀膜及随后催化工艺所需要高温环境所使用的普通衬底如玻璃材料等不能弯曲。第二步是将镀好的滤片的柔软光学膜层17转换到可以卷曲的底衬材料上。该方法同样适用于发射滤片薄膜18 及由此组成的发射滤光片组。

二相色镜或分光镜组所包含的二相色镜或分光镜19是柔软可以弯曲的，这些二相色镜或分光镜的具体制造方法可如中国专利申请CN201110379628.3 “一种可编程多光谱软底衬滤光片系统”所公布方法。单个柔软二相色镜的制造工序与滤镜类似，只是所选的具体膜层数目不同。 

对应于激发滤片组的每个激发滤片17有一个标记（可编程编码器）41； 类似地，对应于发射滤片组的每个发射滤片18有一个标记（可编程编码器）；对应于二相色镜或分光镜组的每个二相色镜19有一个标记（可编程编码器）。 这些标记（可编程编码器）可以是条形码，或磁条，或是数目不同的透光孔，也可以是数字或别的在对应的传感器的协助下适于计算机对运动到光路的激发滤片/发射滤片/二相色镜等自动识别的标记。

发射滤光片组还可以包含一个空白透通孔，不对来自样品的光源的频率作任何修改，以方便提供普通照明光源的明场观察。

在第二个实施方案中，激发滤光片组所包含的激发滤光片为薄底衬不能明显大幅度弯曲的滤光片, 发射滤光片组所包含的发射滤光片是薄底衬不能明显大幅度弯曲的; 二相色镜或分光镜组所包含的二相色镜或分光镜是薄底衬不能明显大幅度弯曲的二相色镜或分光镜组; 将这些滤光片及分色镜使用多块带有定位齿孔53的材料的组合, 相邻衬底块之间由柔软带有定位齿孔的材料连接；激发滤片17、发射滤片18、或分光镜19镶嵌在衬底材料上表面之中, 一块衬底材料镶嵌一块激发滤片17、发射滤片18、或分光镜19。这样虽然一块滤镜及其衬底不能弯曲，多块滤镜组合却由于滤镜间的柔软连接而变得可以卷曲。在这一个具体实施方案中，卷曲起来的滤镜组每一个卷层不是严格的圆周，而是由多边形近似的圆周，每一个边包含一个滤镜及其底衬材料。

本发明的具体实施方案还可以是使用方案一中的柔软激发滤片膜17、柔软发射滤片膜18、柔软二相色镜膜19 组装在方案二中的可卷曲底衬中，还可以使使用上述方案二中的薄型（非柔软）激发滤片17、薄型（非柔软）发射滤片18、薄型（非柔软）二相色镜19 组装在方案一中的整块柔软可卷曲底衬中。 

所述的激发滤光片17两端的转轮、发射滤光片18两端的转轮和二相色镜或分光镜19两端的转轮分别与电机转动轴相连。

激发滤光片组包含的滤片为窄带带通滤片17， 滤片组的峰值透过滤覆盖300纳米到750纳米，单个激发滤片直径在10毫米到40毫米之间， 一般选择25毫米；在短波段（λ≤600纳米）， 单个激发滤光片17的峰值透过率中心波长可以是逐渐递增的， 一个激发滤光片17与相邻激发滤光片17 的峰值透过率中心波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，滤片组可以包含2-46片（甚至92片）激发滤片17。

 发射滤光片组包含的滤片为窄带带通滤片，滤片组的峰值透过滤覆盖380纳米到780纳米，单个发射滤片直径在10毫米到40毫米之间，一般选择25毫米；在短波段（λ≤600纳米）， 单个发射滤片的峰值透过率中心波长可以是逐渐递增的，一个发射滤片18与邻居发射滤片18的峰值透过率中心波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，滤片组可以包含2-41片（甚至82片）发射滤片18。

分光镜组包含的分光镜片为长波通过短波反射分光镜。二相色相镜组或分光镜组发射与透过分界波长覆盖300纳米到750纳米，单个分光镜片边长在10毫米到40毫米之间，一般选择26毫米x 36毫米矩形分光镜；在短波段（λ≤600纳米）， 单个分光镜片19的发射与透过分界波长可以是逐渐递增的， 一个分光镜片19与邻居分光镜片19 发射与透过分界波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，分光镜组可以包含2-46个分光镜片，甚至更高。

如图4所示，本发明所提供的多道荧光滤光器立方盒可以引入到倒置或正置显微成像系统中，配以频谱宽的光源如卤素灯、汞灯等或多个成像用激光光源，以及一套软件及控制系统就构成多道荧光显微成像装置。该多道荧光显微成像装置包含正置或倒置显微成像装置、本发明所提供的多道荧光滤光器立方盒9、激发光系统、以及控制系统。

    其中正置或倒置显微成像系统包含：照明光源1经过滤光片2、视场光阑3、反射镜4、聚光镜5后J1照射到放置在自动载物台6上待观察样品7，来自待测样品7的透射光（或者反射光）J2经过物镜8及其它光学仪器后进入观察目镜12或数字摄像系统11， 数字摄像系统获得图像显示在计算机13的屏幕。 

多道荧光滤光器立方盒9包含激发滤光片组、发射滤光片组、二相色镜或分光镜组。

激发光系统包括具有激发光所需频谱的光源10及相应光斑整形装置。

控制系统包括有计算机13，计算机内存有激发滤片运动、发射滤片运动和二相色镜或分光镜运动的控制软件，控制系统与多道荧光滤光器立方盒9相连，控制激发滤片运动、发射滤片运动、二相色镜或分光镜运动、识别激发滤片组标记41、识别发射滤片组标记、识别二相色镜组标记；控制系统与显微成像装置相连，控制其摄像系统11、载物台6、物镜转换器8。

该多道荧光显微成像装置提供常规明场观察的方法如下： 在操作员手工或计算机软件及控制系统自动控制下，激发光源10将关闭，不提供激发光；二相色镜组将其包含的透光孔移入光路，发射镜组将其包含的透光孔移入光路；普通照明光源1 将提供照明光，照明光源1经过滤光片2、视场光阑3、反射镜4、聚光镜5后照射到放置在自动载物台6上待观察样品7，来自待测样品7的透射光（或者反射光）经过物镜8、穿过二相色镜组的透光孔及发射滤镜组的透光孔及其它光学仪器后进入观察目镜12或数字摄像系统11， 数字摄像系统获得图像显示在计算机13的屏幕。 

该多道荧光显微成像装置提供对某样品No.1荧光物质的观察方法如下：

首先对样品进行普通明场观察，并调节样品感兴趣区域（ROI）在视场中位置；

其次对用户将感兴趣的No.1荧光物质的名称利用软件系统系统所提供的用户界面输入到计算机，计算机将利用该软件系统所包含的荧光物质及它们的激发光波段λ_1A /峰值发射光的频谱λ_1B信息显示给用户供核对； 

之后在操着员手工或计算机软件及控制系统自动控制下，明场照明光源1将关闭，激发光源10发光，提供激发光；

之后控制系统控制二相色镜组的运动，将选择对应于No.1荧光物质的二相色镜进入光路，同时将其它二相色镜移出光路；控制系统控制激发滤片组的运动，将选择峰值透过率包含波段λ1A的激发滤片17进入光路，同时将其它激发滤片17移出光路；控制系统控制发射滤片组的运动，将选择峰值透过率包含波段λ1B的发射滤片18进入光路，同时将其它发射滤片18移出光路；

再后，控制系统将控制数字摄像系统11的曝光，开始收集来自样品的荧光。从包含有多种频谱成分的激发光源10来的光经过激发滤光片17过滤，激发滤光片17将光源10的长波部分或不需要频率部分过滤出去，剩余的允许进入成像观察照明光路的短波激发光照射到二相色镜19上，被二相色镜19反射后进入物镜8。短波激发光经过物镜8的聚焦后照射到放置在载物台6载玻片样品7上。样品7是含有生物制品或其它含有荧光标定物质的制片，样品7的荧光团在短波激发光J₁照射下，瞬间产生波长短于激发光波长的发射光J₂，该发射光经过物镜8后穿过二相色镜19，透过二相色镜19的发射光经过发射滤片18后，经过系列反射镜或光学装置后进入数字摄像系统11；

最后，控制系统将控制数字摄像系统11停止曝光，结束对来自样品的特定波段的荧光的收集，并将所获得的图像显示在计算机13屏幕上。

该多道荧光显微成像装置提供对某样品N种（N≧2）荧光物质的观察方法如下：

首先对样品进行普通明场观察，并调节样品感兴趣区域（ROI）在视场中位置；

其次将用户将感兴趣的N种荧光物质的名称利用软件系统所提供的用户界面输入到计算机， 计算机将利用该软件系统所包含的荧光物质及它们的激发光波段λ_1A…λ_NA/峰值发射光的频谱λ_1B…λ_NB信息显示给用户供核对； 

再次实现对No.1荧光物质随空间分布的数字成像。 第一步：操着员手工或计算机软件及控制系统自动控制下，明场照明光源1将关闭，对含有λ_1A频谱的激发光源10供电并切入光路，提供激发光； 第二步，控制系统控制二相色镜组的运动，将选择对应于No.1荧光物质的二相色镜进入光路，同时将其它二相色镜移出光路；控制系统控制激发滤片组的运动，将选择峰值透过率包含波段λ_1A的激发滤片17进入光路，同时将其它激发滤片17移出光路；控制系统控制发射滤片组的运动，将选择峰值透过率包含波段λ_1B的发射滤片18进入光路，同时将其它发射滤片18移出光路；第三步，控制系统将控制数字摄像系统11的曝光， 开始收集来自样品的荧光。 从包含有多种频谱成分的激发光源10来的光经过激发滤光片17过滤，激发滤光片17将光源10的长波部分或不需要频率部分过滤出去，剩余的允许进入成像观察照明光路的短波激发光照射到二相色镜19上，被二相色镜19反射后进入物镜8。短波激发光经过物镜8的聚焦后照射到放置在载物台6载玻片样品7上。样品含有生物制品或其它含有荧光标定物质的制片，样品7的荧光团在短波激发光照射下，瞬间产生波长短于激发光波长的发射光，该发射光经过物价8后穿过二相色镜19。透过二相色镜19的发射光经过发射滤片18后，经过系列反射镜或光学装置后进入数字摄像系统11；第四步，控制系统将控制数字摄像系统11停止曝光，结束对来自样品的特定波段的荧光的收集，并将获得的图像显示在计算机13屏幕上并保存位图像I₁。

重复上述对No.1荧光物质随空间分布的数字成像中描述的第二步到第四步的过程实现对No.2荧光物质随空间分布的数字成像I₂， … ，No.N荧光物质随空间分布的数字成像I_N。

对上述过程获得的N种荧光物质的数字图像I₁， I₂， … , I_N进行处理，并利用伪彩色将它们混合后显示在计算机屏幕上给用户观察这N种荧光物质的空间位置关系。

本发明所提供的多道荧光滤光器立方盒还可以引入到倒置或正置共聚焦显微成像等系统中，形成相应的共聚焦荧光显微成像系统。

Claims (16)

1.一种多道荧光滤光器立方盒, 包括有盒体框架和固定于盒体框架上的激发滤光片组、发射滤光片组、二相色镜或分光镜（19），激发滤光片（17）与发射滤光片（18）分别固定于立方盒（9）相邻的两个垂直平面上，二相色镜或分光镜（19）位于激发滤光片（17）与发射滤光片（18）之间45度的夹角面上，在立方盒（9）与发射滤光片（18）的相对面上开有孔（50），其特征在于所述的激发滤光片组由至少两片激发滤光片（17）等距离镶嵌在底衬（51）上, 底衬（51）的两端固定于激发滤光片转轮（29）上，所述的发射滤光片组由至少两片发射滤光片（18）等距离镶嵌在底衬（52）上，底衬（52）的两端固定于发射滤光片转轮（32）上。

2.根据权利要求1所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的固定激发滤光片（17）的底衬（51）上下两端边缘开有定位齿孔（53），在立方盒上固定有与定位齿孔（53）相配合的定位装置。

3.根据权利要求1所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的固定发射滤光片（18）的底衬上下两端边缘开有定位齿孔，在立方盒上固定有与定位齿孔相配合的定位装置。

4.根据权利要求1所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的二相色镜或分光镜是二相色镜组或分光镜组，由至少两片二相色镜滤光片或分光镜（19）等距离镶嵌在底衬（21）上, 底衬的两端固定于转轮（35）上。

5.根据权利要求4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的固定二相色镜（19）的底衬（21）上下两端边缘开有定位齿孔，在立方盒上固定有与定位齿孔相配合的定位装置。

6.根据权利要求1或4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的衬底是整块柔软可以重复卷曲的材料，激发滤光片（17）、发射滤光片（18）和二相色镜滤光片（19）镶嵌在柔软衬底的表面，底衬背面有高于激发滤光片（17）、发射滤光片（18）、二相色镜滤光片或分光镜（19）的支撑凸起物（64）。

7.   根据权利要求1或4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的衬底是由多块带有定位齿孔的材料的组合, 相邻衬底之间由柔软带有定位齿孔的材料连接，激发滤光片（17）、发射滤光片（18）和二相色镜或分光镜（19）镶嵌在柔软衬底的表面，底衬背面有高于激发滤光片（17）、发射滤光片（18）、二相色镜滤光片或分光镜（19）的支撑凸起物（64）。

8.根据权利要求1或4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的激发滤光片（17）两端的激发滤光片转轮（29）、发射滤光片（18）两端的发射滤光片转轮（32）和二相色镜或分光镜（19）两端的转轮（35）分别与电机转动轴相连。

9.根据权利要求1或4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于激发滤光片组带有计算机可以自动识别的标定相应滤片的标记41;发射滤光片组带有计算机可以自动识别的标定相应滤片的标记;二相色镜或分光镜组带有计算机可以自动识别的标定相应滤片/分光镜的标记。

10.根据权利要求9所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的标记为条形码或磁条。

11.根据权利要求1所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的发射滤光片组中包含一个空白透通孔, 允许发射光源的所有频率成分未经任何修改地通过。

12.根据权利要求4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的二相色镜或分光镜组包含一个空白透通孔, 不对任何入射的激发光进行反射，只是允许从样品来的光全部透过。

13.根据权利要求1所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的激发滤光片组包含的滤片为窄带带通滤片，滤片组的峰值透过滤覆盖300纳米到750纳米，单个激发滤片直径在10毫米到40毫米之间， 一般选择25毫米；在短波段即λ≤600纳米，单个激发滤光片（17）的峰值透过率中心波长是逐渐递增的，一个激发滤光片与相邻激发滤光片（17）的峰值透过率中心波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，滤片组包含2-46个激发滤片（17）。

14.根据权利要求1所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的发射滤光片组包含的滤片为窄带带通滤片，滤片组的峰值透过滤覆盖380纳米到780纳米，单个发射滤片直径在10毫米到40毫米之间，一般选择25毫米；在短波段即λ≤600纳米，单个发射滤片（18）的峰值透过率中心波长是逐渐递增的，一个发射滤片与相邻发射滤片的峰值透过率中心波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，发射滤片组包含2-41个发射滤片（18）。

15.根据权利要求4所述的一种多道荧光滤光器立方盒，其特征在于所述的分光镜组包含的分光镜为长波通过短波反射分光镜，二相色相镜组或分光镜组发射与透过分界波长覆盖300纳米到750纳米，单个分光镜片边长在10毫米到40毫米之间，一般选择26毫米x 36毫米矩形分光镜；在短波段即λ≤600纳米，单个分光镜片（19）的发射与透过分界波长是逐渐递增的，一个分光镜片（19）与相邻分光镜片（19）发射与透过分界波长的差值的绝对值大于或等于5纳米，分光镜组包含高达2-46个分光镜片。

16.一种利用如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的多道荧光滤光器立方盒制作的多道荧光显微成像装置，它包含显微成像装置、多道荧光滤光器立方盒、激发光系统以及控制系统，其特征在于控制系统包括有计算机（13），计算机内存有控制激发滤片运动、发射滤片运动和二相色镜或分光镜运动的软件，控制系统与多道荧光滤光器立方盒（9）相连，控制激发滤片运动、发射滤片运动、二相色镜或分光镜运动、识别激发滤片组标记（41）、识别发射滤片组标记、识别二相色镜组标记；控制系统与显微成像装置相连，控制其摄像系统（11）、载物台（6）、物镜转换器（8）。

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