CN102618518A - 一种宽温淀粉酶的生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种宽温淀粉酶的生产方法，属于生物工程技术领域。本发明菌种为地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）BL-mut08，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO.M207193，在中国专利200810020635.2已公开。通过对原有地衣芽孢杆菌系统的复合诱变，保藏、复壮，及选育方法，经过培养基配方优化及发酵工艺条件优化，建立了生产宽温淀粉酶的方法，生产出淀粉酶具有较宽范围的作用温度和很高的耐热性。该菌株于37℃、培养72小时左右达到产酶高峰。发酵液经絮凝处理，压滤，超滤浓缩得到浓缩酶液或通过其他后加工方式得到不同的淀粉酶制剂，如微丸，颗粒或粉剂。该酶制剂可广泛用于食品、医药行业，特别如酒精发酵、味精、抗生素等行业以及纺织、造纸工业。
Description
发明领域
一种宽温淀粉酶的生产方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
淀粉酶是最成功工业化应用的酶制剂品种，由于酶促水解可在更大程度上控制淀粉水解、反应特异性和产物的稳定性。温和的反应条件包括较低的温度，接近中性的pH等，由此减少生产中能源的消耗、降低生产成本和环境污染。可提高产量并带来有益经济效益、社会效益等多种优势。
淀粉酶已被广泛应用于纺织行业的退浆、造纸行业淀粉浆的处理、食品行业如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；酒精工业的原料处理，具有极广泛的用途。
目前商品生产的淀粉酶为中温和高温淀粉酶，中温淀粉酶在60-90℃起作用，高温淀粉酶在90-105℃起作用。酒精工业是淀粉酶的消费大户，淀粉酶用于酒精行业时，对其性能又有着一些特殊性。一般来讲酒精行业主要使用的是粗原料，如干磨的玉米、小麦、木薯等。传统工艺采用的是高温蒸煮和液化，为了使原料能够充分液化，往往在80℃左右有一个预糊化的过程，而这一区间也是淀粉糊化的温度，黏度问题是需要解决的首要问题。以往主要使用中温淀粉酶降低淀粉的黏度，随后的液化主要采用高温喷射液化。这就需要一种既可以在糊化温度附近快速降低黏度，又可以在喷射液化时正常发挥作用的淀粉酶，也就是需要较宽范围的作用温度和很高的耐热性。本菌种生产的宽温淀粉酶就符合这一特性，其集合了中温淀粉酶和高温淀粉酶的优点，具有很强的工艺适应性。目前根据已报道的文献和专利总结如下：
细菌菌株B-9545，最适酶解条件为：50℃，pH 9.0（闫浩林、张惠丽等碱性淀粉酶产生菌的筛选和产酶条件研究，微生物学杂志，1996，1:26～30）。
Bacillus subtilis 14140&14141，最适酶解条件为：60～70℃、pH 6.0（管斌、谢来苏、丁友芳、隆言泉等枯草芽胞杆菌A-淀粉酶高产菌株的选育，浙江农业大学学报1997，23 (5) : 88～92）。
耐碱芽袍杆菌9-A2，最适酶解条件为：50℃，pH 8.0（贾士儒、赵树欣、Frznco G·Tevec耐碱芽袍杆菌碱性淀粉酶研究I-菌种的分离与筛选，天津轻纺工业学院学报1994，2: 1～6 )。
芽袍杆菌（Bacillus) ZX99，最适酶解条件为：60℃、pH 6.0（张应玖、朱学军、关键、李吉平、薛雁：一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选，微生物学通报2002，29 (5) : 38～41)。
嗜碱芽袍杆菌 SX212，最适酶解条件为：55℃，pH 9.0（马晓军、张晓君、杨玲、冯清平：支链淀粉酶产生菌的筛选及发酵条件的研究，兰州大学学报（自然科学版）2001，37 (6) : 80～85 )。
诺卡氏菌株Nocarlda sp 82，最适酶解条件为：60℃，pH 7.0（王银定、杨秀琴、王建平：诺卡氏菌胞外β-淀粉酶的分离和鉴定，河北大学学报（自然科学版）1997，17 ( 2 ) 41～45 )。
Asp. oryzaevar.30103，最适酶解条件为：60℃，pH 5.0；Rhi. niveus4810，最适酶解条件为：60℃，pH5.0（管斌、谢来苏、丁友芳、隆言泉：枯草芽胞杆菌A-淀粉酶高产菌株的选育，浙江农业大学学报1997，23（5）：88～92）。
地衣芽袍杆菌A. 404，最适酶解温度高于90℃；（杨傻豪、胡学智：地农芽袍杆菌A. 4041耐高温淀粉酶的研究，维普资讯1997: 286～289）。
地衣芽袍杆菌（Bacillus licheni/ormis) Js-S，最适酶解条件为：90℃；（李佑红、吴衍庸：地衣芽袍杆菌JS-5一淀粉酶的研究，微生物学报1998，29(4)：314～316）。
枯草芽袍杆菌(Bacillus subtilise) 8631，其最适酶解条件为：65C，pH5. 6（姜涌明、史永、隋德新：枯草芽袍杆菌86315 α－淀粉酶的研究II．分离提纯、性质及动力学，江苏农学院学报1992，13 (2) : 47～5 )。
米曲霉( Aspergillus oryzae）突变株6-193，其最适酶解条件为：60℃，pH 5.0～6.0（孔显良、王傻英、崔雅洁、姜面萍：米曲霉6-193 α-淀粉酶的纯化和性质的研究，微生物学报1991，31(4) : 274～280 )。
嗜碱芽袍杆菌NT-3，其最适酶解条件为：50℃，pH 9.0（田小群：嗜碱性芽袍杆菌（Bacillus sp）NT-39及其所产碱性淀粉酶的初步研究，武汉大学学报（自然科学版）1992，2: 105～111 )。
嗜碱单胞菌（alkalomonas amylolytics) N-10产生的α-淀粉酶，其最适酶解条件为：50℃，pH10（马延和、薛燕芬、窦岳坦：一种碱性α-淀粉酶、其编码基因及用途，专利公开号CN1500870A )。
古细菌芝田硫化叶茵Bl，其最适酶解条件为：60℃（刘莉、吴襟、陈炜、张树政：芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因工程菌表达条件的优化，中国生物工程杂志2003，23（1）： 70～74)。
古细菌(Pyrococcus furious)，其最适酶解条件为：95℃，pH 5.0(沈微、王正祥：古细菌(Pyrococcus furious)嗜热(α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达，食品与发酵工业2002，29（3）：10～14)；Thermomucor indicae-seudaticae，最适酶解条件为：60℃、pH 7.0（Sanjeev Kumar and T. Satyanarayana Purification and Kinetics of a Raw Starch-Hydrolyzing，Thermostab1e， and Neutral Clucoamylase of the Thermophilic Mold Thermomucor indicae-seudaticae Biotechnol. Prog. 2003，19，936～944）。
Bacteroides amylophi1us 70，最适酶解条件为：43℃、pH 6.3(Steven J. Mcwethy Paul A. Hartman Purification and Some Properties of an Ext-racellular Alpha-Amylase from Bacteroides amylophilusl Journal of Bacteriology，Mar. 1977，p. 1537～1544）。
Thermomonospora curvata，最适酶解条件为：65℃，pH 6.0 (Fred Stutz-enberger Rick Carnel Amylase Production by Thermomonospora curvata Applied and Enyromental Microbiology， Aug.1977，p.234～236）。
B. stearothermophilus1518，最适酶解条件为：60℃，B. coagulans 43P最适酶解条件为：70℃，Bacillus stearothermophilus ATCC 7954，最适酶解条件为：90℃（Paul A. Hartman Ralph Wellerson，JR. P. A.Tetrault Bacillus StearothermophilusI.-Thermal and pH Stability of the Amylase July 16，1954）。
Bcillus subtilis strain W23 & B. Amyloliquefaciens strain F最适酶解条件为65℃(N. E. WELTER' AND L. LEON CAMPBELL Comparison of the a Amylase of the α-Amylase of Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Oct. 1967，p. 1131～1135)。
Bacillus species NRRLB-3881，最适酶解条件为50℃，pH 9.5（E. W.BO-YER AND M. B. INGLE Extracellular Alkaline Amylase from a Bacillus Species JOURNAL OF BACTERIOLOGY，June 1972，p. 992～1000)。
Thermomonospora curvata，最适酶解条件为65℃，pH 6.0 (J.L. GLYMPH AND．J. STUTZENBERGER Production， Purification，and Characterizat-ion of α-Amylase from Thermomonospora curvata APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Oct. 1977，P. 391～397）。
Halobacteriumhalobium，最适酶解条件为55℃，pH 6. 6 （WENDYA. GOOD AND PAUL A. HARTMAN Properties of the Amylase from Halobacterium ha-lobium JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Oct. 1970，p. 601～603）。
利用芽袍杆菌NCIMB40916的淀粉酶基因构建的基因工程生产菌，产生的碱性淀粉酶最适酶解条件为：55℃，pH9.5（赫勒·奥特拉普比贾恩·R·尼尔森：碱性芽抱杆菌淀粉酶专利公开号CN1399676A)。
而能生产宽温淀粉酶的菌种及宽温淀粉酶的生产方法没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种产宽温淀粉酶菌株及用其发酵生产宽温淀粉酶的方法。
本发明的技术方案：一种宽温淀粉酶的生产方法，采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-mut08为出发菌株，经过种子培养和二级液体发酵培养，后处理以后得到宽温淀粉酶，后处理过程为：板框过滤，滤液用截留分子量为10000的中空纤维管式超滤膜浓缩至产品要求活力单位；
该地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-mut08，巳保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M207193，并申请中国专利，公开号CN101514327A，公开日2009年8月26日。
（1）斜面培养
斜面培养基，以g/L计：牛肉汁3-6，蛋白胨 5-15，酵母粉或酵母膏1-5，NaCl 1-5，淀粉 5-15，葡萄糖20-80，琼脂 15-25，以去离子水配制；
培养温度 30-40℃，培养时间20-40h；
（2）摇瓶培养
摇瓶培养基，以g/L计：豆饼粉 20-50，棉籽饼粉20-50，(NH4)2SO4 1-10，CaCl2 0.2-1.0，玉米浆 15-40，乳糖100-200，柠檬酸钠 1-10，磷酸氢二钾10-20，磷酸二氢钾5-10，以去离子水配制；
培养温度30-42℃，培养时间20-40h；
（3）种子罐培养
种子罐培养基，以g/L计：葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽饼粉5-20，硫酸铵2-6，柠檬酸钠 2-10，CaCl2 0.2-0.9，聚醚消泡剂P.P.E. 0.2-0.8，磷酸氢二钾4-10，磷酸二氢钾1-10，以去离子水配制；
发酵温度30-40℃，通风量0.2-1.0 V.V.M，罐压0.2~1.0 kg/cm2，培养时间：20-40小时；
（4）生产罐发酵
发酵培养基，以g/L计：葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽饼粉5-20，硫酸铵2-6，柠檬酸钠 2-10，CaCl2 0.2-0.9，玉米浆 15-50，聚醚消泡剂P.P.E. 0.2-0.8，磷酸氢二钾4-10，磷酸二氢钾1-10，以去离子水配制；
发酵温度30-40℃，通风量0.2-1.0 V.V.M，罐压0.2~1.0 kg/cm2，发酵时间40-80小时；
（5）后处理：液态发酵后经过絮凝，加入防腐剂，压滤，滤液用截留分子量为10000的中空纤维管式超滤膜浓缩，收集浓缩液，即得宽温淀粉酶溶液。
液态发酵后加入放罐体积40%左右水，用含12%的NaOH和7%石灰水溶液调pH 9.7~9.9，加入放罐体积8% CaCl2，同时加入12%的NaOH和7%石灰水溶液，使溶液pH保持9.7~9.9，加入 50 ppm 阳离子聚丙烯酰氨，加入1.5% 放罐体积量的糊精，加热到60℃，30min，板框过滤。滤液用截留分子量为10000的中空纤维管式超滤膜浓缩至产品要求活力单位。
本发明的有益效果：通过对原有地衣芽孢杆菌系统的的复合诱变，保藏、复壮，及选育方法，经过培养基配方优化及发酵工艺条件优化，建立了生产宽温淀粉酶的方法，生产出的淀粉酶具有较宽范围的作用温度和很高的耐热性。
附图说明
图1产品宽温淀粉酶的反应温度与反应效率的关系曲线。
具体实施方式
实施例1：
斜面配方（以g/L计算）
牛肉汁4、蛋白胨 10、酵母粉(酵母膏) 3、NaCl 3、淀粉10、葡萄糖50、琼脂 15-25，培养温度35℃，培养时间：30h。
摇瓶配方（以g/L计算）
豆饼粉40、棉籽饼粉30、(NH4)2SO4 5、CaCl2 0.5、玉米浆30、乳糖150、柠檬酸钠5、磷酸氢二钾15、磷酸二氢钾7、培养温度40℃、培养时间30h。
种子罐配方（以g/L计算）
葡萄糖75、酵母粉30、棉籽饼粉15、硫酸铵5、柠檬酸钠8、CaCl2 0.5、P.P.E.（聚醚消泡剂）0.5、磷酸氢二钾7、磷酸二氢钾7，发酵温度35℃，通风量0.8 V.V.M，罐压0.8 kg/cm2，时间36小时，种子罐体积：500L，60％装料量。
生产罐配方（以g/L计算）
葡萄糖75、酵母粉30、棉籽饼粉15、硫酸铵4、柠檬酸钠8、CaCl2 0.7、玉米浆 40、P.P.E.（聚醚消泡剂）0.6、磷酸氢二钾6、磷酸二氢钾8，发酵温度：35℃，通风量：0.8V.V.M，罐压：0.8kg/cm2 ，时间：60小时，使用5吨发酵罐进行发酵，60％装料量。
液态发酵后加入放罐体积40.5％水，用含12%的NaOH和7%石灰水溶液调pH 9.85，加入放罐体积8% CaCl2，同时加入12%的NaOH和7%石灰水溶液，使溶液pH保持pH 9.70，加入 50ppm 阳离子聚丙烯酰氨，加入1.5% 放罐体积量的糊精，加热到60℃，30min，板框过滤。滤液用截留分子量为10000的中空纤维管式超滤膜浓缩3.5倍，经测定，酶活为19553 μ/mL，依据：QB/T 2306-97耐高温α-淀粉酶制剂的测定方法。
实施例2
实施例1制得的宽温淀粉酶，其反应温度与反应效率的关系如图1曲线所示。显示该淀粉酶的作用温度范围可为30～100℃。
Claims (1)
1.一种宽温淀粉酶的生产方法，其特征在于，采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）BL-mut08为出发菌株，地衣芽孢杆菌BL-mut08即CCTCC NO.M207193，经过种子培养和二级液体发酵培养，后处理以后得到宽温淀粉酶，后处理过程为：板框过滤，滤液用截留分子量为10000的中空纤维管式超滤膜浓缩至产品要求活力单位；
（1）斜面培养
斜面培养基，以g/L计：牛肉汁3-6，蛋白胨 5-15，酵母粉或酵母膏1-5，NaCl 1-5，淀粉 5-15，葡萄糖20-80，琼脂 15-25，以去离子水配制；
培养温度 30-40℃，培养时间20-40h；
（2）摇瓶培养
摇瓶培养基，以g/L计：豆饼粉 20-50，棉籽饼粉20-50，(NH4)2SO4 1-10，CaCl2 0.2-1.0，玉米浆 15-40，乳糖100-200，柠檬酸钠 1-10，磷酸氢二钾10-20，磷酸二氢钾5-10，以去离子水配制；
培养温度30-42℃，培养时间 20-40h；
（3）种子罐培养
种子罐培养基，以g/L计：葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽饼粉5-20，硫酸铵2-6，柠檬酸钠 2-10，CaCl2 0.2-0.9，聚醚消泡剂P.P.E. 0.2-0.8，磷酸氢二钾4-10，磷酸二氢钾1-10，以去离子水配制；
发酵温度30-40℃，通风量0.2-1.0 V.V.M，罐压0.2~1.0 kg/cm2，培养时间：20-40小时；
（4）生产罐发酵
发酵培养基，以g/L计：葡萄糖50-100，酵母粉10-50，棉籽饼粉5-20，硫酸铵2-6，柠檬酸钠2-10，CaCl2 0.2-0.9，玉米浆 15-50，聚醚消泡剂P.P.E. 0.2-0.8，磷酸氢二钾4-10，磷酸二氢钾1-10，以去离子水配制；
发酵温度30℃-40℃，通风量0.2-1.0 V.V.M，罐压0.2~1.0 kg/cm2，发酵时间40-80小时；
（5）后处理：液态发酵后经过絮凝，加入防腐剂，压滤，滤液用截留分子量为10000的中空纤维管式超滤膜浓缩，收集浓缩液，即得宽温淀粉酶溶液。
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