CN102603371B - 一种微生物肥料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物肥料，所述微生物肥料为氢氧化细菌含量为1×108个/mL～1×1010个/mL的发酵液，或者为氢氧化细菌菌液与无菌草炭的混合物；所述混合物中氢氧化细菌的含量为2×108个/g～2×1010个/g，所述混合物的含水量为20wt％～40wt％；所述氢氧化细菌为黄杆菌(Flavobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、产碱杆菌(Alcaligenes)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)中的一种或几种。本发明还提供了该微生物肥料的制备方法。本发明的微生物肥料对植物有较好的应用效果，对环境无污染，用量少，易于推广，其制备工艺简单，生产周期短，成本低。
Description
技术领域
本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种微生物肥料及其制备方法。
背景技术
微生物肥料因其能改善土壤，提高土壤肥力，提高植物矿质元素的吸收利用，增强作物的抗病、抗旱能力，提高产量、改善品质等作用，在发展绿色农业、生态农业，生产安全无公害农产品方面表现出不可替代的作用。特别是植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)通过一种或多种促生机制直接或间接的促进植物生长。
目前，微生物肥料较多集中在根瘤菌肥、固氮菌肥、解磷菌类肥料、解钾菌类肥料，使用量每亩2公斤左右。但对其他PGPR研究开发还不够。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种以氢氧化细菌制备的微生物肥料。该微生物肥料对植物有较好的应用效果，对环境无污染，用量少，易于推广，是一种高质量的微生物肥料。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料为氢氧化细菌含量为1×108个/mL～1×1010个/mL的发酵液，或者为氢氧化细菌菌液与无菌草炭的混合物；所述混合物中氢氧化细菌的含量为2×108个/g～2×1010个/g，所述混合物的含水量为20wt％～40wt％；所述氢氧化细菌为黄杆菌(Flavobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、产碱杆菌(Alcaligenes)和伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)中的一种或几种。
上述的一种微生物肥料，所述黄杆菌为约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)；所述假单胞菌为假单胞菌(Pseudom onassp)和/或波纹假单胞菌(P.corrugata)；所述产碱杆菌为争论产碱菌(Variovoraxparadoxus)；所述伯克霍尔德氏菌为洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)。
本发明还提供了上述微生物肥料的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、将氢氧化细菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；
步骤三、将步骤二中所述二级菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到氢氧化细菌发酵液；
步骤四、采用无菌液体培养基将步骤三中所述氢氧化细菌发酵液稀释至氢氧化细菌含量为1×108个/mL～1×1010个/mL的发酵液后作为微生物肥料；或者将步骤三中所述氢氧化细菌发酵液离心后收集菌体，然后将收集的菌体重悬于质量浓度为0.2％～0.7％的无菌氯化钠溶液中得到氢氧化细菌菌液，最后将氢氧化细菌菌液与无菌草炭混合后搅拌均匀，得到微生物肥料。
上述的方法，步骤一中所述固体培养基为MSA固体培养基，其组成为：NaNO3 2.0g、K2HPO4 1.2g、MgSO4 0.5g、KCl 0.5g、KH2PO4 0.14g、Fe2(SO4)3·H2O 0.01g、酵母粉0.02g，琼脂15g～20g，蒸馏水定容至1L。
上述的方法，步骤二中所述液体培养基和步骤三中所述发酵培养基均为MSA液体培养基或LB液体培养基，其中MSA液体培养基的组成为：NaNO3 2.0g、K2HPO4 1.2g、MgSO4 0.5g、KCl 0.5g、KH2PO4 0.14g、Fe2(SO4)3·H2O 0.01g、酵母粉0.02g，蒸馏水定容至1L。
上述的方法，步骤一中所述培养的温度为28℃～35℃，培养时间为36h～72h。
上述的方法，步骤二中所述培养的温度为28℃～35℃，培养时间为36h～72h。
上述的方法，步骤三中所述发酵培养时的接种量为1％～5％，培养温度为28℃～35℃，培养时间为36h～72h。
本发明的微生物肥料的使用方法为：①以氢氧化细菌发酵液作为微生物肥料时，将作物、蔬菜种子置于发酵液中浸种2h～5h；②以氢氧化细菌菌液与草炭的混合物作为微生物肥料时，将微生物肥料掺入种子中拌种，拌种量为每公斤种子掺入5g～8g微生物肥料；或将微生物肥料混入土壤中进行施肥，每亩0.8公斤～1公斤。
本发明采用氢氧化细菌(Hydrogen-oxidizing bacteria)制备微生物肥料，氢氧化细菌是一类能够利用H2作为电子供体、O2作为电子受体，并同化CO2的无机化能自养细菌。氢氧化细菌之所以能够利用H2，是由于其含有氢化酶，或者在一定的条件下能够表达或激活氢化酶，从而在有H2提供的条件下能够利用H2，迅速大量繁殖群体数量。氢氧化细菌能够诱导1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclpropane-1-carboxylic acid，ACC)脱氨酶产生，分解ACC，降低植物体内乙烯水平，通过解除乙烯对植物生长的抑制，从而促进植物生长。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明以氢氧化细菌制备微生物肥料，工艺简单，生产周期短，成本低。
2、本发明的微生物肥料来源于土壤，不仅对植物有较好的应用效果，而且对环境无污染，施用方法简便，用量少，易于推广，是一种高质量的微生物肥料。
3、本发明的微生物肥料可增加冬小麦主根长度、提高根系活力和根冠比，使穗长加长，千粒重增加；对菠菜和黄瓜的农艺性状和产量均有影响，可提高植物根冠比，提高产量，并显著提高菠菜VC含量，降低硝酸盐含量，改善了菠菜品质。
4、本发明的微生物肥料在促进植物生长的同时，还能分泌其他化合物提高植物抗病能力。
下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
以下实施例所用MSA固体培养基的组成为：NaNO3 2.0g、K2HPO41.2g、MgSO4 0.5g、KCl 0.5g、KH2PO4 0.14g、Fe2(SO4)3·H2O 0.01g、酵母粉0.02g，琼脂15g～20g，蒸馏水定容至1L，培养基pH值为7.2。
所用MSA液体培养基的组成为：NaNO3 2.0g、K2HPO4 1.2g、MgSO40.5g、KCl 0.5g、KH2PO4 0.14g、Fe2(SO4)3·H2O 0.01g、酵母粉0.02g，蒸馏水定容至1L，培养基pH值为7.2。
所用LB液体培养基的组成为：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，培养基pH值为7.0～7.2。
实施例1
本实施例的微生物肥料，所述微生物肥料为氢氧化细菌含量为1×109个/mL的发酵液；所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌。
本实施例的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将约氏黄杆菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；所述固体培养基为MSA固体培养基，培养温度为30℃，培养时间为36h；
步骤二、将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；所述液体培养基为MSA液体培养基，培养温度为30℃，培养时间为72h；
步骤三、将步骤二中所述二级菌种以5％的接种量接种于2.5L发酵培养基中进行发酵培养，得到约氏黄杆菌发酵液；所述发酵培养基为MSA液体培养基，培养温度为30℃，培养时间为72h；
步骤四、采用无菌MSA液体培养基将步骤三中所述约氏黄杆菌发酵液稀释至约氏黄杆菌含量为1×109个/mL的发酵液后作为微生物肥料。
实施例2
本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于：所述氢氧化细菌为假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌或洋葱伯克氏菌，或者为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的至少两种。
实施例3
本实施例的微生物肥料，所述微生物肥料为氢氧化细菌含量为1×108个/mL的发酵液；所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌和波纹假单胞菌。
本实施例的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一、分别将约氏黄杆菌和波纹假单胞菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；所述固体培养基为MSA固体培养基；
步骤二、分别将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；所述液体培养基为LB液体培养基；
步骤三、分别将步骤二中所述二级菌种接种于2.5L发酵培养基中进行发酵培养，得到约氏黄杆菌发酵液和波纹假单胞菌发酵液；所述发酵培养基为LB液体培养基；
步骤四、将步骤三中所述约氏黄杆菌发酵液和波纹假单胞菌发酵液按照1∶1的体积比混合，用无菌LB液体培养基将混合发酵液稀释至细菌含量为1×108个/mL的发酵液后作为微生物肥料。
本实施例各阶段培养条件见表1。
表1本实施例中细菌的各阶段培养条件
实施例4
本实施例与实施例3相同，其中不同之处在于：所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的一种或三种以上，或者为假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的两种，或者为假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的一种与约氏黄杆菌。
实施例5
本实施例的微生物肥料，所述微生物肥料为氢氧化细菌含量为1×1010个/mL的发酵液；所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌。
本实施例的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一、分别将约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；所述固体培养基为MSA固体培养基；
步骤二、分别将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；所述液体培养基为MSA液体培养基；
步骤三、分别将步骤二中所述二级菌种接种于2.5L发酵培养基中进行发酵培养，得到约氏黄杆菌发酵液、假单胞菌发酵液、波纹假单胞菌发酵液、争论产碱菌发酵液和洋葱伯克氏菌发酵液；所述发酵培养基为MSA液体培养基；
步骤四、将步骤三中所述约氏黄杆菌发酵液、假单胞菌发酵液、波纹假单胞菌发酵液、争论产碱菌发酵液和洋葱伯克氏菌发酵液按2∶1.5∶1∶0.5∶1的体积比混合，用无菌MSA液体培养基将混合发酵液稀释至细菌含量为1×1010个/mL的发酵液后作为微生物肥料。
本实施例各阶段培养条件见表2。
表2本实施例中细菌的各阶段培养条件
实施例6
本实施例与实施例5相同，其中不同之处在于：所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的至多四种。
实施例7
本实施例的微生物肥料，所述微生物肥料为氢氧化细菌菌液与无菌草炭的混合物；所述混合物中氢氧化细菌的含量为2×108个/g，所述混合物的含水量为30wt％；所述氢氧化细菌为洋葱伯克氏菌。
本实施例的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一、将洋葱伯克氏菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；所述固体培养基为MSA固体培养基，培养温度为30℃，培养时间为48h；
步骤二、将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；所述液体培养基为MSA液体培养基，培养温度为30℃，培养时间为48h；
步骤三、将步骤二中所述二级菌种以5％的接种量接种于2.5L发酵培养基中进行发酵培养，得到洋葱伯克氏菌发酵液；所述发酵培养基为MSA液体培养基，培养温度为30℃，培养时间为72h；
步骤四、将步骤三中所述洋葱伯克氏菌发酵液离心后收集菌体，然后将收集的菌体重悬于质量浓度为0.7％的无菌氯化钠溶液中得到氢氧化细菌菌液，最后将氢氧化细菌菌液与无菌草炭混合后搅拌均匀，得到微生物肥料。
实施例8
本实施例与实施例7相同，其中不同之处在于：所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌或争论产碱菌，或者为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的至少两种。
实施例9
本实施例的微生物肥料，所述微生物肥料为为氢氧化细菌菌液与无菌草炭的混合物；所述混合物中氢氧化细菌的含量为2×1010个/g，所述混合物的含水量为40wt％；所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌和波纹假单胞菌。
本实施例的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一、分别将约氏黄杆菌、假单胞菌和波纹假单胞菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；所述固体培养基为MSA固体培养基；
步骤二、分别将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；所述液体培养基为LB液体培养基；
步骤三、分别将步骤二中所述二级菌种接种于2.5L发酵培养基中进行发酵培养，得到约氏黄杆菌发酵液、假单胞菌发酵液和波纹假单胞菌发酵液；所述发酵培养基为LB液体培养基；
步骤四、将步骤三中所述约氏黄杆菌发酵液、假单胞菌发酵液和波纹假单胞菌发酵液按1∶1∶1的体积比混合后离心收集菌体，然后将收集的菌体重悬于质量浓度为0.2％的无菌氯化钠溶液中得到氢氧化细菌菌液，最后将氢氧化细菌菌液与无菌草炭混合后搅拌均匀，得到微生物肥料。
本实施例各阶段培养条件见表3。
表3本实施例中细菌的各阶段培养条件
实施例10
本实施例与实施例9相同，其中不同之处在于：所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的一种、两种、四种或五种，或者为假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的三种，或者为约氏黄杆菌、假单胞菌和争论产碱菌，或者为约氏黄杆菌、假单胞菌和洋葱伯克氏菌，或者为约氏黄杆菌、波纹假单胞菌和争论产碱菌，或者为约氏黄杆菌、波纹假单胞菌和洋葱伯克氏菌，或者为约氏黄杆菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌。
实施例11
本实施例的微生物肥料，所述微生物肥料为氢氧化细菌菌液与无菌草炭的混合物；所述混合物中氢氧化细菌的含量为2×109个/g，所述混合物的含水量为20wt％；所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌。
本实施例的微生物肥料的制备方法包括以下步骤：
步骤一、分别将约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；所述固体培养基为MSA固体培养基；
步骤二、分别将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；所述液体培养基为MSA液体培养基；
步骤三、分别将步骤二中所述二级菌种接种于2.5L发酵培养基中进行发酵培养，得到约氏黄杆菌发酵液、假单胞菌发酵液、波纹假单胞菌发酵液、争论产碱菌发酵液和洋葱伯克氏菌发酵液；所述发酵培养基为MSA液体培养基；
步骤四、将步骤三中所述约氏黄杆菌发酵液、假单胞菌发酵液、波纹假单胞菌发酵液、争论产碱菌发酵液和洋葱伯克氏菌发酵液按照1∶2∶1∶3∶1.5的体积比混合后离心，收集菌体，然后将收集的菌体重悬于质量浓度为0.5％的无菌氯化钠溶液中得到氢氧化细菌菌液，最后将氢氧化细菌菌液与无菌草炭混合后搅拌均匀，得到微生物肥料。
本实施例各阶段培养条件见表4。
表4本实施例中细菌的各阶段培养条件
实施例12
本实施例与实施例11相同，其中不同之处在于：所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌、假单胞菌、波纹假单胞菌、争论产碱菌和洋葱伯克氏菌中的至多四种。
对本发明微生物肥料的应用效果进行了研究。
一、本发明微生物肥料在菠菜种植上的应用效果
将菠菜示范田分为两组：对照组和试验组。对照组采用常规方法种植菠菜；试验组在播种前采用本发明实施例9制备的微生物肥料-含氢氧化细菌的草炭拌种菠菜种子，拌种量为每公斤种子掺入5g～8g微生物肥料，其他种植条件均与对照组相同。播种45天后测定对照组菠菜和试验组菠菜的各项指标，结果见表5。
表5本发明微生物肥料在菠菜种植上的应用效果
| 组别 | 单株重(g) | 维生素C含量(mg/100g) | 硝酸盐含量(mg/kg) |
| 试验组 | 140 | 75.3 | 724 |
| 对照组 | 123 | 67.5 | 1037.9 |
从表5可以看出，采用本发明微生物肥料拌种菠菜种子，不仅提高了菠菜的产量，同时改善了菠菜的品质，使菠菜中维生素C含量明显提高，并显著降低了菠菜中硝酸盐的含量。
二、本发明微生物肥料在黄瓜种植上的应用效果
将黄瓜示范田分为两组：对照组和试验组。在黄瓜定植时，对照组采用常规方法，试验组采用本发明实施例11制备的微生物肥料-含氢氧化细菌的草炭施肥，施肥量为每平方米0.5g微生物肥料。定植45天后测定对照组黄瓜和试验组黄瓜的各项指标，结果见表6，其中相对叶绿素含量采用CM1000叶绿素测量仪测量。
表6本发明微生物肥料在黄瓜种植上的应用效果
| 组别 | 株高(cm) | 基部茎粗(cm) | 相对叶绿素含量 | 根冠比 |
| 试验组 | 43.2 | 10.98 | 406.64 | 8.49 |
| 对照组 | 32 | 8.70 | 338.93 | 6.20 |
从表6可以看出，采用本发明微生物肥料施肥，黄瓜的株高比对照组明显增加，基部茎粗也有所增加，黄瓜中相对叶绿素含量明显提高，另外，显著提高了黄瓜的根冠比。
三、本发明微生物肥料在冬小麦种植上的应用效果
将冬小麦示范田分为两组：对照组和试验组。对照组冬小麦采用常规方法于2010年10月15日播种，试验组冬小麦种子播种前用本发明实施例1制备的微生物肥料-氢氧化细菌发酵液浸种后于2010年10月15日播种。播种一周后测定对照组冬小麦和试验组冬小麦主根长度，TTC法测定根系活力，播种两个月后使用CM1000叶绿素测量仪测定对照组冬小麦和试验组冬小麦相对叶绿素含量。第二年4月采用CM1000叶绿素测量仪测定对照组冬小麦和试验组冬小麦上部顶端第二片叶的相对叶绿素含量，收获后测定对照组冬小麦和试验组冬小麦穗长，千粒重。
表7本发明微生物肥料在冬小麦种植上的应用效果
从表7可以看出，采用本发明微生物肥料浸种冬小麦种子，播种一周后主根长度明显高于对照组，根系活力系数是对照组的2.6倍；播种两个月后相对叶绿素含量比对照组有所提高；第二年4月顶端第二片叶的相对叶绿素含量明显高于对照组；收获后穗长和千粒重明显高于对照组。
综上所述，本发明的微生物肥料可增加冬小麦主根长度、提高根系活力和根冠比，麦穗穗长增大，千粒重增加；对菠菜和黄瓜的农艺性状和产量均有影响，提高叶绿素含量，改善植物营养，增大植物根冠比，并可显著改善菠菜品质。对春小麦，油菜，大麦、大豆的温室和田间实验也表明，该微生物肥料一般可使植物茎叶或根的干重增加10％～30％，甚至更高。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
Claims (7)
1.一种微生物肥料，其特征在于，所述微生物肥料为氢氧化细菌含量为1×108个/mL～1×1010个/mL的发酵液，或者为氢氧化细菌菌液与无菌草炭的混合物；所述混合物中氢氧化细菌的含量为2×108个/g～2×1010个/g，所述混合物的含水量为20wt%～40wt%；所述氢氧化细菌为约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）、假单胞菌（Pseudom onassp）、波纹假单胞菌（P.corrugata）或洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia），或者为约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae）、假单胞菌（Pseudom onassp）、波纹假单胞菌（P.corrugata）、争论产碱菌（Variovorax paradoxus）和洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia）中的两种以上。
2.一种制备如权利要求1所述微生物肥料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、将氢氧化细菌接种于固体培养基中进行培养，获得一级菌种；
步骤二、将步骤一中所述一级菌种接种于液体培养基中进行培养，得到二级菌种；
步骤三、将步骤二中所述二级菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到氢氧化细菌发酵液；
步骤四、采用无菌液体培养基将步骤三中所述氢氧化细菌发酵液稀释至氢氧化细菌含量为1×108个/mL～1×1010个/mL的发酵液后作为微生物肥料；或者将步骤三中所述氢氧化细菌发酵液离心后收集菌体，然后将收集的菌体重悬于质量浓度为0.2%～0.7%的无菌氯化钠溶液中得到氢氧化细菌菌液，最后将氢氧化细菌菌液与无菌草炭混合后搅拌均匀，得到微生物肥料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述固体培养基为MSA固体培养基，其组成为：NaNO32.0g、K2HPO41.2g、MgSO40.5g、KCl0.5g、KH2PO40.14g、Fe2(SO4)3·H2O0.01g、酵母粉0.02g，琼脂15g～20g，蒸馏水定容至1L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中所述液体培养基和步骤三中所述发酵培养基均为MSA液体培养基或LB液体培养基，其中MSA液体培养基的组成为：NaNO32.0g、K2HPO41.2g、MgSO40.5g、KCl0.5g、KH2PO40.14g、Fe2(SO4)3·H2O0.01g、酵母粉0.02g，蒸馏水定容至1L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤一中所述培养的温度为28℃～35℃，培养时间为36h～72h。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤二中所述培养的温度为28℃～35℃，培养时间为36h～72h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤三中所述发酵培养时的接种量为1%～5%，培养温度为28℃～35℃，培养时间为36h～72h。
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