CN102604977B

CN102604977B - 一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法

Info

Publication number: CN102604977B
Application number: CN 201110379664
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 张成杰; 马延和
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2031-11-22
Also published as: CN102604977A

Abstract

本发明提出并公开了一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法，它是使用DNAworks软件，将pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登录号：AL009126)进行优化，屏蔽了限制性酶切位点SalI、PmeI，在其引物3’端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物5’端引入了NotI限制性酶切位点。经PCR扩增，连接转化，测序验证，得到碱性果胶酶pel168s的优化基因序列。用该序列构建重组质粒pel168s-9k，并转入毕赤酵母GS115中，得阳性重组菌株GS115/pel168s-9k。发酵培养阳性重组菌株，可制备得到所述耐热碱性果胶酶蛋白质。使用本发明碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列利用毕赤酵母生产碱性果胶酶，目的蛋白表达量高，纯化过程简单，极大的降低了碱性果胶酶的生产成本，增加了企业对其的利用率。

Description

一种碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列及其高效表达方法。

背景技术

碱性高温果胶酶在生物脱胶中有着无与伦比的作用。随着社会的发展，国家对企业要求越来越高，节能减排成为企业的热门话题。苎麻生物脱胶和织物的生物煮练是一种绿色环保的脱胶方法，相比化学脱胶法，生物脱胶具有提高精干麻质量，不损伤纤维，无污染等优点。生物脱胶技术成为国内外苎麻研究者的研究热点，也是未来苎麻脱胶的主要发展方向。

但是，在苎麻脱胶过程中所需要的高温碱性果胶酶，一般来源于芽孢杆菌和大肠杆菌，它们在原核细胞中可以大量表达，可若想得到大量较纯净的果胶酶，就必须进行一系列复杂的纯化过程。为了便于纯化，人们开始采用以毕赤酵母为表达菌株，毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上毕赤酵母最小生长培养基中只有少量的蛋白，这意味着分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要成份，然而由于来源基因密码子偏好的问题，使碱性果胶酶的产量偏低。

因此，如何运用全基因重组合成法寻找新的碱性果胶酶基因序列，使其序列的5’端为EcoR I酶切位点、3’端为Not I酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点；选择合适的表达载体，使表达的蛋白更易于纯化且具有更高的活性，极大的降低碱性果胶酶的生产成本，增加企业对其的利用率成为了我们的研究主题。

发明内容

本发明的目的是：

1、本发明提供并公开了一种序列的5’端为EcoRI酶切位点、3’端为NotI酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点编码碱性果胶酶pel168s的优化基因序列及其基因制备优化方法

2、本发明还提出了上述pel168s核苷酸优化序列的高表达方法。

本发明目的之一的步骤为：

(1)采用常规的PCR重叠引物延伸法。将pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登录号：AL009126)输入DNAworks软件，在密码子频率表中(Codon Frequency Table)选择P.pastoris，并在屏蔽限制性酶切位点选项中选择SalI、PmeI等酶切位点，得到相关的pel168 在毕赤酵母中表达的一系列优化基因序列及引物序列。

(2)为了便于表达质粒的构建，在引物1的前端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物42的5’端引入了NotI限制性酶切位点。

(3)以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物1、引物42浓度为80nmol/L，依次递减，但中间引物21、引物22浓度最低为0.625nmol/L。具体反应条件是94℃预变性5min，然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 90s，30个循环，再72℃延伸10min。

(4)PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化，和T载体连接转化，挑选转化子经过测序验证后得到和设计结果一致的pel168s优化序列。

(5)优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，序列中的15％-25％的碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，为了避免DNA序列中形成的二级结构对表达的影响，pel168s基因序列除去了编码产物自身的21个氨基酸的信号肽序列。其中优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，效果最好的是序列中的294个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换。

本发明目的之二的步骤为：

(1)用本发明目的1中的PCR合成的基因序列经过限制性内切酶EcoRI和NotI处理后，与同样经过EcoRI和NotI处理的表达载体pPIC9K连接，构建重组质粒pel168s-9k。

(2)重组质粒pel168s-9k经SalI线性化后转入毕赤酵母GS115中，得到阳性重组菌株GS115/pel168s-9k。

所述的表达载体是商用载体pPIC9k。也可用其他的毕赤酵母表达载体(如pPIC3.5k、pPICZα等)构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

(3)发酵培养阳性重组菌株GS115/pel168s-9k，制备得到所述耐热碱性果胶酶蛋白质。

(4)同上的方法构建未优化序列的重组质粒pel168-9k，SalI线性化后转入毕赤酵母GS115中，筛选到阳性重组菌株GS115/pel168-9k，并在相同的条件下进行诱导表达。

(5)步骤(3)和步骤(4)表达上清液中碱性果胶酶活性的比较。

本发明采用了以毕赤酵母GS115为表达菌株，运用全基因合成法合成新的基因(pel168s)。并根据毕赤酵母密码子的偏爱性，利用DNAworks软件优化从GenBank中检索到的pel168基因序列，全部选用偏好性大于10％的密码子，设计合成了优化的pel168s基因。为了便于蛋白的表达，在合成的序列两端分别引入了EcoRI和NotI的酶切位点，且优化的pel168s序列中不含有SalI、PmeI等限制性酶切位点。同时为了便于蛋白分泌表达，在表达载体的选择上，采用了含有酿酒酵母α因子信号肽序列的pPIC9k表达载体，引导蛋白进行胞外分泌表达，上清液中目的蛋白的含量达到95％以上。使表达的蛋白更易于纯化且具有更高的活性。极大的降低了碱性果胶酶的生产成本，增加了企业对其的利用率。

附图说明

图1为合成pel168s基因产物的0.7％琼脂糖凝胶电泳检测图片。

图2为优化前pel168基因和优化后pel168s基因所产酶活性比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施一、pel168s优化基因序列的合成

(1)采用实验室常规的PCR重叠引物延伸法。将pel168基因序列(Bacillus subtilis 168，GenBank登录号：AL009126)输入DNAworks软件，在密码子频率表中(Codon Frequency Table)选择P.pastoris，并在屏蔽限制性酶切位点选项中选择SalI、PmeI等酶切位点，得到相关的pel168s在毕赤酵母中表达的一系列优化基因序列，其中效果最好的是序列中的294个碱基被优化，且序列中除去了21个氨基酸的信号肽的pel168s优化基因序列(如表1所示)及引物序列(如下表2所示)。

pel168s优化基因序列表1

(其中竖线表示上下对应的碱基相同，空格表示对应的碱基不同)

引物序列表表2

引物名称	引物序列
		1	GAATTCGCCGACTTGGGACATCAGACACTTGGTTCTAATGACGGTTG 47
2	CCTCCTGTAGTACCTGTGGAATAGGCTCCCCAACCGTCATTAGAACCAAG 50
		3	CACAGGTACTACAGGAGGTTCAAAAGCATCTTCATCTAACGTTTACACTG 50
4	GCAGAAACCAACTGATTTCTGTTAGAAACAGTGTAAACGTTAGATGAAGA 50
		5	AGAAATCAGTTGGTTTCTGCTTTGGGTAAAGAAACTAACACTACTCCAAA 50
6	ATCGATAGTTCCCTTGATGTAGATGATCTTTGGAGTAGTGTTAGTTTCTT 50
		7	TACATCAAGGGAACTATCGATATGAACGTTGATGACAATTTGAAGCCATT 50
8	ATTCAGGGTCTTTGTAATCATTCAAACCCAATGGCTTCAAATTGTCATCA 50
		9	AATGATTACAAAGACCCTGAATATGATTTGGACAAGTACTTGAAAGCTTA 50
10	GCTCCTTTTTACCCCAAGTAGATGGATCATAAGCTTTCAAGTACTTGTCC 50
		11	ACTTGGGGTAAAAAGGAGCCTTCTGGAACTCAAGAAGAGGCTAGAGCTAG 50
12	ATAACTCTAGCCTTTTGATTCTTTTGGGATCTAGCTCTAGCCTCTTCTTG 50
		13	AAGAATCAAAAGGCTAGAGTTATGGTTGATATCCCTGCTAACACTACTAT 50
14	CAACCTTAGCATTAGTTCCAGAACCAACAATAGTAGTGTTAGCAGGGATA 50
		15	CTGGAACTAATGCTAAGGTTGTTGGTGGAAACTTCCAAATTAAATCTGAC 50
16	AAACTCAATATTTCTGATGATAACGTTGTCAGATTTAATTTGGAAGTTTC 50
		17	GTTATCATCAGAAATATTGAGTTTCAAGATGCTTACGACTATTTCCCACA 50
18	TTTCCAGAAGAACCGTCAGTTGGGTCCCATTGTGGGAAATAGTCGTAAGC 50
		19	CTGACGGTTCTTCTGGAAACTGGAACTCTCAATACGATAACATCACTATT 50
20	TCAATCCAAATATGAGTTCCACCATTAATAGTGATGTTATCGTATTGAGA 50
		21	GTGGAACTCATATTTGGATTGACCACTGTACTTTTAATGATGGTTCTAGA 50
22	TAGTACTTAGGAGAAGTAGAGTCTGGTCTAGAACCATCATTAAAAGTACA 50

23	GACTCTACTTCTCCTAAGTACTATGGAAGAAAATACCAACATCACGATGG 50
		24	AGTTAGCTCCGTTAGAAGCGTCAGTTTGACCATCGTGATGTTGGTATTTT 50
25	GCTTCTAACGGAGCTAACTACATCACTATGTCTTACAACTACTATCATGA 50
		26	ACCGAAAATAGAAGACTTGTCGTGATCATGATAGTAGTTGTAAGACATAG 50
27	GACAAGTCTTCTATTTTCGGTTCTTCTGATTCTAAAACTTCTGATGACGG 50
		28	TGTTGTGATGCAAAGTAATTTTCAACTTTCCGTCATCAGAAGTTTTAGAA 50
29	AAAATTACTTTGCATCACAACAGATACAAGAACATCGTTCAAAGAGCTCC 50
		30	GTAAACATGAACTTGACCGAATCTAACTCTTGGAGCTCTTTGAACGATGT 50
31	TTCGGTCAAGTTCATGTTTACAACAACTACTATGAAGGTTCTACTTCTTC 50
		32	CAAGCATAAGAGAATGGGTAAGAAGAAGAAGAAGTAGAACCTTCATAGTA 50
33	TTACCCATTCTCTTATGCTTGGGGTATTGGAAAGTCTTCTAAAATCTACG 50
		34	CAGGAACATCGATAACGTTGTTTTGAGCGTAGATTTTAGAAGACTTTCCA 50
35	CAACGTTATCGATGTTCCTGGTTTGTCTGCTGCTAAAACTATTTCTGTTT 50
		36	GAGTCATACAAAGCAGTTCCACCAGAGAAAACAGAAATAGTTTTAGCAGC 50
37	GGAACTGCTTTGTATGACTCTGGTACTTTGTTGAACGGAACTCAAATTAA 5
		38	AGAAGACAAACCGTTAGCAGCAGAAGCATTAATTTGAGTTCCGTTCAACA 50
39	TGCTAACGGTTTGTCTTCTTCTGTTGGATGGACTCCTTCTTTGCACGGTT 50
		40	ATTTGATTTGACATTGGCGGATGCATCAATAGAACCGTGCAAAGAAGGAG 50
41	CCGCCAATGTCAAATCAAATGTCATCAACCAAGCAGGAGCAGGTAAACTT 50
		42	GCGGCCGCTTAGTTAAGTTTACCTGCTCCTGC 32

(2)为了便于表达载体的构建，在引物1的前端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物42的5’端引入了NotI限制性酶切位点(如表2所示灰色标识)。

(3)以上述引物序列互为模板，采用从两端引物向中间引物浓度递减的方法进行全长的扩增，即引物1、引物42浓度为40nmol/L，再从两端引物向中间引物浓度依次递减，但中间引物21、引物22浓度最低为0.625nmol/L。具体反应条件是94℃预变性5min，然后94℃30s，58℃30s，72℃90s，30个循环，再72℃延伸10min。

(4)PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化，PCR产物和T载体连接转化，挑选转化子测序后得到和设计结果一致的pel168s核苷酸优化序列。

实施二、优化的果胶酶pel168s基因的高效表达

1、表达载体pel168s-9k的构建

(1)将实施一中测序正确的含有pel168s的质粒用NotI和EcoRI限制性内切酶处理，得到NotI和EcoRI的粘性末端，琼脂糖电泳回收处理产物。

(2)将表达载体pPIC9k也用NotI和EcoRI双酶切处理，琼脂糖电泳回收酶切产物。将处理好的pel168s基因片段与载体pPIC9K用DNA连接酶SoulutionI(Takara公司)连接4小时。

连接体系(4μl)：1.5μl(1.5μg)NotI和EcoRI双酶切的pel168s DNA片段；

0.5μl(0.5μg)NotI和EcoRI处理的pPIC9k DNA片段；

2μl Soulution I连接酶。

(3)连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，之后涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，用PCR法筛选阳性转化子并进行测序验证，将测序正确的重组质粒命名为pel168s-9k。

(4)按上述同样的方法构建重组质粒pel168-9k。

2、工程菌的制备

(1)将重组质粒pel168s-9k经SalI线性化后电击转入毕赤酵母菌GS115，涂布于MD(His 缺陷型培养基)平板上，28℃，48h培养，得到含有pel168s-9k基因的转化子，将转化子点种在含有果胶的底物平板上，挑选水解圈最小的菌株，将这种阳性重组菌记作GS115/pel168s-9k。

(2)用pel168-9k代替pel168s-9k，转化毕赤酵母菌GS115，步骤同上，得到含有pel168-9k转化子，将转化子点种在含有果胶的底物平板上，挑选水解圈最小的菌株，作为对照菌。将这种含有pel168-9k基因的阳性重组菌记作GS115/pel168-9k。

3、发酵培养重组菌株制备碱性果胶酶

将步骤2中制备的阳性重组菌株GS115/pel168s-9k和GS115/pel168-9k分别培养于25ml的BMGY培养基中，28℃，摇床200rpm，培养48h；当OD600＝15时，将培养好的菌液5000rpm离心5分钟，去掉上清，转至BMMY培养基中，25℃200rpm继续培养84h，期间每隔12h补加甲醇至终浓度1％进行诱导。

BMGY培养基为1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％ YNB，1％(NH₄)₂SO₄ 100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0，1％甘油。

BMMY培养基为1％酵母粉，2％蛋白胨，0.34％ YNB，1％(NH₄)₂SO₄，100mmol/L磷酸钾缓冲液pH6.0。

温度4℃，5000rpm、10min离心收集上清，并进行SDS-PAGE电泳检测和酶活力的比较，用重组菌株GS115/pel168s-9k培养的上清液中含有大量的活性碱性果胶酶。

4、酶活力的测定

反应体系中包括粗酶稀释液取20μl，加入含0.2％聚半乳糖醛酸缓冲液2ml的起动酶促反应；反应条件为50℃反应15min，用3ml 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。空白对照为无活性的酶液反应(即：先加3ml磷酸与待测酶液混匀，再加入底物反应15min)。

酶活计算：

式中：4600(L·mol^-1cm^-1)-不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数

t(min)-酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)

b(cm)-比色杯厚度

简化得：酶活(U/ml)＝3.6232*稀释倍数*OD₂₃₅

结果：

一、全基因引物合成结果

如(表2)所示，1-42为所设计的引物，其中引物1的前端添加了EcoR I(灰色标识)限制性酶切位点，引物42的5’端引入了Not I限制性酶切位点(灰色标识)，每对相邻的引物之间有15个bp左右的互补序列。

二、优化前的pel168基因序列与优化后的pel168s基因序列对比

优化后的序列与原始序列相比，共有15％-25％的碱基被优化，序列中所有的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，如(表1)所示。

三、合成序列PCR结果

除去信号肽优化后的pel168s序列大小为1214bp，其中的16bp为基因两端所添加的EcoRI和NotI酶切位点。PCR产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，在900-1400之间的位置出现一特异性的条带，与理论值大小相符。(图1)

四、酶活力的比较

由(图2)所示，优化后GS115/pel168s-9k所产碱性果胶酶活性比优化前GS115/pel168-9k所产碱性果胶酶活性提高了52.1％。

Claims

1.一种如序列1所列的碱性果胶酶pel168s核苷酸优化序列，其特征在于优化后的pel168s序列与原始序列pel168相比，序列中294个碱基被优化且其中的毕赤酵母低频密码子均被高频或次高频密码子所替换，序列中除去了21个氨基酸的信号肽，序列的5′端添加了EcoRI酶切位点、3′端引入了NotI酶切位点，整个序列不含有SalI、PmeI限制性酶切位点。