CN102586323A - 靶向免疫融合蛋白的构建、表达和纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向免疫融合蛋白及其突变体的生产方法，包括表达载体的构建、真核表达过程以及纯化方法。另外，本发明还涉及免疫融合蛋白及其突变体等上述方法中的中间体和它们的应用。

Description

靶向免疫融合蛋白的构建、表达和纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体而言，本发明涉及靶向免疫融合蛋白的生产方法，包括表达载体的构建、真核表达过程以及纯化方法。

发明背景

原癌基因HER2/neu，又名ErbB2，是膜受体中具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族的第二号成员。ErbB2通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达，然而在人类多种恶性肿瘤中却过度表达，如乳腺癌(25-30％)、卵巢癌(25-32％)、肺癌(30-35％)、原发性肾细胞癌(30-40％)等，同时研究发现，HER2的过度表达通常预示着癌症恶变率高或预后差(Slamon DJ，Godolphin W，Jones LA，et al.(1989)Studies of the ErbB2/neu Proto-oncogene in Human Breastand Ovarian Cancer.Science，244(4905)：707-712.)。

研究认为，HER2高表达的癌细胞发生是由于ErbB2蛋白与其家族成员(EGFR、ErbB3、ErbB4)形成的异二聚体诱导酪氨酸激酶活化，激活受体胞内部分(C端)酪氨酸残基发生自身磷酸化，然后激发细胞内信号级联反应，导致下游信号分子的激活，刺激细胞增殖、发育、分化、迁移及瘤细胞形成(Alroy I，Yarden Y.(1997)The ErbB SignalingNetwork in Embryogenesis and Oncogenesis：Signal Diversification through CombinatorialLigand-receptor Interactions.FEBS Lett，410：83-86.)。目前，国内外生产销售HER2过表达的抗癌药物是以阻断HER2异二聚体的形成或信号发生为靶点的单克隆抗体药物或小分子酶类抑制剂。

众所周知，尽管单克隆抗体药物的临床应用使部分HER2过表达的癌症患者获得治疗，但是其客观有效率并不高，加上其费用高昂，因此，需要开发针对HER2/neu的新机制药物并提供比目前人癌症治疗效果更佳、更安全、毒性更小的药物成为同行们期盼的目标(J.-L.Merlin，M.Barberi-Heyob&N.Bachmann。(2002)In vitro comparative evaluation oftrastuzumab combined with paclitaxel or docetaxel in HER2-expressing human breast cancer celllines.Annals of Oncology 13：1743-1748)。

靶向免疫融合蛋白作为HER2/neu的新机制药物，以其用药量少、费用低、毒性更小而成为未来的主导药物之一(Ming Shi，Zhigang Xie，Jiannan Feng，Yingxun Sun，Ming Yu，Beifen Shen&Ning Guo.(2003)A recombinant anti-erbB2，scFv-Fc-IL-2fusion protein retainsantigen specificity and cytokine function.Biotechnology Letters 25：815-819)、(Jessica M.，Manuela K.，EvelineT.，Roberto S.，Stuart H.，Camilla B.，Leonardo G.，and Dario N.(2008)Antibody-Mediated Delivery of Interleukin-2to the Stroma of Breast Cancer Strongly Enhancesthe Potency ofChemotherapy.Clin Cancer Res；14(20)October15.)。它是根据药物的作用特点和生物学活性需求不同将抗体和某些药物进行基因重组，然后，再利用质粒转染技术在细胞或细菌中表达，经过纯化而获得的高纯度融合蛋白，即“生物导弹”，其特点是：(1)具有抗体的二聚体结构，增加了融合蛋白的分子量，提高其在体内的半衰期；(2)可利用抗体的靶向特性可将融合蛋白招募到靶细胞周围，发挥融合蛋白中诱导免疫杀伤等功效的多肽功。

然而，由于靶向免疫融合蛋白中成分来源复杂，结构超出了一般蛋白质的大小，因此其载体适应性往往不佳，其生产出的纯度、均一性和稳定性也成问题。例如，中国专利ZL200410039594.3及其引用的文献(Biotechnol.Letters.25：815-819)改造了可以表达靶向免疫融合蛋白的整合载体pCMV-HFI-mNeo，其由Promega公司的pCI-neo载体出发，通过BamHI和StuI酶切其置换neo基因，构建载体pCMV-dhfr，然后在pCMV-dhfr的NheI和EcoRI之间插入anti-c-erbB2-scFv基因，再在EcoRI和XhoI之间插入IgG1 Fc段基因，并在XhoI和MluI之间插入IL-2基因。然而，本发明人发现，根据该专利教导，在NheI和EcoRI之间插入基因之后，必将缺失掉XhoI位点，无法继续适应靶向免疫融合蛋白的实施，即anti-c-erbB2-scFv、IgG1 Fc和IL-2基因片段无法同时插入，根本无法构建该整合载体pCMV-HFI-mNeo，相应无法生产靶向免疫融合蛋白。因此，本发明人克服了这些文献的误导和偏见，重新构建了整合的pCI-VCI-DHFR系列真核表达载体，尽管在多处编码序列有突变，但是仍旧能够表达出有活性的靶向免疫融合蛋白，也保证了该蛋白的均一性；另外本发明人根据该真核表达载体，重新组合并优化了蛋白质生产下游的细胞外分泌技术、无血清培养基悬浮培养以及抗体亲和层析技术，简化了工艺流程、提高样品纯度和稳定性，同时也降低了成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的误导，提供切实可行的靶向免疫融合蛋白的真核表达载体构建方法及生产方法。而且，尽管表达的靶向免疫融合蛋白序列结构在连接基因和/或白介素2基因等有多处相对于现有技术有变化，但是仍旧保留了靶向抗肿瘤的活性，另外还获得了高稳定性的效果；构建的真核表达载体适应真核细胞的高表达，而且表达产物杂质少，方便下游纯化，加之本发明人优化的纯化步骤，能够获得药物级纯度的靶向免疫融合蛋白及其突变体。

具体而言，在第一方面，本发明提供了靶向免疫融合蛋白或其突变体的生产方法，其包括，构建选自pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR和pCI-VCI^125S-DHFR的真核表达载体，培养转染了该真核表达载体的真核细胞，然后纯化培养获得的上清液，其中纯化的过程包括进行阴离子交换层析、亲和层析、和分子筛层析。

在本文中，VCI、VCI^125A、和VCI^125S分别指的是靶向免疫融合蛋白和其两个突变体。其中，靶向免疫融合蛋白，VCI，由SEQ ID NO：1所示的核酸序列编码；靶向免疫融合蛋白的突变体，VCI^125A，由SEQ ID NO：2所示的核酸序列编码；靶向免疫融合蛋白的突变体，VCI^125S，由SEQ ID NO：3所示的核酸序列编码。因此，本发明第一方面的方法所生产的靶向免疫融合蛋白或其突变体由选自SEQ ID NO：1-3之一所示的核酸序列编码。

本发明的真核表达载体具有确定的、可重复构建的、切实可行的结构，克服了现有技术的误导。具体而言，

(a)pCI-VCI-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2 PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4 PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P2 PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI-DHFR。载体pCI-VCI-DHFR能够在真核细胞中表达VCI。

(b)pCI-VCI^125A-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2 PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P3PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI^125A-DHFR。载体pCI-VCI^125A-DHFR能够在真核细胞中表达VCI^125A。

(c)pCI-VCI^125S-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2 PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2 PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4 PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P4PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI^125SDHFR。载体pCI-VCI^125S-DHFR能够在真核细胞中表达VCI^125S。

在本文中，具体的基因可以通过熟知的公共数据库(如，Genbank，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得，本领域技术人员根据基因序列可以合成或者从相应宿主细胞中RT-PCR扩增出。例如优选在本文中，DHFR基因的序列如Genbank：NM_010049.3所示，抗HER2抗体重链可变区基因如Genbank：A22466.1所示，抗HER2抗体轻链可变区基因如Genbank：A22467.1所示，人抗体IgG1重链恒定区基因如Genbank：AF150959.1所示，白介素2基因如Genbank：NM_000586.3所示。当然，本发明的靶向免疫融合蛋白或其突变体并不是上述具体的基因序列的简单拼接后所编码的，而是其中具有一定的连接次序排列，而且不同基因之间通过各个编码连接肽的连接基因连接。连接基因的序列以及突变体的突变位点由本发明人研究获得的引物对所决定。这些引物对包括DHFR-P1和DHFR-P2，V-P1和V-P2，V-P3和V-P4，V-P1和V-P4，C-P1和C-P2，I-P1和I-P2，I-P1和I-P3，或I-P1和I-P4。这些引物对所决定的连接肽和突变体结构非但能够保持靶向免疫融合蛋白或其突变体的靶向抗肿瘤活性，而且使得它们具有高稳定性。

优选在本发明第一方面的生产方法中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，例如人或鼠细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。在本发明的具体实施方式中，真核细胞是CHO/dhfr-细胞株。现有许多真核细胞都已经商品化，可以通过商业渠道购买。本发明人经过大量比较实验发现，本发明的pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR和pCI-VCI^125S-DHFR载体通过脂质体介导法转染入CHO/dhfr-细胞株，载体适应性非常佳，即转染了pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR载体的CHO/dhfr-细胞株相交其他多种商业化细胞株，表达的蛋白量高且稳定，而且杂质量少，更具有产业化前景，同时也方便了下游的纯化工作。因此本发明也优选，真核表达载体通过脂质体介导法转染入真核细胞，其中真核表达载体和真核细胞的配对为pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR载体与CHO/dhfr-细胞株的配对。

本发明人发现，与常规CHO细胞于37℃培养不同，当降低培养温度，转染了pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR载体的CHO/dhfr-细胞株的目的蛋白表达效率将大大提高。因此优选在本发明第一方面的生产方法中，培养是在28～35℃的条件下培养，优选培养是在29～32℃的条件下培养。在本发明的具体实施方式中，以30℃培养。

优选在本发明第一方面的生产方法中，纯化的过程依次包括将培养获得的上清液进行离心、过滤、透析、阴离子交换层析、亲和层析、任选的过滤、和分子筛层析。由于本发明的靶向免疫融合蛋白或其突变体连接结构导致的性质稳定，加之本发明人改良的阴离子交换层析和亲和层析的收集体系可靠，因此在纯化期间没有出现蛋白质沉淀的现象。因此优选在本发明第一方面的生产方法中，纯化的过程依次包括将培养获得的上清液进行离心、过滤、透析、阴离子交换层析、亲和层析、和分子筛层析，其中在亲和层析和分子筛层析之间不进行过滤，这可以进一步简化生产过程。另外，本发明人发现，因为靶向免疫融合蛋白或其突变体的分子量较大，单此高速长时离心，在去除细胞及细胞碎屑的同时，会损失较多的靶向免疫融合蛋白，因此优选在本发明第一方面的生产方法中，纯化的过程中的离心为分两次离心。尽管本发明的纯化过程的组合是现有技术所没有启示的，能够纯化蛋白达到超过药用级的纯度(大于95％)，然而其中每一步骤中使用的材料都可以通过商业途径购买，例如，其中阴离子交换层析优选是DEAE Sepharose FF阴离子交换层析；亲和层析优选是MabSelect Sure亲和层析；和/或，分子筛层析优选是Superdex-200分子筛层析。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的生产方法生产出的靶向免疫融合蛋白或其突变体。这样生产出的蛋白具有靶向抗肿瘤活性，而且性质稳定，在没有蛋白质保护剂的条件下保存1个月未发现降解。

本发明第一方面的生产方法能够尽最大程度地保留二聚体形式的靶向免疫融合蛋白或其突变体，中间产物中单体和四聚体较少，提高了生产效率与产物的均一性。也就是说，本发明第一方面的生产方法已经尽可能没有使得该二聚体降解(形成单体)，也尽可能没有使得该二聚体多聚化(形成四聚体)。因此优选本发明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突变体是二聚体。靶向免疫融合蛋白或其突变体由选自SEQ ID NO：1-3之一所示的核酸序列编码，因此优选本发明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突变体是由选自SEQ ID NO：1-3之一所示的核酸序列编码的蛋白质二聚体。

在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突变体，和药学上可接受的载体。在本文中，“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、缓冲剂、保护剂、防腐剂、包裹材料或其他制剂辅料。优选本发明第三个方面的药物组合物，通过注射途径来给药，如静脉注射、肌肉注射或皮下注射，因此所述药物组合物优选是粉针剂(如冻干粉针剂)和液体制剂。

在第四方面，本发明提供了本发明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突变体在制备用于靶向抗肿瘤的药物中的应用。该药物可通过所属领域技术人员所熟知的给药方式来进行给药，来治疗肿瘤或癌症。例如，可用给药方式包括，注射、口服、直肠、舌下、肺部、透皮、离子透入、阴道及鼻内给药，优选胃肠道外给药，如皮下、肌内或静脉内注射。给药剂量根据制剂形式和期望的作用时间以及治疗对象的情况而有所变化，实际治疗所需的量可以由临床医生根据受试者实际情况(如，病人的病情、体重、年龄、性别等)而方便地确定。根据本发明的具体实施方式，优选本发明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突变体在制备用于靶向抗乳腺癌、卵巢癌、胃癌或肺癌的药物中的应用。

另外，本发明还提供了用于本发明第一方面的生产方法中的中间体，包括核酸、引物对、载体、细胞和细胞上清液等；相应地，本发明还提供了中间体在本发明第一方面的生产方法中的应用。

具体而言，在第五方面，本发明提供了核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、2、或3所示。所述核酸不但编码了本发明第二方面的靶向免疫融合蛋白或其突变体，而且应用在本发明第一方面的生产方法中。因此，本发明还提供了核酸在本发明第一方面的生产方法中的应用，所述核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO：1、2、或3所示。

在第六方面，本发明提供了引物对，其为DHFR-P1和DHFR-P2，为V-P1和V-P2，为V-P3和V-P4，为V-P1和V-P4，为C-P1和C-P2，为I-P1和I-P2，为I-P1和I-P3，或为I-P1和I-P4。所述引物对决定了连接肽结构和突变位点，而且直接应用在本发明第一方面的生产方法中。因此，本发明还提供了引物对在本发明第一方面的生产方法中的应用，所述引物对为DHFR-P1和DHFR-P2，为V-P1和V-P2，为V-P3和V-P4，为V-P1和V-P4，为C-P1和C-P2，为I-P1和I-P2，为I-P1和I-P3，或为I-P1和I-P4。

在第七方面，本发明提供了载体，其包含本发明第五方面的核酸。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，优选是pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR，这些优选的真核表达载体直接应用在本发明第一方面的生产方法中，与相应的真核细胞具有良好的适应性。因此，本发明还提供了载体在本发明第一方面的生产方法中的应用，所述载体包含本发明第五方面的核酸，优选所述载体是pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR。

在第八方面，本发明提供了细胞，其为转染了载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR的真核细胞，如哺乳动物细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最优选是CHO/dhfr-细胞株。优选的转染了载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR的CHO/dhfr-细胞株在本发明第一方面的生产方法中，表达量高且稳定，杂质少。因此，本发明还提供了细胞在本发明第一方面的生产方法中的应用，所述细胞为转染了载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR的真核细胞，如哺乳动物细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最优选是CHO/dhfr-细胞株。

在第九方面，本发明提供了细胞上清液，其为培养本发明第八方面的细胞所得的上清液。该上清液中目的蛋白含量高，杂质少，是本发明第一方面的生产方法中良好的下游纯化的起始物。因此，本发明还提供了细胞上清液在本发明第一方面的生产方法中的应用，所述细胞上清液为培养本发明第八方面的细胞所得的上清液。

本发明取得的有益效果包括，蛋白保持了活性，且结构稳定，纯化过程中不易沉淀，纯化后保存时间长；载体克服了现有技术的误导，切实可行，与真核细胞(尤其是CHO/dhfr-细胞株)的适应性好，能获得高表达、低杂质的细胞上清液；纯化步骤避免了蛋白质沉淀，也大大减少了降解和多聚现象的发生，能够生产出超过药用级纯度的蛋白。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了非还原电泳检测的靶向免疫融合蛋白VCI、VCI^125A、VCI^125S的表达图谱，其中图A是靶向免疫融合蛋白VCI在30℃条件下表达培养的不同时间点取样检测的结果，其中0、3、6分别代表第0、3、6天收取的细胞上清液，M代表次高蛋白分子量标记；图B是转染了真核表达载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR、和pCI-VCI^125S-DHFR的细胞株表达培养6天(以分别获得的靶向免疫融合蛋白及其突变体)的电泳结果，其中1、2、3分别代表融合蛋白VCI、VCI^125A和VCI^125S，140KDa和箭头是VCI及其突变体在电泳中所处的位置，表达量均在100-150mg/L之间，而且表达培养的杂质含量不高。

图2显示了靶向融合蛋白VCI层析纯化图谱，其中吸收峰是280nm处测定的蛋白吸收，除了蛋白样品吸收曲线外，还给出了pH值曲线和盐浓度曲线供参考。图A是DEAESepharose FF离子交换纯化图谱；图B是MabSelect Sure亲和层析纯化图谱；图C是Superdex200凝胶层析纯化图谱，其中经检测证明均为VCI，其中左侧峰为VCI六或八聚体甚至更高聚体、中间峰为VCI四聚体、右侧峰为VCI二聚体(目标样品)。

图3显示了VCI纯化后的HPLC检测图谱，其中检测样品为分子筛层析并过滤后样品，使用的设备为Agilent 1100(AgilentTechnologies)，色谱柱为TSKgel G3000SW(XL)，箭头所指为蛋白峰，其右侧小峰是盐峰，纯度已经大大超过药用规定95％的纯度。

图4显示了纯化后新鲜的以及4℃放置一个月的VCI非还原电泳图。检测样品为分子筛层析过滤后样品，其中左图为VCI样品4℃放置0天，右侧图片为VCI样品4℃放置30天，泳道1、2为不同浓度的VCI，泳道3为高分子量标记，4为BSA。箭头是VCI在电泳中所处的位置。

图5显示了HER2受体靶向活性的流式细胞检测图谱，其中左上图为无HER2受体靶向活性的抗体对照，右上、左下、右下分别是靶向免疫融合蛋白及其突变体。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000)等手册以及所用仪器和试剂盒的厂商说明所列的步骤来实施。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买的医药级产品。

实施例1真核表达载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR和pCI-VCI^125S-DHFR的构建

1、材料

大肠杆菌菌株DH5α、CHO/dhfr-细胞株购自美国典型微生物保藏中心(ATCC No.CRL-9096)；载体pCI-neo、T4DNA连接酶购自Promega公司；核酸序列测定和合成通过商业途径委托上海生工生物工程技术服务有限公司完成；Vent DNA聚合酶、核酸限制性内切酶购自NEB公司；mRNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司；DNA片段回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；羊抗人IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；DMEM培养基购自GIBCO公司产品。其中，DHFR基因(Genbank：NM_010049.3)、抗HER2抗体重链可变区基因(Genbank：A22466.1)、抗HER2抗体轻链可变区基因(Genbank：A22467.1)、人抗体IgG1重链恒定区基因(Genbank：AF150959.1)、白介素2基因(Genbank：NM_000586.3)均委托合成出(或RT-PCR扩增出)后，测序验证与现有公开的序列无误。

2、构建过程

(a)以DHFR基因为模板，用引物DHFR-P1(含StuI酶切位点)和DHFR-P2(含BamHI酶切位点)进行PCR扩增，扩增产物用StuI和BamHI双酶切，通过连接酶与用StuI和BamHI双酶切的pCI-neo连接，转化菌株DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒并测序验证正确后，得到载体pCI-DHFR。引物DHFR-P1和DHFR-P2的序列如下：

DHFR-P1：

5′GAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTGGGGGGGGGGACAGCTCAGGGCTGCG 3′；

DHFR-P2：

5’GGATCCTTATCGCTATCGATTCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTGCGGCCATGATCTAAAGCCAGCAAAAGTCC 3’。

(b)以抗HER2抗体重链可变区基因为模板，用引物V-P1(含NheI酶切位点和初始序列)和V-P2(含部分连接肽序列)进行PCR扩增，回收长约460bp的扩增产物；以抗HER2抗体轻链可变区基因为模板，用引物V-P3(含部分连接肽序列)和V-P4(含EcoRI、XhoI和MluI酶切位点和末端用于连接的序列)进行PCR扩增，回收长约380bp的扩增产物；然后，合并上述两部分的扩增产物，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，回收长约800bp的扩增产物，扩增产物用NheI和MluI双酶切，通过连接酶与用NheI和MluI双酶切的pCI-DHFR连接，转化菌株DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒并测序验证正确后，得到载体pCI-V-DHFR，其中初始序列和连接肽序列所编码的氨基酸序列不同于ZL200410039594.3等现有技术文献所公开的。引物V-P1～V-P4的序列如下：

V-P1(重链5′端引物)：

5’GGCTAGCCACCATGGATAGACTTACTTCCTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCCCAGGTACAACTGCAGCAGTCTGGACC 3’；

V-P2(重链3′端引物)：

5′CGCCGGAGCCACCGCCACCAGAACCGCCACCGCCAGAGGAGACGGTGACCGTGGTC3′；

V-P3(轻链5′端引物)：

5′TGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATCCAGCTGACCCAGTCTCACAAATTCC 3′；

V-P4(轻链3′端引物)：

5′GGCGACGCGTCTCGAGGAATTCTTTGATTTCCAATTTTGTCCCCG 3′。

(c)以人抗体IgG1重链恒定区基因为模板，用引物C-P1(含EcoRI酶切位点)和C-P2(含XhoI酶切位点)进行PCR扩增，扩增产物用EcoRI和XhoI双酶切，通过连接酶与用EcoRI和XhoI双酶切的pCI-V-DHFR连接，转化菌株DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒并测序验证正确后，得到载体pCI-VC-DHFR，其中初始序列和多部分连接肽序列所编码的氨基酸序列不同于ZL200410039594.3等现有技术文献所公开的。引物C-P1和C-P2的序列如下：

C-P1(5′端引物)：

5′GGCGGAATTCACATGCCCACCGTGCCCAGCAC 3′；

C-P2(3′端引物)：

5′CGCTCGAGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC 3′。

(d)以白介素2基因，分别用引物I-P1(含XhoI酶切位点和连接肽序列)和I-P2(含MluI酶切位点和和末端序列)、引物I-P1和I-P3(含MluI酶切位点和末端序列，其中带有I125A突变)、和I-P1和I-P4(含MluI酶切位点和末端序列，其中带有I125S突变)进行PCR扩增，扩增产物分别用XhoI和MluI双酶切，通过连接酶与用XhoI和MluI双酶切的pCI-VC-DHFR连接，转化菌株DH5α后挑取阳性克隆，抽提质粒并测序验证正确后，分别得到载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR、和pCI-VCI^125S-DHFR，其中测序得到的编码融合蛋白(VCI、VCI^125A、和VCI^125S)的核酸序列依次如SEQ ID NO：1、2和3所示，除了突变体之外，其中初始序列、多部分连接肽序列以及末端序列所编码的氨基酸序列不同于ZL200410039594.3等现有技术文献所公开的。引物I-P1～I-P4的序列如下：

I-P1(5′端引物)：

5′CCCTCGAGGGAGGGTCCGGCACCATGGCACCTACTTCAAGTTC 3′；

I-P2(3′端无突变引物)：

5′GACGCGTTTCTAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGACAAAAGG 3′；

I-P3(3′端125aa位点突变为丙氨酸引物)：

5’GGACGCGTTTCTAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGCGCAAAGG 3′；

I-P4(3′端125aa位点突变为丝氨酸引物)：

5′GGACGCGTTTCTAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAGAAAAGG 3′。

通过以上步骤，最终构建出能够整合表达靶向免疫融合蛋白的真核表达载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR、和pCI-VCI^125S-DHFR。

实施例2靶向免疫融合蛋白VCI、VCI^125A和VCI^125S的表达和纯化方法：

1，工程细胞株的获得

通过经本发明人优化的脂质体介导法利用脂质体2000(Lipofectamine2000)将实施例1构建的真核表达载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR、和pCI-VCI^125S-DHFR分别转染入CHO/dhfr-细胞。具体而言，将CHO/dhfr-细胞在20ml/培养瓶的无抗生素培养液(含10％(V/V)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基)中培养至细胞密度达到饱和密度的85％。然后分别将15μg实施例1构建的一种真核表达载体DNA和45μl Lipofectamine2000混匀，室温置20分钟后，加到培养瓶中，37℃温箱中培养6小时后更换无抗生素培养液，24小时后加入500μl 0.25％(w/w)胰蛋白酶溶液消化细胞，以1000rmp离心2min弃去培养液，用新鲜无抗生素培养液洗涤一次，然后将细胞轻轻悬浮于200ml无抗生素培养液中，等分成10份，分别置于细胞培养皿中。

37℃培养箱培养36小时后更换培养液(含甲氨蝶呤(MTX)(购自Sigma公司)100μmol/ml的DMEM培养基)，然后每隔3天更换培养液，更换的培养液中甲氨蝶呤浓度依次为100μmol/ml、200μmol/ml和500μmol/ml，其他不变。甲氨蝶呤浓度递加至500μmol/ml时培养12～15天，当对照的空白细胞(不转入实施例1构建的任何一种真核表达载体)全部死亡时，转染的细胞仍旧出现存活的细胞。然后细胞株更换含甲氨蝶呤300μmol/ml的DMEM培养基进行30℃蛋白表达培养，培养6天后取其上清液进行电泳检测，选取蛋白表达量在40mg/L以上的细胞株，用含300μmol/ml MTX的EX-CELL^TM325无蛋白无血清培养基(Sigma)于37℃悬浮培养至饱和细胞密度的80％，然后分离细胞株克隆分别于30℃在含甲氨蝶呤300μmol/ml的DMEM培养基中培养6天后，取其上清液进行电泳检测，选取蛋白表达量在100mg/L以上的细胞株，再用含300μmol/ml MTX的EX-CELL^TM325无蛋白无血清培养基于37℃悬浮培养至饱和细胞密度的80％，于30℃用含甲氨蝶呤300μmol/ml的DMEM培养基滚瓶(50rpm/min)培养(即，表达培养)6天，期间电泳检测目的蛋白(VCI)表达的结果如图1A所示。经电泳检测(检测图谱如图1B所示)，各细胞株表达蛋白水平均高而且稳定，根据面积归一法测定，其中转化了不同真核表达载体的细胞株表达的各靶向免疫融合蛋白(VCI、VCI^125A、和pCI-VCI^125S)表达培养6天的表达水平均稳定在100-150mg/L之间，可以作为工程细胞株，而且杂质蛋白水平不高，有利于下游的纯化。重复上述培养步骤，均能获得该表达量水平的工程细胞株。

2，靶向免疫融合蛋白的纯化

以纯化VCI为例，将上述靶向免疫融合蛋白的工程细胞株在30℃滚瓶条件下表达培养7天后，取培养上清液2500ml，然后在4℃条件下以1500rpm离心5min取上清液，再以8000rpm离心30min(本发明人发现，因为融合蛋白分子量较大，单此高速长时离心，在去除细胞及细胞碎屑的同时，会损失较多的靶向免疫融合蛋白，故分两次离心)收取上清液；随后，收取的细胞上清液经过微滤和超滤处理，其中微滤是采用0.2μm孔径的微孔滤膜(购自MILLIPORE公司)过滤，微滤液用截留30kDa的透析膜(购自MILLIPORE公司)浓缩，同时用含50mMNaCl和0.01％(w/w)Triton X-100的10mM PBS缓冲液(pH7.2)换液、洗脱。

浓缩液以3.5ml/min的流速上样于用含100mM NaCl和0.01％(w/w)Triton X-100的10mM PBS缓冲液(pH7.2)平衡的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱(GE公司)并收集流穿液(图谱如图2A所示，所收集的样品为两箭头之间的峰)。

将收集的穿流液以4ml/min的流速上样于用含400mM NaCl和0.01％(w/w)TritonX-100的10mM PBS缓冲液(pH 7.2)平衡的MabSelect Sure亲和层析柱(GE公司)，弃去穿流液，然后用5倍柱体积的含50mM NaCl、100mM精氨酸和0.01％(w/w)Triton X-100的10mM柠檬酸缓冲液(pH3.5)洗脱并收集洗脱液(图谱如图2B所示，所收集的峰为箭头所指的峰)，然后向收集的洗脱液中加入中和液(含50mM NaCl和0.01％(w/w)TritonX-100的100mM PBS缓冲液，pH8.5)中和至pH中性，期间蛋白质均没有发生沉淀，表明该收集体系可靠，而且本发明的蛋白质性质稳定，可以不需要用0.22μm滤膜过滤。但是，为了保险起见，仍旧将收集的洗脱液通过0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

将收集的滤液以3ml/min的流速上样于用含50mM NaCl的10mM PBS缓冲液(pH7.2)平衡的Superdex-200分子筛层析柱(GE公司)并收集流穿液主峰(图谱如图2C所示，所收集的样品为两箭头之间的峰)，其中绝大大多数产物都是二聚化的目标产物，进一步提高了纯化效率。然后将收集的穿流液用50nm孔径的聚醚砜纳米膜(MILLIPORE公司)过滤，收集纯化的样品采用TSK3000色谱柱进行HPLC检测。检测结果如图3所示，纯度达到了98％。该纯化的样品在不添加任何蛋白保护剂的情况下，于4℃放置一个月，性质稳定(结果如图4所示)，表明本发明对部分连接序列的改造能够使得该蛋白结构稳定。

另取表达上述靶向免疫融合蛋白突变体VCI^125A和VCI^125S的工程细胞株重复上述过程，也能够纯化出性质相当的高纯度、高稳定性的蛋白。

实施例3靶向免疫融合蛋白及其突变体的活性检测

用实施例2制备获得的靶向免疫融合蛋白及其突变体进行活性检测。

根据文献(Stacy L.M.，F.Michael Y.，Senthil K.M.et al.A.Epidermal Growth FactorReceptor(HER1)Tyrosine Kinase Inhibitor ZD1839(Iressa)Inhibits HER2/neu(erbB2)-overexpressing Breast Cancer Cells in Vitro and in Vivo.Cancer Research.2001.Vol.61，8887-8895.)记载的流式细胞检测方法，测定纯化的VCI、VCI^125A和VCI^125S与HER2高表达的乳腺癌(SKBR-3)细胞的HER2受体结合能力的大小，由此测定针对HER2受体的靶向活性。结果如图5所示，所有融合蛋白及其突变体，均有高特异性的HER2受体靶向活性，表明该活性未受多个连接肽序列改变的影响。

根据文献(Hui Guan，Shu-Fang Jia，Zhichao Zhou.et al.Herceptin Down-RegulatesHER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression and Enhances Taxol-InducedCytotoxicity of Human Ewing’s Sarcoma Cells In vitro and In vivo.Clinical Cancer Research.2005.Vol.11，2008-2017.)记载的体外细胞增值抑制方法，首先用不同的细胞在96孔细胞培养板中培养，细胞增殖至细胞密度达到饱和密度的50％时，分别加入不同浓度的蛋白或其突变体共同培养，定时检测细胞生长状态，同时用MTT方法检测细胞凋亡情况，以便分析纯化的VCI、VCI^125A和VCI^125S的肿瘤细胞杀伤活性。重复多次试验，结果稳定，例如，VCI能以IC50为0.30-0.40mg/ml抑制SK-BR-3乳腺癌细胞，以IC50为0.50-0.65mg/ml抑制SK-OV-3卵巢癌细胞，以IC50为0.30-0.40mg/ml抑制Calu-3肺癌细胞，以IC50为0.30-0.45mg/ml抑制低分化BGC-823胃腺癌细胞；VCI^125A能以IC50为0.30-0.40mg/ml抑制SK-BR-3癌细胞，以IC50为0.40-0.50mg/ml抑制SK-OV-3癌细胞，以IC50为0.30-0.50mg/ml抑制Calu-3癌细胞，以IC50为0.35-0.45mg/ml抑制低分化BGC-823胃腺癌细胞；VCI^125S能以IC50为0.20-0.40mg/ml抑制SK-BR-3癌细胞，以IC50为0.40-0.60mg/ml抑制SK-OV-3癌细胞，以IC50为0.20-0.30mg/ml抑制Calu-3癌细胞，以IC50为0.25-0.40mg/ml抑制低分化BGC-823胃腺癌细胞。从结果可以看出，所有融合蛋白及其突变体对多种肿瘤细胞均有稳定高效的杀伤活性，表明本发明的构建方式能够构建出抗肿瘤药物载体。

Claims (10)

1.靶向免疫融合蛋白或其突变体的生产方法，其包括，构建选自pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR和pCI-VCI^125S-DHFR的真核表达载体，培养转染了该真核表达载体的真核细胞，然后纯化培养获得的上清液，其中纯化的过程包括进行阴离子交换层析、亲和层析、和分子筛层析。

2.权利要求1的生产方法，其中，

(a)pCI-VCI-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P2PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI-DHFR；

(b)pCI-VCI^125A-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2 PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2 PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4 PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P3 PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI^125A-DHFR；或者，

(c)pCI-VCI^125S-DHFR的构建过程包括，将用引物DHFR-P1和DHFR-P2 PCR扩增DHFR基因获得的产物插入质粒pCI-neo的StuI和BamHI酶切位点之间，得到载体pCI-DHFR；混合用引物V-P1和V-P2 PCR扩增抗HER2抗体重链可变区基因获得的产物与用引物V-P3和V-P4 PCR扩增抗HER2抗体轻链可变区基因获得的产物作为模板，用引物V-P1和V-P4进行PCR扩增，将获得的扩增产物插入载体pCI-DHFR的NheI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-V-DHFR；将用引物C-P1和C-P2 PCR扩增人抗体IgG1重链恒定区基因获得的产物插入载体pCI-V-DHFR的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到载体pCI-VC-DHFR；和，将用引物I-P1和I-P4 PCR扩增白介素2基因获得的产物插入载体pCI-VC-DHFR的XhoI和MluI酶切位点之间，得到载体pCI-VCI^125S-DHFR。

3.权利要求1的生产方法，其中靶向免疫融合蛋白或其突变体由选自SEQ ID NO：1-3之一所示的核酸序列编码。

4.权利要求1的生产方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最优选是CHO/dhfr-细胞株。

5.权利要求1的生产方法，其中培养是在28～35℃(优选是29～32℃，最优选是30℃)的条件下培养。

6.权利要求1的生产方法，其中纯化的过程依次包括将培养获得的上清液进行离心、过滤、透析、阴离子交换层析、亲和层析、任选的过滤、和分子筛层析。

7.权利要求1或6的生产方法，其中阴离子交换层析是DEAE Sepharose FF阴离子交换层析；亲和层析是MabSelect Sure亲和层析；和/或，分子筛层析是Superdex-200分子筛层析。

8.权利要求1-7之任一的生产方法生产出的靶向免疫融合蛋白或其突变体，优选所述靶向免疫融合蛋白或其突变体是二聚体。

9.权利要求8所述的靶向免疫融合蛋白或其突变体在制备用于靶向抗肿瘤的药物中的应用，优选用于靶向抗乳腺癌、卵巢癌、胃癌或肺癌。

10.中间体，或中间体在权利要求1-7之任一的生产方法中的应用，所述中间体选自：

(a)核酸，其序列如SEQ ID NO：1、2、或3所示；

(b)引物对，其为DHFR-P1和DHFR-P2，为V-P1和V-P2，为V-P3和V-P4，为V-P1和V-P4，为C-P1和C-P2，为I-P1和I-P2，为I-P1和I-P3，或为I-P1和I-P4；

(c)载体，其包含(a)所述的核酸，优选其为pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR；

(d)细胞，其为转染了载体pCI-VCI-DHFR、pCI-VCI^125A-DHFR或pCI-VCI^125S-DHFR的真核细胞，如哺乳动物细胞，优选是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，最优选是CHO/dhfr-细胞株；和

(e)细胞上清液，其为培养(d)所述的细胞所得的上清液。

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