CN102600452B - 一种改善肝功能的二肽衍生物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改善肝功能的二肽衍生物及其应用。具体地，本发明提供了一种N-取代的2(1H)二肽衍生物或其药学上可接受的盐，以及含有该化合物的药物组合物。本发明的化合物可有效改善肝功能，其中包括：降低丙氨酸转氨酶(ALT)、降低天冬氨酸转氨酶(AST)和/或降低总胆红素(TBil)。本发明化合物还可显著提高肝衰竭病人的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，更具体地涉及一种N-取代的二肽衍生物或其药学上可接受的盐，含有该化合物的药物组合物，及其应用。本发明的化合物可有效改善肝功能。本发明化合物还可显著提高肝衰竭病人的存活率。
背景技术
肝衰竭是指由多种因素引起的严重肝脏损害，导致肝脏本身合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，临床上出现以凝血酶机制障碍、黄疸、肝性脑病、脱水等表现的一组症候群。肝衰竭的病死率极高。
2006年中国《肝衰竭诊疗指南》将肝衰竭的分为以下四类：
(a)急性肝衰竭，指急性起病，2周内出现II度以上肝性脑病为特征的肝衰竭；
(b)亚急性肝衰竭，指起病较急，15天～26周出现肝衰竭的临床表现的肝衰竭；
(c)慢加急性(亚急性)肝衰竭，指在慢性肝病的基础上，出现急性肝功能失代偿的肝衰竭；
(d)慢性肝衰竭，指在肝硬化的基础上，出现慢性肝功能失代偿的肝衰竭。
肝衰竭的发病机制非常复杂，肝炎病毒、药物、内毒素、和休克等均可引起肝衰竭，并且多种因素会相互作用和影响。
目前一般认为，各类型肝炎病毒是引起肝衰竭发生的致病因素之一。此外，内毒素与肝损伤密切相关，肝脏是体内最大的代谢器官，是清除内毒素和解毒的主要脏器，也是遭受内毒素攻击的首要器官。细胞因子与肝损伤也密切相关，细胞因子既是参与肝衰竭、肝细胞坏死发生过程的主要分子，又是构成抑制肝细胞再生细胞外环境的重要分子。此外，细胞凋亡和多器官功能衰竭等因素也被认为与肝衰竭有关。
目前认为，欧美国家的肝衰竭主要由药物或酒精或HCV感染引起，而我国因HBV感染者甚众，由乙型肝炎引起的肝衰竭占了相当大比例，但是脂肪肝、酒精、及HCV等因素也存在上升趋势。然而，对具体的肝衰竭病例而言，其发病起因可能是上述的一种或多种原因。
目前，对于肝衰竭的治疗方法主要是内科综合治疗，包括(a)基础支持治疗，例如通过大量使用新鲜冰冻血浆，纠正水、电解质紊乱，预防消化道出血等手段进行。(b)促肝细胞再生；(c)抗病毒治疗；(d)免疫调节治疗，例如使用胸腺肽α1；(e)并发症的防治。
然而，上述治疗手段尚不能令人满意，此外，目前国际上仍缺乏令人满意的对肝衰竭有效的药物。因此，临床上肝衰竭的死亡率很高，尤其是急性肝衰竭以及慢加急性肝衰竭的死亡率高达约30％或更高。
此外，对于肝衰竭病人而言，还缺乏改善肝功能的有效手段以及缺乏提高存活率的有效手段。
因此，本领域迫切需要开发有效能够治疗肝衰竭，以及有效改善肝功能和/或提高存活率的新药物。
发明内容
本发明目的就提供有效改善肝功能和/或提高存活率的化合物及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种式I化合物或其药学上可接受的盐的用途，
它被用于制备改善肝功能相关指标或改善肝功能的药物。
在另一优选例中，所述的改善肝功能相关指标或改善肝功能包括：降低丙氨酸转氨酶(ALT)、降低天冬氨酸转氨酶(AST)和/或降低总胆红素(TBil)。
在另一优选例中，所述的药物含有药学上可接受的载体以及占总重量0.01-99％的式I化合物或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述药物的剂型是片剂、胶囊、针剂(注射剂)、丸剂。
在另一优选例中，所述的药物还用于治疗或预防肝衰竭；和/或用于提高肝衰竭病人的生存率。
在另一优选例中，所述的肝衰竭包括：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、和慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭。
在另一优选例中，所述的药物的剂型为注射剂或口服制剂。
在本发明的第二方面，提供了一种改善肝功能相关指标或改善肝功能的方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用安全有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐
在另一优选例中，所述的施用包括：静脉注射、皮下注射、腹腔注射、或肝内注射。
在另一优选例中，所述的改善肝功能相关指标或改善肝功能包括：降低丙氨酸转氨酶(ALT)、降低天冬氨酸转氨酶(AST)和/或降低总胆红素(TBil)的药物。
在本发明的第三方面，提供了上述式I化合物或其药学上可接受的盐的用途，它被用于制备提高肝衰竭病人的生存率的药物。
在另一优选例中，所述的肝衰竭包括：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、和慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭。
在另一优选例中，所述的药物还用于治疗或预防肝衰竭；和/或用于改善肝功能相关指标或改善肝功能。
在本发明的第三方面，提供了一种提高肝衰竭病人的存活率的方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用安全有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐
在另一优选例中，所述的施用包括：静脉注射、皮下注射、腹腔注射、或肝内注射。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在造模后2小时给予化合物F573时，各实验组的光镜下观察结果。
图2显示了在造模后2小时给予化合物F573时，各实验组的TUNEL法半定量检测肝细胞凋亡的照片。
图3显示了在造模同时(0小时)给予化合物F573时，各实验组的光镜下观察结果。
图4显示了在造模同时(0小时)给予化合物F573时，各实验组的TUNEL法半定量检测肝细胞凋亡的照片。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现一类二肽衍生物能够显著改善肝功能相关指标，其中包括：降低丙氨酸转氨酶(ALT)、降低天冬氨酸转氨酶(AST)和/或降低总胆红素(TBil)。此外，该类衍生物还能抑制或逆转肝衰竭，对于肝衰竭有显著的疗效，并且对细胞没有明显的毒性。在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“本发明化合物”、“式I化合物”、“本发明的二肽衍生物”可互换使用，都指具有结构式I的化合物或其药学上可接受的盐，
一种优选的化合物是非盐形式的化合物，即3-(2-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酰胺基)-5-氟-4-氧代-戊酸，该化合物称为F573，分子量为382.38。该化合物可按常规方法合成或购买获得。
本发明化合物具有分子量小(～400)、水溶性高等的特点。动物实验结果显示，F573具有良好的治疗肝衰竭效果，并且在治疗肝衰竭的同时，能明显减轻肝细胞的坏死，促进肝细胞恢复正常功能，尤其适用于慢加急性肝衰竭的治疗。试验证明，该化合物在细胞组织和动物中较为安全，小鼠灌胃急毒实验显示一半致死剂(LD50)量为i.g.3000毫克/公斤体重。
本发明化合物可改善肝功能相关指标，其中包括：降低丙氨酸转氨酶(ALT)、降低天冬氨酸转氨酶(AST)和/或降低总胆红素(TBil)。
此外，本发明化合物还可以用于各种肝衰竭治疗和或预防。代表性的例子包括(但并不限于)：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性(亚急性)肝衰竭和慢加亚急性肝衰竭，尤其适用于慢加急性肝衰竭和慢加亚急性肝衰竭。
此外，本发明化合物可提高存活率。
本发明化合物还包括由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。
本发明还包括药物组合物以及施用方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的式I化合物。
当本发明化合物用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或以外用方式给药：软膏剂、凝胶、含药胶布等，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。
所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.25-1000mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-100mg/kg，较佳地约为2-80mg/kg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约0.25-500mg的活性化合物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
这些活性化合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。化合物的口服给药是优选的。
这些活性化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂(如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮)的水中制备这些活性化合物(作为游离碱或药学上可接受的盐)的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。
适应于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
此外，本发明化合物还可与其他治疗肝病的药物(如干扰素、拉米夫定、阿德福韦等)联用。
本发明的主要优点在于：
(a)可以发现显著地改善肝功能相关指标；
(b)对肝衰竭效果非常显著，可显著降低肝衰竭的死亡率和提高存活率；和
(c)可抑制与肝衰竭的相关的细胞凋亡及组织坏死。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1.材料
1.1药品
化合物F573为白色粉末，批号MC08261-27-2，化学名称为3-(2-苄氧羰基氨基-3-甲基-丁酰胺基)-5-氟-4-氧代-戊酸，由上海睿星基因技术有限公司提供。临用时以超声波超30min后，用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)的生理盐水配制高剂量(H)1mg/ml(5.0mg/kg)、中剂量(M)0.5mg/ml(2.5mg/kg)、低剂量(L)0.25mg/ml(1.25mg/kg)3个浓度的F573。
阳性药N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine：NAC)，购自日本Kyowa有限公司。用生理盐水稀释配制为31mg/ml(155mg/kg)。
造模药(1)D-氨基半乳糖(D-GalN)，购自加拿大BBI公司。以生理盐水配制100mg/ml(500mg/kg)。
造模药(2)内毒素(LPS)，购自美国Sigma公司，以生理盐水配制4μg/ml(20μg/kg)。
1.2试剂盒与试剂
丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)(钒酸盐法)试剂盒为中生北控生物科技股份有限公司产品，批号分别为100321、100291、100351。
流式细胞仪用试剂
碘化丙啶(PI)、RNase A和Triton X-100均为美国Sigma公司产品，批号分别为059k3526、039k13562和57H0650。
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒为德国Roche Applied Science公司产品，批号11684817910。
1.3主要仪器
BECKMAN GS-15R低温离心机；日立7080型全自动生化分析仪；BD FACSCalibur流式细胞仪；OLYMPUS 2BX41显微镜；电子天平Mettler-240。
1.4动物及动物分组
大鼠，Wistar种，SPF级，雄性，体重150～170g，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。大鼠在实验室稳定1天，实验前大鼠禁食16h，自由饮水。将大鼠随机分成，每组10只。
2.通用方法
2.1处死动物
造模后10小时股动脉放血处死大鼠，取血分离血清和部分肝组织待检。
2.2检测指标和方法
2.2.1大鼠体重
给药前及造模10h后，每只称量大鼠体重。
2.2.2肝脏重量和肝脏系数
放血处死大鼠后，剖取整个肝脏称重，并计算肝重与体重的百分比即肝脏系数：肝脏重量(g)/体重(g)×100％＝肝脏系数(％)。
2.2.3血清生化指标
给予造模药10h后，各组动物股动脉取血约1.5ml，血于4℃静置1h以上离心，3000转，离心15min，分离血清100μl，在日立7020型全自动生化分析仪上，按试剂盒说明书测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)含量。
2.2.4病理学检查
取肝右叶，每只同一部位取1.5×1.5×0.5大小肝脏，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片(每只多作一片留作TUNEL用)，常规HE染色，光镜下进行组织病理学观察。用半定量病理指数(PI)评定肝组织病理变化，即每组测定20个高倍视野，计数每个视野中病变肝细胞数之比(由富有经验的病理专家在不知分组的情况下作出评定)，求出每组均数和SD并进行统计学分析。
2.2.5流式细胞仪PI法定量分析大鼠肝细胞凋亡率
取肝左叶0.1-0.2g以70％酒精固定，肝组织块在120目的不锈钢网上轻搓，同时用生理盐水向下冲洗细胞，直至组织搓净，收集细胞悬液，再用300目铜网过滤去除细胞团块，离心收集细胞，制作成单细胞悬液，使每份所含细胞数不少于1×106个。取上述细胞悬液0.2ml，加入碘化丙啶(PI)1ml，在4℃冰箱内染色30min，在BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测，上机后收集2万个细胞，然后用Modifit LT 3.0分析细胞凋亡率及其图谱。
2.2.6TUNEL法半定量分析大鼠肝细胞凋亡指数
即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)，取石蜡包埋、切片的肝脏病理切片常规脱蜡脱水后，按TUNEL试剂盒说明书操作：滴加蛋白酶K(20μg/ml溶于PBS中)，室温孵育30分钟，PBS冲洗两次，滴加50μl的TUNEL反应混合物，在湿盒中37℃孵育60分钟，PBS冲洗，加入50μl转化剂POD，在恒温孵育箱放湿盒中37℃孵育30分钟，PBS冲洗两次，加入50μlDAB底物溶液，室温孵育10分钟，PBS冲洗两次，苏木素复染，封片；在光学显微镜下每张切片观察5个视野，计数500个细胞中凋亡细胞的百分比，计算凋亡指数(apop tosisindex，AI)＝阳性细胞数/总细胞数×100％。
2.2.7统计学处理：计量资料用表示，两组间比较采用t检验。
实施例1
造模后给予F573
1.方法
将Wistar大鼠随机分为6组：正常对照组、模型组、阳性药N-乙酰半胱氨酸(NAC 155mg/kg)组和F573高剂量(H 5.0mg/kg)、中剂量(M 2.5mg/kg)、低剂量(L1.25mg/kg)组，每组10只，除空白组外，各组腹腔注射(ip)造模药D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg，造模2小时后各组ip相应的NAC、F573，空白组给予相应体积溶剂，即：
①空白组：ip溶剂(0.5％CMC的生理盐水)，按体重ip 2ml/200g
②模型组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg及ip溶剂1ml/200g
③NAC组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+NAC 155mg/kg
④F573H组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 5.0mg/kg
⑤F573M组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 2.5mg/kg
⑥F573L组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 1.25mg/kg
造模10h后大鼠股动脉取血分离血清，测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)，放血处死大鼠后，取肝脏称重，计算肝脏系数，并每只同一部位取1.5×1.5×0.5(cm)大小肝脏，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，常规HE染色，做组织病理学观察，用半定量病理指数(PI)评定肝组织病理变化；应用TUNEL法及流式细胞仪分析肝细胞凋亡的变化。
2结果
2.1大鼠体重
各组大鼠给药前后体重变化不大(P＞0.05)，见表1、表2-b，表明本实验造模药和供试药对大鼠体重无影响。
表1大鼠给药前后体重(g)
2.2肝脏重量和肝脏系数
给药后各组大鼠肝脏重量和肝脏系数与正常对照组比差异有统计学意义(P＜0.01)，而各给药组间差异相差不大无统计学意义(P＞0.05)见表2-a，2-b，表明造模药Gal N/LPS对大鼠肝脏影响较大，造成一定炎症至肝肿大，但对大鼠体重无影响；而F573对大鼠肝脏重量与体重均无影响。
表2-a给药后大鼠肝脏重量和肝脏系数
注：##与正常对照组比较P＜0.01
表2-b 给药后大鼠体重、肝脏重量和肝脏系数变化
注：##与空白对照组比较P＜0.01
2.3血清生化指标
经D-GalN/LPS造模后，大鼠血清ALT、AST和T Bil水平急剧大幅度升高，模型组明显高于正常对照组(P＜0.01)(模型组ALT、AST和T Bil分别升高49、17和22倍)，表明模型成立；F573H、M、L各剂量组大鼠血清ALT、AST和T Bil水平较模型组非常明显降低(P＜0.01)，其中F573H、M和L组的ALT分别降低42％、56％和49％；AST分别降低58％、54％和62％；T Bil分别降低77％、84％和70％，与阳性药NAC组相近，见表3-a、3-b。
结果表明，F573可非常显著地降低ALT、AST和T Bil，明显改善肝功能，具有治疗作用。
表3-a给药后各组大鼠血清ALT、AST和T Bil
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**与模型组比较P＜0.01
表3-b给药后各组大鼠血清ALT、AST和T Bil水平的比较
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**与模型组比较P＜0.01
2.4肝组织病理学观察
2.4.1肉眼观察
正常对照组肝脏形态正常，被膜光滑、完整、色泽红润、质地柔软。模型组肝脏明显肿胀，略显苍白，表面可见弥漫性出血点及散在淤斑，质地柔软偏韧。其余各组肝脏表面散在点、片状出血点面积较模型组小。
2.4.2光镜下观察
正常对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区未见炎细胞浸润，肝窦无扩张及淤血；而模型组肝细胞大片坏死，或呈散在性分布，坏死灶中可见溶解坏死无结构的肝细胞和呈球形凝固性坏死的肝细胞(可能为晚期凋亡细胞)以及散在分布的凋亡小体；周围可见正常肝细胞残留，原有肝小叶结构消失；凋亡细胞呈圆形，胞核固缩深染，染色质呈团块状，胞质浓缩；F573H、M、L各剂量给药组肝细胞坏死、凋亡比模型组明显减轻，半定量病理指数(PI：每组测定20个高倍视野，计数每个视野中病变肝细胞数之比)比模型组明显减少(P＜0.01)，分别减少92％、96％和85％，阳性药NAC组也明显减少，即F573H、M、L剂量组及NAC组的PI高于对照组而明显低于模型组，见表4、表7，图1。
结果表明：F573可非常明显减轻肝损伤，明显改善肝功能，具有治疗作用。
表4F573对大鼠肝脏病理指数PI的影响
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**与模型组比较P＜0.01
2.4.3流式细胞仪检测大鼠肝组织中细胞凋亡率
与正常对照组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡率明显升高(P＜0.01)(比正常对照组肝细胞凋亡率升高5倍)，模型成立；与模型组比较，F573H、M和L各给药组肝细胞凋亡率明显降低，比模型组分别降低63％(P＜0.01)、44％(P＜0.01)和37％(P＜0.05)，呈现量效关系(表3、表7)；阳性药NAC组也有相同表现，降低52％。实验结果表明F573可明显抑制肝细胞的凋亡。
表5F573对流式细胞术检测大鼠肝细胞凋亡率％的影响
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05。
2.4.4TUNEL法半定量检测肝细胞凋亡
与正常对照组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡指数AI(每切片5个视野计数500个细胞中凋亡细胞的百分比)急剧升高(P＜0.01)(升高108倍)模型成立；与模型组比较，F573的H、M和L各给药组肝细胞凋亡指数AI非常显著地降低，分别降低67％、55％和42％，均具有非常显著性意义(P＜0.01)，且呈现量效关系；阳性药NAC组也有相同表现降低55％(表6、7，图2)。
结果再次表明：F573可明显抑制肝细胞的凋亡。
表6F573对TUNEL法半定量检测肝细胞凋亡指数AI的影响
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05。
表7F573对大鼠肝脏病变及细胞凋亡的影响
注##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05
3.讨论与结论
肝细胞大块凋亡和坏死在暴发性肝衰竭中起主导作用，病程凶险，病人约10天死亡，俗称急性黄色肝萎缩。LPS与D-GaLN联合应用协同增效引起大鼠急性肝损伤模型被公认为与人类疾病相似、病变有一定发展过程，形成率高，死亡率低，重复性好，造模简便易行，故选用此模型。
预试验显示ip D-GalN/LPS(500mg/kg/20μg/kg)2h后血清ALT、AST和TBil等生化指标已开始升高，而细胞凋亡发生在损伤的早期，故选择2h后开始给予F573。因文献报道D-GalN/LPS造成的急性肝损伤10h前以凋亡为主，10h后以坏死为主，故选择第10h时检测各指标，以考察F573的治疗作用。
F573是一种二肽衍生物，它是caspase的抑制剂。
实验结果表明，大鼠经D-GalN/LPS处理后，出现了典型暴发性肝衰竭的表现，血清ALT、AST和T Bil水平急剧大幅度升高，细胞凋亡显著，模型成立。
F573H组5mg/kg、M组2.5mg/k g、L组1.25mg/kg对大鼠急性肝损伤造成的大鼠暴发性肝衰竭均具有明显的抑制作用，可明显改善D-氨基半乳糖和脂多糖所致的肝细胞病理性凋亡及坏死，非常显著降低ALT、AST和T Bil(F573的H、M和L组比模型组ALT分别降低42％、56％和49％，AST分别降低58％、54％和62％，T Bil分别降低77％、84％和70％)，非常明显改善肝功能；组织病理学显示可非常明显改善D-GalN/LPS所致的肝细胞病理性凋亡及坏死，减轻肝损伤，半定量病理指数大幅度减小(比模型组分别降低92％、96％和85％，均具有统计学意义P＜0.01)。
TUNEL法、流式细胞法两种试验结合验证了F573在体内实验中能够有效地抑制细胞凋亡，与模型组比流式的细胞凋亡率分别非常显著降低63％、44％和37％，TUNEL的凋亡指数分别非常显著降低67％、55％和42％(均具有统计学意义P＜0.01)。
结论：F573可明显改善肝功能，减轻肝损伤，显著抑制肝细胞坏死和凋亡，对急性重度的肝损伤有治疗作用，有望成为细胞大量坏死和凋亡主导的急性肝衰竭(FHF)病(包括慢加急性肝衰竭)的治疗药物。
实施例2
造模同时给予F573
1.方法
重复实施例1，不同点在于：将70只Wistar大鼠随机分为7组：正常对照组、模型组、阳性药N-乙酰半胱氨酸(NAC 155mg/kg)组和F573高剂量(H：5mg/kg)、中剂量(M：2.5mg/kg)、低剂量(L：1.25mg/kg)组和极低剂量(LL：0.625mg/kg)组，每组10只，除空白组外，各组腹腔注射(ip)造模药D-Gal 500mg/kg和LPS20μg/kg，造模的同时(0小时)各组ip相应的NAC、F573，空白组给予相应体积溶剂，即：
①空白组：ip溶剂(0.5％CMC的生理盐水)，按体重ip 2ml/200g
②模型组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+ip溶剂1ml/200g
③NAC组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+NAC 155mg/kg
④F573H组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 5.0mg/kg
⑤F573M组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 2.5mg/kg
⑥F573L组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 1.25mg/kg
⑦F573LL组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 0.625mg/kg
造模10h后大鼠股动脉取血分离血清，测定丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)。放血处死大鼠后，取肝脏称重，计算肝脏系数；并每只同一部位取1.5×1.5×0.5cm大小肝脏，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋、切片，常规HE染色，做组织病理学观察，用半定量病理指数(PI)评定肝组织病理变化；及应用TUNEL法及流式细胞仪分析肝细胞凋亡的变化。
2.结果
2.1大鼠体重
各组大鼠给药前后体重变化不大(P＞0.05)，见表8、表9-b，表明本实验造模药和供试药对大鼠体重无影响。
表8大鼠给药前后体重(g)
2.2肝脏重量和肝脏系数
给药后各组大鼠肝脏重量和肝脏系数与正常对照组比差异有统计学意义(P＜0.01)，而各给药组间差异相差不大无统计学意义(P＞0.05)见表9-a，2-b，表明造模药Gal N/LPS对大鼠肝脏影响较大，造成一定炎症至肝肿大，但对大鼠体重无影响；而F573对大鼠肝脏重量与体重均无影响。
表9-a给药后大鼠肝脏重量和肝脏系数
注：##与正常对照组比较P＜0.01
表9-b给药后大鼠体重、肝脏重量和肝脏系数变化
注：##与空白对照组比较P＜0.01
2.3血清生化指标
经D-GalN/LPS造模后，大鼠血清ALT、AST和T Bil水平急剧大幅度升高，模型组明显高于正常对照组(P＜0.01)(模型组ALT、AST和T Bil分别升高45、18和5倍)，表明模型成立；F573H、M、L和LL各剂量组大鼠血清ALT、AST和TBil水平较模型组明显降低(P＜0.01)，其中F573H、M、L和LL组的ALT分别降低86％、65％、67％和28％，呈现量效关系；AST分别降低82％、61％、62％和7％，呈现量效关系；T Bil分别降低96％、52％、30％，LL组无降低，呈现量效关系；阳性药NAC组也具有降低ALT、AST和T Bil作用。
试验表明F573可显著的降低ALT、AST和T Bil，明显改善肝功能，具有预防保护作用。见表10-a、10-b。
表10-a给药后各组大鼠血清ALT、AST和T Bil
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**与模型组比较P＜0.01
表10-b给药后各组大鼠血清ALT、AST和T Bil水平的比较
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**与模型组比较P＜0.01
2.4肝组织病理学观察
2.4.1肉眼观察
正常对照组肝脏形态正常，被膜光滑、完整、色泽红润、质地柔软。模型组肝脏明显肿胀，略显苍白，表面可见弥漫性出血点及散在淤斑，质地柔软偏韧。其余各组肝脏表面散在点、片状出血点面积较模型组小。
2.4.2光镜下观察
常规HE染色，光镜下进行组织病理学观察，正常对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，汇管区未见炎细胞浸润，肝窦无扩张及淤血；模型组肝细胞大片状坏死或呈散在性分布，细胞结构模糊不清，肝组织中可见肝细胞液化性坏死伴随着较多球形凝固性坏死的肝细胞散在分布(可能为晚期凋亡细胞)以及散在分布的凋亡小体；原有肝小叶结构消失；凋亡细胞呈圆形，胞核固缩深染，染色质呈团块状，胞质浓缩；周围可见正常肝细胞。除F573极低剂量组外，其他F573各剂量组及阳性药NAC组肝细胞坏死、凋亡与较模型组明显减轻。其中LL组：病变与模型组相当，肝组织中可见较多球形凝固性坏死的肝细胞散在分布，范围较大。L组：肝组织中可见较多小灶状肝细胞呈液化性坏死，同时肝组织中也可见较多球形凝固性坏死的肝细胞散在分布；凋亡细胞数量明显低于模型组，可见点状和小灶性坏死的肝细胞周围有单核细胞浸润并发生坏死，肝细胞变性坏死较模型组有所减轻，肝窦淤血，每可见点、灶状肝细胞坏死区；M组：病变程度较低剂量组进一步减轻，肝组织中可见部分肝细胞发生球形凝固性坏死和液化性坏死，少数肝细胞发生点状坏死，散在分布，也可见小灶性肝细胞坏死和单个坏死的肝细胞伴有炎细胞浸润并发生坏死；H组：病变程度较中剂量组进一步减轻，肝组织中可见小灶状肝细胞液化性坏死伴有少数肝细胞球形凝固性坏死，呈散在性分布，坏死灶内可见大量固缩的细胞核，单个坏死的肝细胞常见。NAC组：病变较F573的M组为重，肝组织中可见较多小灶状肝细胞坏死，呈散在性分布，伴有较多球形凝固性坏死的肝细胞，可能为晚期凋亡的肝细胞。F573H、M组病理指数(半定量病理指数PI：每组测定20个高倍视野，计数每个视野中病变肝细胞数所占比例)非常显著低于模型组(P＜0.01)，并且也低于阳性药NAC组(P＜0.05)，F573H、M、L组的PI比模型组分别减少83％、69％、17％，LL组无变化，呈现量效关系，见表11、表14，图3。
表11 F573对大鼠肝脏病理指数PI的影响
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05
2.4.3流式细胞仪检测大鼠肝组织中细胞凋亡率
与正常对照组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡率明显升高(P＜0.01)(比正常对照组肝细胞凋亡率升高近3倍)，模型成立；与模型组比较，F573H、M、L和LL各给药组流式的肝细胞凋亡率明显降低，比模型组分别降低54％(P＜0.01)、54％(P＜0.01)、25％(P＜0.05)和9％，呈现量效关系；阳性药NAC组也有相同表现降低64％(P＜0.01)(表12、表14)。
结果表明：F573可明显抑制肝细胞的凋亡。
表12 F573对流式细胞术检测大鼠肝细胞凋亡率％的影响
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05。
5.4.4TUNEL法半定量检测肝细胞凋亡
与正常对照组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡指数AI(每切片5个视野计数500个细胞中凋亡细胞的百分比)明显升高(P＜0.01)(升高52倍)，模型成立；与模型组比较，F573H、M、L和LL各给药组肝细胞凋亡指数明显降低，分别降低57％(P＜0.01)、35％(P＜0.01)、27％(P＜0.05)和22％，呈现量效关系；阳性药NAC组也有相同表现，AI降低38％(P＜0.05)(表13-14，图4)。结果再次表明F573可明显抑制肝细胞的凋亡。
表13F573对TUNEL法半定量检测肝细胞凋亡指数AI的影响
注：##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05。
表14F573对大鼠肝脏病变及细胞凋亡的影响
注##与空白对照组比较P＜0.01；**，*与模型组比较P＜0.01，P＜0.05
大鼠经D-GalN/LPS处理后，出现了急性肝损伤所致典型暴发性肝衰竭的表现，血清ALT、AST和T Bil水平急剧大幅度升高，细胞凋亡显著，模型成立；caspase抑制剂F573的H、M、L和LL各剂量组对大鼠体重和肝脏系数无影响，但可明显降低ALT、AST和T Bil水平，其中F573H、M、L和LL组比模型组的ALT分别降低86％、65％、67％和28％；AST分别降低82％、61％、62％和7％；T Bil分别降低96％、52％、30％(LL组无降低)，呈现量效关系，表明F573对大鼠急性肝损伤具有明显改善作用，明显改善肝功能；组织病理学显示除LL组外，F573其它各组可显著抑制D-GalN/LPS所致的肝细胞病理性凋亡及坏死，减轻肝损伤，F573H、M组病理指数(PI)非常显著低于模型组(P＜0.01)，并且也低于阳性药NAC组(P＜0.05)，F573H、M、L组的PI比模型组分别减少83％、69％、17％，具有量效关系；TUNEL法、流式细胞法两种试验结合验证了F573在体内实验中能够有效地抑制肝细胞坏死凋亡，其中流式细胞法测出F573H、M、L和LL各给药组肝细胞凋亡率明显降低，比模型组分别降低54％(P＜0.01)、54％(P＜0.01)、25％(P＜0.05)和9％，TUNEL的凋亡指数分别降低57％(P＜0.01)、35％(P＜0.01)、27％(P＜0.05)和22％，都具有量效关系，显示F573可显著抑制D-氨基半乳糖和脂多糖所致的肝细胞病理性凋亡及坏死。
结论：F573明显改善肝功能，可显著抑制肝细胞坏死和凋亡，对急性重度的肝损伤有预防和保护作用，有望成为细胞大量坏死和凋亡主导的急性肝衰竭(FHF)病的治疗药物。
实施例3
造模前给予F573
1.方法
重复实施例1，不同点在于：造模之前4小时各组ip相应的NAC、F573，空白组给予相应体积溶剂，即：
①空白组：ip溶剂(0.5％CMC的生理盐水)，按体重ip 2ml/200g
②模型组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+ip溶剂1ml/200g
③NAC组：ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+NAC 155mg/kg
④F573H组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 5.0mg/kg
⑤F573M组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 2.5mg/kg
⑥F573L组ip D-Gal 500mg/kg和LPS 20μg/kg+F573 1.25mg/kg
实验结果表明，大鼠经D-GalN/LPS处理后，出现了典型暴发性肝衰竭的表现，血清ALT、AST和T Bil水平急剧大幅度升高，细胞凋亡显著，模型成立。
预先给予F573H组5mg/kg、M组2.5mg/k g、L组1.25mg/kg对大鼠急性肝损伤造成的大鼠暴发性肝衰竭均具有明显的抑制作用，可明显改善D-氨基半乳糖和脂多糖所致的肝细胞病理性凋亡及坏死，非常显著降低ALT、AST和T Bil，非常明显改善肝功能；组织病理学显示可非常明显改善D-GalN/LPS所致的肝细胞病理性凋亡及坏死，减轻肝损伤，半定量病理指数大幅度减小(比模型组分别降低80-92％，均具有统计学意义P＜0.01)。
TUNEL法、流式细胞法两种试验结合验证了F573在体内实验中能够有效地抑制细胞凋亡，与模型组比流式的细胞凋亡率分别非常显著降低35-66％，TUNEL的凋亡指数分别非常显著降低40-70％(均具有统计学意义P＜0.01)。
结论：预先给予F573可明显改善肝功能，减轻肝损伤，显著抑制肝细胞坏死和凋亡，对急性重度的肝损伤有预防作用。
实施例4
F573对人正常肝细胞L02的保护作用
本实验观察F573对由凋亡诱导剂TNFα诱导凋亡的人正常肝细胞L02的生长是否具有保护作用。
实验方法如下：
1)MTT法检测F573对诱导凋亡的细胞保护作用：对L02细胞，一批供试品F573设4个剂量组，分别为0、0.5、5、50μM。另一批供试品F573设10个剂量组，从10μM开始三倍稀释，最后一个点为0μM。常规血清培养的L02细胞加入药物F573培养2hr后再加入TNF α和放线菌素D共刺激24hr。MTT法检测细胞的增殖情况，并计算EC50。
2)Western-blot法检测F573对诱导凋亡的产物active-PARP剪切片段的抑制作用：对L02细胞供试品F573设4个剂量组，分别为0、0.5、5、50μM。常规血清培养的L02细胞加入TNF α和放线菌素D共刺激18-24hr后加入药物F573连续培养6hr。收集蛋白，Western-blot法检测胞内凋亡产物active-PARP表达情况。
3)Caspase-Glo 3&7试剂盒(Promega)检测不同时间点加入F573对胞内凋亡酶Caspase 3的抑制作用：对L02细胞供试品F573设10个点和不加药的空白孔，从10μM开始三倍稀释，常规血清培养的L02细胞，加入药物F573预孵育2hr、只预孵育2hr然后洗去F573、和同时加入TNFα和放线菌素D共继续培养6hr。加入Caspase-Glo 3&7试剂盒底物检测Caspase 3的表达水平。
4)实验结果：
MTT结果表明：F573能明显缓解凋亡诱导剂TNFα和放线菌素D导致的细胞凋亡，并随药物浓度梯度降低保护作用也随之降低。且F573保护正常肝细胞L02的EC50为1.14μM。
Western-blot结果表明：F573能明显降低胞内凋亡产物active-PARP剪切片段的产生。
Caspase-Glo 3&7试剂检测结果表明：F573能抑制胞内Caspase 3的活性，对Caspase 3的IC50为nM-μM水平，并且不随F573加入方式的改变而改变。
上述体外研究实验的结果表明：F573能明显保护体外培养的L02细胞。
实施例5
F573对生存率的提高作用
昆明(km)小鼠(spf级)120只，雌雄各半，体重20-22g，按每组20只分为6组：模型组、模型+溶剂组、模型+阳性药N-乙酰半胱氨酸(NAC 200mg/kg)组和F573高剂量(H 5.0mg/kg)、中剂量(M 2.5mg/kg)、低剂量(L 1.25mg/kg)组。
各组腹腔注射(ip)造模药D-Gal 600mg/kg和LPS 20μg/kg，造模的同时(0小时)ip相应的NAC或皮下注射F573，空白组给予相应体积溶剂。观察24h，存活情况如表15所示。
表15F573对生存率的提高作用
从表15可看出，F573可显著提高肝衰竭模型动物的存活率，且提高幅度与F573剂量相关。这提示，F573可用于提高肝衰竭病人(尤其是急性肝衰竭和慢加急性肝衰竭病人)的生存率。
实施例6
制备含F573的药物组合物
(a)注射液
F573 30mg
非水溶媒(注射用) 加至2ml
按上述配方，称取F573和适量非水溶媒，主药灭菌成无菌粉末，后分别包装。供注射用时现用现配。
(b)胶囊
F573 50-200mg
聚乙烯吡咯烷酮 2-10mg
淀粉 50-100mg
乳糖 2-10mg
按1000个胶囊的用量，称取以上各辅料分别研细过筛后混合均匀，然后用等量递加法加入F573，充分研磨，使其分散均匀，再过80目筛，然后灌制成胶囊。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐的用途，
其特征在于，用于制备改善肝功能相关指标或改善肝功能的药物，其中所述的改善肝功能相关指标或改善肝功能为降低肝衰竭对象的总胆红素(TBil)。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的改善肝功能相关指标或改善肝功能还包括：降低丙氨酸转氨酶(ALT)和/或降低天冬氨酸转氨酶(AST)。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物含有药学上可接受的载体以及占总重量0.01-99％的式I化合物或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型是片剂、胶囊、注射剂、丸剂。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于提高肝衰竭病人的生存率。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的肝衰竭包括：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、和慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物的剂型为注射剂或口服制剂。
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