CN102580067A - 酶和酶的活性部位特异性陪伴分子的组合 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了通过将蛋白质替代治疗与活性部位特异的陪伴分子(ASSC)相结合以提高所施用蛋白质的稳定性和功效而改进蛋白质替代治疗的方法。本发明进一步提供了包含纯化蛋白质和ASSC的组合物和施用该组合物的治疗方法。

Description

酶和酶的活性部位特异性陪伴分子的组合
本申请是中国专利申请200480005635.5的分案申请，原申请的申请日是2004年2月2日，发明名称是“酶和酶的活性部位特异性陪伴分子的组合”。
本申请要求2003年1月31日申请的美国临时申请系列号60/444,136的优先权，其公开与此全文引用作为参考。
发明领域
本申请提供了通过将活性部位特异陪伴分子(ASSC)与蛋白质替代治疗联合来提高所施用蛋白质稳定性和功效的改良的蛋白质替代疗法。本申请进一步提供了包含纯化蛋白质和ASSC的组合物。
发明背景
蛋白质缺乏病
蛋白质是在细胞内根据特定基因的基因组核苷酸序列通过转录、翻译和其它过程合成的。蛋白质缺乏病可以由编码基因的突变引起，该突变导致(i)蛋白质不能合成；(ii)缺乏生物学活性的蛋白质的合成；或(iii)包含正常或部分生物学活性、但不能够适当加工以达到蛋白质的天然区室的蛋白质的合成。源于遗传突变的蛋白质缺乏病也叫做遗传病。
除了源于遗传突变的蛋白质缺乏病外，一些蛋白质缺乏病可以由疾病或者疾病治疗(例如化学疗法)的副作用或者营养不量的后果引起。
当前疗法：蛋白质的缺乏会导致多种疾病，一些疾病是由突变的、错折叠的蛋白质引起的(构象疾病-下同)。用于治疗蛋白质缺乏病的一种当前疗法是蛋白质替代疗法，该方法一般涉及静脉内、皮下或肌内灌注纯化形式的相应野生型蛋白质，或者植入生物易蚀固体形式的蛋白质以便持续释放。由于所灌注的蛋白质会被迅速地降解，所以蛋白质替代疗法的一个主要的复杂因素是蛋白质治疗有效量的实现和维持。克服该问题的当前方法是多次高成本的高剂量灌注。
蛋白质替代疗法具有几个额外的限制，例如大规模产生、纯化和贮藏正确折叠蛋白质上的困难、得到糖基化的天然蛋白质上的困难、抗蛋白质免疫反应的产生以及在具有明显牵涉中枢神经系统的疾病中不能够穿过血-脑屏障。
使用包含编码功能蛋白质的核酸序列的重组载体的基因治疗，或者使用表达功能蛋白质的经遗传修饰的人细胞的基因治疗，也可以用来治疗蛋白质缺乏病和能从蛋白质替代中受益的其它疾病。虽然该方法有希望，但由于技术难题使该方法受到了限制，例如载体不能够感染或转导正在分裂的细胞、靶基因的低表达、以及基因一旦被递送后对表达的调节。
第三，治疗蛋白质缺乏病的相对较新的方法涉及到小分子抑制剂的使用以降低所缺乏酶蛋白质的天然底物，从而改善病理学。此种“底物剥夺”的方法已经在称作溶酶体贮积病或鞘糖脂贮积疾病的一类大约40种相关酶疾病中被具体地描述。这些可遗传疾病的特征是缺乏能够催化降解细胞内糖脂的溶酶体酶，导致脂类不正常积累，这打乱了细胞的功能。计划用于治疗的小分子抑制剂对于抑制参与糖脂合成的酶是特异的，该种抑制降低了需要由所缺乏酶降解的细胞内糖脂的量。该方法也受到了限制，因为糖脂对于生物学功能是必需的，并且过度的剥夺会引起副作用。具体而言，糖脂能够被脑用来从神经元的神经节苷脂传递信号到其它神经元。如果糖脂太少或太多，神经元传递信号的能力受到阻碍。
如下作为特异陪伴分子进行讨论的第四种方法使突变型蛋白质免受内质网内的降解。
蛋白质在内质网内的加工
蛋白质在细胞质内合成，并且新合成的蛋白质以很大程度未折叠的状态分泌进入内质网(ER)的腔内。通常，蛋白质折叠受自组装原则的控制。新合成的多肽根据它们的氨基酸序列折叠成它们的天然构象(Anfinsen等，Adv.Protein Chem.1975；29：205-300)。在体内，蛋白质折叠是复杂的，因为环境温度和高蛋白质浓度的结合会刺激聚集过程，在该过程中通常埋于疏水核心内的氨基酸会与它们相邻的氨基酸发生非特异的相互作用。为了避免出现这种问题，通常通过特定的一组称作分子侣伴的蛋白质促进蛋白质的折叠，分子侣伴阻止了初生多肽链的聚集并且能够结合到未折叠的蛋白质上以致于蛋白质以天然构象重折叠(Hartl，Nature 1996；381：571-580)。
分子侣伴实际上存在于所有类型的细胞和大部分细胞区室内。一些参与蛋白质的转运并且允许细胞在诸如热休克和葡萄糖饥饿的应激条件下存活(Gething等，Nature 1992；355：33-45；Caplan，Trends Cell.Biol.1999；9：262-268；Lin等，Mol.Biol.Cell.1993；4：109-1119；Bergeron等，TrendsBiochem.Sci.1994；19：124-128)。在分子侣伴中，Bip(免疫球蛋白重链结合蛋白，Grp78)是特征最清楚的ER的陪伴分子(Haas，Curr.Top.Microbiol.Immunol.1991；167：71-82)。像其它分子侣伴一样，Bip与ER内的许多分泌蛋白和膜蛋白在这些蛋白质的整个成熟过程中发生相互作用，虽然在折叠平稳进行过程中这种相互作用通常很弱并且是短寿命的。一旦完成天然蛋白质的构象，分子侣伴不再与蛋白质相互作用。结合到在折叠、装配或正确糖基化方面失败的蛋白质上后的Bip变得稳定，并且导致了蛋白质通过ER相关途径的降解。该过程作为ER内的“质量控制”系统起作用，保证了只有那些正确折叠和装配的蛋白质能够转运出ER用于进一步的成熟，并且错折叠的蛋白质滞留其中进行随后的降解(Hurtley等，Annu.Rev.Cell.Biol.1989；5：277-307)。
某些DNA突变导致氨基酸替代，这种替代进一步阻止并且在许多情况下排除突变型蛋白质的正确折叠。为了纠正这些错折叠，研究人员尝试了使用多种分子。已经表明在一些疾病中高浓度的甘油、二甲基亚砜(DMSO)、三甲胺-N-氧化物(TMAO)或者重水抑制降解途径并增加突变型蛋白质的细胞内转运(Brown等，Cell Stress Chaperones 1996；1：117-125；Burrows等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97：1796-801)。虽然其功能机制还不清楚，但是这些化合物被认为是能够促进一般蛋白质折叠的非特异的化学陪伴分子。虽然它们对于细胞内蛋白质折叠缺陷的生物化学检查是有用处的，但起功效时要求该类化合物的高剂量使得它们在临床上应用困难或不适宜用于临床。这些化合物还缺乏特异性。
特异的陪伴分子策略
先前的专利和公开描述了拯救内源性酶蛋白质特别是错折叠的溶酶体酶免受通过ER质量控制机制而降解的治疗策略。该策略使用对与特定溶酶体病相关的缺陷溶酶体酶特异的小分子可逆竞争性抑制剂。该策略如下：由于突变型酶蛋白质在ER内不正确折叠(Ishii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1996；220；812-815)，酶蛋白质被滞留于正常的转运途径(ER→高尔基体→内体→溶酶体)并且被快速地降解。因此，促进突变型蛋白质正确折叠的功能性化合物将作为针对突变型蛋白质的位点特异的陪伴分子而在促进从ER质量控制系统内顺利逃脱。由于已知酶的一些抑制剂占据酶的催化中心，导致了体外其构象的稳定。这些特异的陪伴分子可以称作活性部位特异陪伴分子(ASSC)。
在Fan等的美国专利号6,274,597，6,583,158，6,589,964和6,599,919和2002年11月26日申请的待决美国申请系列号10/304,396(此处完全引用作为参考)中已经专门阐述了参与溶酶体贮积病的酶的策略。例如，半乳糖的小分子衍生物，1-脱氧半乳糖野尻霉素(nojirimycin)(DGJ)，是一种突变型法布里(Fabry)酶α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)的有效的竞争性抑制剂，能够有效提高中性pH下突变型α-Gal A(R301Q)的体外稳定性并且增强从具有R301Q或者Q279E突变的法布里病人中建立的淋巴母细胞中突变型酶的活性。此外，过量表达突变型(R301Q)α-Gal A的转基因小鼠经口施用DGJ会在主要器官大量地提高酶活性(Fan等，NatureMed.1999；5：112-115)。对错折叠蛋白质的成功拯救取决于特异抑制剂在体内达到的浓度，该浓度低于酶的完全抑制浓度，相比之下底物剥夺方法中需要酶的抑制浓度。
除了溶酶体贮积病外，现在认为大量并且多种疾病也是由于采用非天然蛋白质构象所导致的构象疾病，这可能导致蛋白质在ER内滞留并最终导致蛋白质的降解(Kuznetsov等，N.Engl.J.Med.1998；339：1688-1695；Thomas等，Trends Biochem.Sci.1995；20：456-459；Bychkova等，FEBSLett.1995；359：6-8；Brooks，FEBS Lett.1997；409：115-120)。ASSC表现出拯救除了酶外的突变型蛋白质的表达。例如，发现小的合成化合物会稳定突变型形式的肿瘤抑制基因蛋白p53的DNA结合结构域，因此允许蛋白质维持活性构象(Foster等，Science 1999；286：2507-10)。已经表明通过小分子受体拮抗物和配体可以拯救受体的合成(Morello等，J.Clin.Invest.2000；105：887-95；Petaja-Repo等，EMBO J.2002；21：1628-37)。已经证明甚至通过使用通道阻断药物或底物对膜通道蛋白质和其它质膜转运蛋白进行药学拯救(Rajamani等，Circulation 2002；105：2830-5；Zhou等，J.Biol.Chem.1999；274：31123-26；Loo等，J.Biol.Chem 1997；272：709-12)。上述所有文献显示ASSC有能力特异地拯救包括但不限于酶、受体、膜通道蛋白质和DNA转录因子在内的突变型蛋白质。
除了突变型蛋白质以外，ASSC还表现出能够稳定野生型蛋白质，导致它们的产量和稳定性提高。如在一个实例中，已经证明特定ASSC即DGJ能够增加用编码野生型α-Gal A序列的载体转染的COS-7细胞内野生型α-Gal A的数量和活性。ASSC拯救过量表达的野生型酶，否则这些酶会滞留于ER质量控制系统，因为在COS-7细胞中所述酶的过量表达和过量产生超过了该系统的容量并且导致聚集和降解(见03年2月28日申请的美国申请系列号10/377,179)。
总之，当应用蛋白质替代治疗例如施用替代蛋白质治疗蛋白质缺乏病或其它疾病时，本领域需要提高生物学功效和成本效率的方法。
发明概述
本发明提供了增强纯化蛋白质稳定性的方法，该方法包括将于可药用载体中的蛋白质与活性部位特异陪伴分子相互接触。
纯化的蛋白质可以是重组蛋白质并且可以是保留活性的全长的或截短的蛋白质。
本发明还提供了通过将于可药用载体中的蛋白质与活性部位特异陪伴分子相互接触使得蛋白质在体外的贮存期限得到提高的方法。
可药用载体中的蛋白质可以是冷冻干燥的或者是水溶液。
本发明进一步提供了延长纯化蛋白质在用于可药用载体中的蛋白质施用的个体内的半衰期和体内活性的方法，该方法包括将蛋白质与于可药用载体中的活性部位特异陪伴分子相接触。
本发明提供了用于对患有需要进行蛋白质替代的疾病(例如蛋白质缺乏疾病)的个体进行治疗的方法，其包括对个体施用纯化的替代蛋白质和能够稳定替代蛋白质的活性部位特异陪伴分子(ASSC)。
在一个实施方案中，替代蛋白质是一种与构象疾病相关的蛋白质。
在一个优选地实施方案中，构象疾病是溶酶体贮积病。
在一个实施方案中，溶酶体贮积病是法布里病。
在另一个实施方案中，溶酶体贮积病是戈谢病。
本发明还提供了在蛋白质替代治疗的同时增强突变型内源性蛋白质的稳定性的方法，该蛋白质由于在ER内的缺陷性的折叠和加工而变得缺乏。随着所施用的对应于突变型蛋白质的替代蛋白质稳定性的增加，内源性蛋白质的稳定性和因此而来的活性增强了。
本发明进一步提供了通过将宿主细胞与包含针对蛋白质的ASSC的培养基相接触而增加由非哺乳动物宿主细胞产生的重组蛋白产量的方法。
本发明进一部提供了于可药用载体中的包含纯化蛋白质和针对纯化蛋白质的ASSC的组合物。
附图简述
图1表明使用部位特异陪伴分子1-脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ，1μM)的野生型和突变型α-Gal A稳定性分别提高，野生型α-Gal A是从用带有人野生型α-Gal A cDNA的重组杆状病毒感染的Sf-9细胞的培养基中纯化的，突变型α-Gal A是从过量表达人突变型(R301Q)α-Gal A的转基因小鼠的心脏匀浆液中收集的。实验前，将小鼠用作为饮用水的0.5mM DGJ处理一周。将突变型(A)和野生型(B)的酶在浓度为1μM(○)，0.1μM(●)，0.03μM(◆)或0μM(没有DGJ；◇)的DGJ存在的条件下，分别于37℃和42℃用0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH7.0)进行预培育，对于突变型酶为37℃对于野生型酶为42℃。酶活性报导为与未进行预培育的酶相比的相对值。DGJ可以作为稳定剂防止突变型和野生型酶的变性/降解。
发明详述
本发明通过将蛋白质与活性部位特异陪伴分子(ASSC)相接触有利地改进了用于治疗疾病或病症的蛋白质替代疗法的疗效。本发明的优点体现在(a)提高非哺乳动物细胞产生蛋白质的效率；(b)增加治疗蛋白质的稳定性，表现为更长的贮存期限和更好的体内半衰期和活性；(c)在体内转运包括跨细胞膜转运时维持蛋白质活性部位的结构；和(d)拯救内源性突变型蛋白质，该蛋白质在合成过程中发生错折叠并随后从内质网中清除掉。
本发明进一步提供了包含蛋白质和特异性稳定蛋白质的活性部位特异陪伴分子(ASSC)的制剂。
本发明是以这样的发现为基础的，即在遗传病和其它疾病的治疗中ASSC能够作为蛋白质替代疗法的联合治疗而使用。使用本领域已知的方法可以对ASSC进行筛选和鉴定。一旦鉴定出一种对特定疾病有用的ASSC，则可将ASSC施用于接受蛋白质替代治疗的病人，以增强替代蛋白质在恰当细胞区室中的吸收、提高循环中蛋白质的稳定性，以及根据需要提高在转运进入细胞期间的蛋白质的稳定性。在制造、贮存和体内使用过程中，陪伴分子可以稳定蛋白质的活性形式。
定义
在每个术语所使用的本发明上下文中和其所使用的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有本领域中其通常的含义。为了在描述本发明的组合物和方法以及怎样使用它们方面对医师提供额外的指导，一些术语在下面讨论，或者在说明书的其它地方讨论。
具体定义.术语“蛋白质替代”是指将非天然的、纯化的蛋白质导入患有该蛋白质缺乏病的个体中。所施用的蛋白质可以从天然来源得到(例如用于治疗RSV和单核细胞增多症的人丙种球蛋白)或者通过重组表达得到(如下面比较详细的描述)。该术语还指纯化蛋白质向个体的导入，此处所述的个体需要施用纯化蛋白质或者从纯化蛋白质的施用中受益，例如患有蛋白质缺乏的个体。所导入的蛋白质可以是纯化的、经体外产生的重组蛋白或者从诸如胎盘或动物乳汁的离体组织或液体中或者植物中纯化的蛋白质。
术语“通过蛋白质缺乏表征的疾病”指存在由蛋白质缺乏或数量不足导致的出现病理变化的任何疾病。该术语包含导致生物学失活蛋白质产物的蛋白质折叠疾病，即构象疾病。在传染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺问题、放射病、营养缺乏、中毒、或其它环境或外部创伤中可涉及到蛋白质不足。
术语“稳定正确构象”指化合物或肽或其它分子与在体外例如在制剂中和体内与野生型蛋白质或者能够行使野生型功能的突变型蛋白质结合从而使野生型或突变型蛋白质的结构可以维持其天然或正确形式的能力。这种作用通过(i)蛋白质贮存期限的提高；(ii)每单位量的蛋白质的较高的活性；或者(iii)体内效能更强中的一种或多种实践性地证明了。这通过表达时提高的从ER中的产量、对由于温度提高或离液剂的存在所导致对解折叠的较大抗性以及通过相似的方法实验性地观察到。
如此处所使用，术语“构象病”或“构象疾病”指采用的蛋白质构象所导致的疾病，其中所述的蛋白质构象不能被具有正常生物学活性的野生型蛋白质在天然条件下正常地形成，这种疾病会导致蛋白质在ER中滞留和破坏。降低的蛋白质水平导致生理性不平衡，其表现为一种疾病或病症。在一个具体的实施方案中，构象疾病是溶酶体贮积病。
如此处所使用，术语“活性部位”指蛋白质具有一些特异生物学活性的区域。例如，它可以是结合底物或其它结合配偶体(partner)的部位和贡献直接参与产生和打断化学键的氨基酸残基的部位。在本发明中活性部位可以包括酶的催化位点、抗体的抗原结合位点、受体的配体结合结构域、调节物的结合结构域或者分泌蛋白质的受体结合结构域。活性部位还可以包括反式激活、蛋白质-蛋白质相互作用、或转录因子和调节物的DNA结合结构域。
如此处所使用，术语“活性部位特异陪伴分子”指能够特异地与蛋白质活性部位可逆相互作用并且增强稳定分子构象形成的包括蛋白质、肽、核酸、糖类在内的任何分子。如此处所使用，“活性部位特异陪伴分子”不包括存在于细胞ER中的内源性普通陪伴分子如Bip、钙联接蛋白或钙网蛋白，或者通常的非特异化学陪伴分子如重水、DMSO或TMAO。
一般定义：如此处所使用术语“纯化的”指在降低或消除无关材料即污染物存在的条件下被分离的材料，其中所述无关材料包括最终所得材料之来源的天然材料。例如，纯化的蛋白质优选地基本上没有在细胞内能与其结合的其它蛋白质或核酸；纯化的核酸分子优选地基本上没有在细胞内的蛋白质或其它无关核酸分子。如此处所使用，术语“基本上没有”在材料的分析测试上下文中可以操作性地使用。优选地，基本上不含杂质的纯化的材料为至少95％的纯度；更加优选地，至少97％的纯度，并且更加优选地还可以至少99％的纯度。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物学鉴定和本领域已知的其它方法估计出来。在一个特定的实施方案中，纯化的意思是指污染物的水平低于施用于人或非人动物的规管局所接受的水平。
在优选的实施方案中，术语“大约”和“约”通常指根据测量的性质和精度而定的测量数量的可接受程度的误差。一般地，例证的误差程度在给定数值或数值范围的20％以内，优选地在10％以内，并且更加优选地在5％以内。备选地，并且尤其是在生物学系统中，术语“大约”和“约”可指给定数值的一个数量级内的数值，优选地在10倍或5倍以内，并且更加优选地在2倍以内。除非另外声明，当文中指出数字的量是近似的时，是指不进行表述性的陈述而引用的术语“大约”或“约”。
“基因”是编码功能性“基因产物”的核苷酸序列。通常，基因产物是功能性蛋白质。然而，基因产物还可以是细胞内其它类型的分子，例如RNA(例如tRNA或者rRNA)。为了本发明的目的，基因产物还指在细胞内可以发现的mRNA序列。
术语“表达”意思是指通过活化参与相应基因或DNA序列转录和翻译的细胞内功能而允许或导致基因或DNA序列中的信息变成表现形式，例如产生RNA(例如rRNA或mRNA)或蛋白质。DNA序列由细胞表达以形成诸如RNA(例如mRNA或rRNA)和蛋白质的“表达产物”。表达产物本身例如最终的RNA或蛋白质可以称作被细胞“表达的”。
术语“转染”意思是指将外源核酸导入细胞内。术语“转化”意思是指将“外来的”(即外部的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列导入宿主细胞以致于宿主细胞表达导入的基因或序列以产生目的物质，其中所述的目的物质在本发明中一般是指被所导入基因或序列编码的RNA，也可以是被所导入基因或序列编码的蛋白质或酶。所导入的基因或序列还可以称作“克隆的”或“外来的”基因或序列，可以包括调节或控制序列(例如被细胞的遗传机制所使用的起始、终止、启动子、信号、分泌或其它序列)。基因或序列可包括非功能性序列或未知功能序列。接受并表达所导入DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化了”并且是一个“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自于许多来源，包括与宿主细胞同一属或种的细胞或不同属或种的细胞。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意思是指运载体，通过该运载体将DNA或RNA序列(例如外来基因)导入宿主细胞从而转化宿主和促进所导入序列的表达(例如转录和翻译)。
术语“表达系统”意思是指在适宜条件下的宿主细胞和相容的载体，该适宜条件例如为了表达由载体携带的并已导入宿主细胞的外来DNA所编码的蛋白质。常用的表达系统包括大肠杆菌(E.coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞例如Sf9、Hi5或S2细胞和杆状病毒载体和表达系统、以及哺乳动物宿主细胞和载体。
术语“突变型”和“突变”意思是指遗传物质例如DNA中的任何可检测的变化或此种变化的任何过程、机制或结果。它包括基因结构(例如DNA序列)发生改变的基因突变、源于任何突变过程的基因或DNA、或由修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(如RNA、蛋白质或酶)。
如此处所使用术语“突变型蛋白质”是指从含有能导致蛋白质序列改变的遗传学突变的基因翻译而来的蛋白质。在一个特定的实施方案中，此种突变导致蛋白质在通常存在于ER内的条件下不能达到其天然构象的能力。在实现此种构象上的失败导致了蛋白质被降解，而不是通过蛋白质转运系统中它们的正常途径转运至它们在细胞内的正常位置。其它突变可以导致活性的降低或周转更快。
“野生型基因”指编码在体内具有正常生物学功能活性的蛋白质的核酸序列。野生型核酸序列可含有不同于已知公布的、能导致对生物学活性影响很小或没有的氨基酸替代的改变的、核苷酸的变化。术语野生型也可包括为了编码相对于内源或天然蛋白质能够提高或增强活性的蛋白质而经过改造的核酸序列。
“野生型蛋白质”指由野生型基因编码的蛋白质，当在体内表达或导入时该蛋白质具有功能性生物学活性。术语“正常的野生型活性”指蛋白质在细胞内的正常的生理功能。蛋白质的功能性可通过已知的用于确定蛋白质功能性的任何方法测试。
术语“经遗传修饰的”指在导入包含编码基因产物的编码序列和控制编码序列表达的调节元件的核酸之后，表达特定基因产物的细胞。核酸的导入可以通过包括基因寻靶和同源重组在内的本领域已知的方法来实现。如此处所使用，该术语还包括已经经过工程改造例如通过基因活化技术表达或过量表达内源性基因或基因产物的细胞，此处所述的基因和基因产物不能由该细胞正常表达。
短语“可药用”，不论其是否与本发明的药用组合物联合使用，指当施用于人时能够生理性耐受的并且一般不产生不利反应的分子和组合物。优选地，如此处所使用，术语“可药用”意思是指联邦政府或州政府规管局认可的或者美国药典或其它用于动物的并且更加具体地用于人的一般公认的药典中列出的。术语“载体”指化合物与其一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药用运载体可以是无菌液体例如水和油。水或水溶液、盐溶液和水溶右旋糖和甘油溶液优选用作载体，特别是用于可注射溶液。适当的药用运载体在E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”，第18版中进行了描述。
术语“治疗有效量”和“有效量”指足以导致治疗反应的化合物的量。在ASSC和蛋白质以复合物形式施用的实施方案中，术语“治疗有效量”和“有效量”指足以导致治疗反应的复合物的量。治疗反应可以是使用者(例如临床医生)所识别的作为对治疗有效反应的任何反应。因此，治疗反应通常是疾病或病症的一种或多种症状的缓解。
值得注意，为了本发明的目的，由于当体内施用时ASSC的稀释(和随后的由于平衡的变化导致的结合转换)、生物利用率和代谢，在纯化的治疗蛋白质的体外产生、运输或贮存过程中呈抑制性效应的ASSC浓度也可构成“有效量”。
通过蛋白质缺乏所表征的疾病
当前有大约1100种已知的遗传性疾病是以蛋白质缺乏或在特定的组织中丧失功能为特征的。理论上这些疾病可以通过蛋白质替代治疗来治疗。本发明的方法着眼于对当前适用于蛋白质替代治疗的蛋白质的共治疗(co-therapy)，该蛋白质替代治疗可以是现在可得的或者在将来是可得的。在此种疾病中，个体的一些细胞或所有细胞缺乏足够功能的蛋白质、包含失活形式的蛋白质或者包含对于生物学功能而言不足够的水平。
更进一步，被鉴定为由能够导致蛋白质缺乏的蛋白质折叠改变的突变和突变型蛋白质在ER滞留所产生的构象性失调的疾病名单正在增加。它们包括囊性纤维化、α1-抗胰蛋白酶缺乏、家族性高胆固醇血症、法布里病、阿尔茨海默氏病(Selkoe，Annu.Rev.Neurosci.1994；17：489-517)、成骨不全(Chessler等，J.Biol.Chem.1993；268：18226-18233)、糖类缺乏的糖蛋白综合症(Marquardt等，Eur.J.Cell.Biol.1995；66：268-273)、马-兰综合症(Bradford等，Biochem.J.1999；341：193-201)、遗传性盲(Kaushal等，Biochemistry 1994；33：6121-8)、格兰茨曼血小板无力症(Kato等，Blood 1992；79：3212-8)、遗传性凝血因子VII缺乏病(Arbini等，Blood1996；87：5085-94)、眼皮肤白化病(Halaban等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97：5889-94)和蛋白质C缺乏病(Katsumi等，Blood 1996；87：4164-75)。最近，在X-连锁的疾病肾上腺脑白质营养不良(ALD)中一个突变导致缺陷的过氧化物酶体转运蛋白的错折叠，它可以通过低温培养受影响细胞来进行拯救(Walter等，Am.J.Hum.Genet.2001；69：35-48)。一般公认的是突变在基因的整个序列中均匀发生。因此，可以预测来源于所缺乏蛋白质的错折叠的表型会存在于许多其它遗传病中。
溶酶体贮积病
许多遗传性蛋白质缺乏病是酶的缺乏。如上面所指出，一大类遗传性酶的疾病涉及到溶酶体酶的突变并且称作溶酶体贮积病(LSD)。溶酶体贮积病是一组由鞘糖脂、糖原、粘多糖积累导致的疾病。溶酶体疾病的例子包括但不限于戈谢病(Beutler等，The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease，第8版，2001；Scriver等著，3635-3668页，McGraw-Hill，New York)、GM1神经节苷脂病(相同，3775-3810页)、岩藻糖苷贮积症(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，1995.Scriver，C.R.，Baudet，A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.著，2529-2561页，McGraw-Hill，New York)、粘多糖贮积病(相同，3421-3452页)、庞皮病(相同，3389-3420页)、胡-沙综合症(Hurler-Scheie disease)(Weismann等，Science 1970；169，72-74)、尼曼病A和B(The Metabolic and Molecular Bases of InheritedDisease，第8版，2001.Scriver等著，3589-3610页，McGraw-Hill，New York)和法布里病(相同，3733-3774页)。LSD和它们相关的缺乏酶的名单可以从下面的表1中找到。在下面具体讨论了2种疾病。
法布里病
法布里病是由溶酶体α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性缺乏所引起的鞘糖脂代谢的X-连锁的先天性障碍(Desnick等，The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease，第8版，Scriver等著，3733-3774页，McGraw-Hill，New York 2001；Brady等，N.Engl.J.Med.1967；276，1163-1167)。这种酶的缺陷导致具有α-半乳糖残基的中性鞘糖脂主要是神经酰胺己三糖苷(GL-3)在体液和组织的溶酶体中进行性沉积。发病率估计在男性中为大约1∶40,000，并且在全世界范围内的不同人种群中均有报道。在典型的发病男性中，临床表现形式包括血管角皮瘤、肢端感觉异常、少汗症、以及特征性角膜和晶状体浑浊(The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease，第8版，2001，Scriver等著，3733-3774页，McGraw-Hill，New York)。发病男性的预期寿命缩短了，并且由于心脏、脑和/或肾脏的血管性疾病导致通常在第4个或第5个十年内出现死亡。与此相比，患有温和的“心脏变异”的患者具有正常α-Gal A酶活性的5-15％，并且存在左心室肥大和心肌症。当没有这种心脏变异的人严重发病时而这种心脏变异患者基本上仍没有症状。最近发现在带有不可解释的左心室肥大心肌症的成年男性患者中有11％的人存在心脏变异，这表明法布里病的发病频率比先前估计的要高(Nakao等，N.Engl.J.Med.1995；333，288-293)。α-Gal A基因位于Xq22(Bishop等，Am.J.Hum.Genet.1985；37：A144)并且已经报道了编码α-Gal A的全长cDNA和完整的12-kb基因组序列(Calhoun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985；82；7364-7368；Bishop等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986；83：4859-4863；Tsuji等，Eur.J.Biochem.1987；165；275-280；和Kornreich等，NucleicAcids Res.1989；17：3301-3302)。对导致法布里病的突变的遗传异质性已经进行了标记(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，第8版，2001，Scriver等著，3733-3774页，McGraw-Hill，New York.；Eng等，Am.J.Hum.Genet.1993；53：1186-1197；Eng等，Mol.Med.1997；3：174-182；和Davies等，Eur.J.Hum.Genet.1996；4：219-224)。到目前为止，除了小的缺失和插入和较大的基因重排外，多种错义、无义和剪接突变也已经进行了报道。
戈谢病
戈谢病是能够破坏脂肪葡糖脑苷脂的溶酶体酶β-葡糖脑苷脂酶的缺乏病。于是脂肪主要在肝脏、脾脏和骨髓中积累。戈谢病能够导致痛、疲劳、黄疸、骨损伤、贫血甚至死亡。戈谢病有三种临床表型。具有在生命的早期或早期成年人出现的I型的患者由于贫血、低血小板数量、肝脏和脾脏的增大、骨骼的弱化和一些情况下的肺脏和肾的损伤，容易碰伤和出现疲劳。没有涉及脑的征兆。在II型中，早期发作，在3个月时出现肝脏和脾脏增大并且广泛涉及到脑。在2岁前的死亡率很高。III型的特征是肝脏和脾脏增大并且脑抽搐。β-葡糖脑苷脂酶基因定位于人1q21染色体。其蛋白质前体包含536个氨基酸并且其成熟的蛋白质长度是497个氨基酸。
虽然来源于任何人种群的个体都可能患此病，但是认为在来源于东欧的犹太人(德系犹太人(Ashkenazi))的后代中戈谢病更加普遍。在德系犹太人的群体中，戈谢病是最常见的遗传病，发病率大约1/450。在一般大众中，大约在100,000人中有一个戈谢病患者。根据国家高雪氏基金(NationalGaucher Foundation)，2,500个美国人患有戈谢病。
其它酶缺乏疾病
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏病是最常见的X-连锁的人类酶缺乏病。G6PD酶催化对于核糖的产生是必要的氧化还原反应，而核糖是DNA和RNA的主要成分。G6PD还参与维持细胞内NADPH的足够水平。在许多生物合成反应中NADPH是所需要的辅因子。带有该种缺乏病的个体的临床症状包括新生儿黄疸、腹痛和/或背痛、眩晕、头痛、呼吸困难(不规则呼吸)和心悸。
除了遗传病外，其它的酶缺乏病可以由来源于原发和继发疾病的组织或器官损伤引起。例如，由酒精中毒引起的损伤的胰腺组织或胰腺炎导致缺乏消化中需要的胰酶。当前，胰腺炎可以用酶替代治疗来进行治疗。
表1：溶酶体贮积病，与之相关的缺陷酶，以及小分子活性部位特异陪伴分子
Figure BDA0000135620860000161
Figure BDA0000135620860000171
表1(续)
Figure BDA0000135620860000172
Figure BDA0000135620860000181
用蛋白质替代治疗的其它疾病
除了由蛋白质缺乏所表征的疾病外，一些疾病可以通过使用替代蛋白质以增强或刺激生物学过程来进行治疗。例如对患有贫血症的个体施用重组红细胞生成素(
Figure BDA0000135620860000182
)以刺激产生红细胞和增加向组织运输氧。此外，可以施用重组干扰素如干扰素α2b(INTRON
Figure BDA0000135620860000183
PEG-
Figure BDA0000135620860000184
或者
Figure BDA0000135620860000185
)和干扰素β1a(
Figure BDA0000135620860000186
)分别用来治疗乙型肝炎和多发性硬化症。还可以施用的其它蛋白质有重组人DNA酶I(rhDNase-
Figure BDA0000135620860000187
)，该酶是用于改善患有囊性纤维化患者肺功能的选择性断裂DNA的酶；研发的用于在已经进行了几乎全部或全部甲状腺切除术并且因此而必须接受甲状腺激素的甲状腺癌患者中使用的重组促甲状腺激素(
Figure BDA0000135620860000188
)；用于治疗由于化学疗法导致的嗜中性白血球减少症的重组G-CSF(
Figure BDA0000135620860000189
)和患有胰腺炎个体中的消化酶。蛋白质治疗的另一个重要领域是用高度特异的、活性位点较明确的抗体治疗传染性疾病和癌症。抗体治疗产品包括用于治疗呼吸道合胞病毒的
Figure BDA00001356208600001810
用于治疗乳腺癌的
Figure BDA00001356208600001811
用于治疗关节炎和炎性疾病的
Figure BDA00001356208600001812
和
Figure BDA00001356208600001813
及其它。针对抗体的ASSC是众所周知的，可以采用靶抗原或者结构相关的类似物(例如，活性靶抗原的修饰形式或者模拟物)。当前投放市场的或者正处于临床试验评价的作为蛋白质治疗有用的蛋白质的名单见下面的表2。
表2：在相关疾病中施用的替代蛋白质
Figure BDA00001356208600001814
Figure BDA0000135620860000201
表2(续)
Figure BDA0000135620860000202
Figure BDA0000135620860000211
蛋白质缺乏症和其它疾病的治疗
如上简述，研发了基因治疗、蛋白质替代治疗和小分子抑制剂治疗作为治疗策略以治疗源于蛋白质缺乏的遗传病和从替代蛋白质施用中受益的疾病。
蛋白质替代治疗通过使用灌注手段，外源性导入野生型或生物学功能性蛋白质以增加蛋白质的量。此种治疗已经研发用于多种遗传病包括如上面所提到的戈谢病和法布里病。从重组细胞表达系统(例如哺乳动物细胞或昆虫细胞-见Desnick等的美国专利号5,580,757；Selden等的美国专利号6,395,884和6,458,574；Calhoun等的美国专利号6,461,609；Miyamura等的美国专利号6,210,666；Selden等的美国专利号6,083,725；Rasmussen等的美国专利号6,451,600；Rasmussen等的美国专利号5,236,838和Ginns等的美国专利号5,879,680)中纯化了野生型酶。灌注后，预期外源性酶可通过非特异或者受体特异的机制被组织吸收。通常，吸收效率不高，并且外源蛋白质的循环时间短(Ioannu等，Am.J.Hum.Genet.2001；68：14-25)。此外，外源性蛋白质是不稳定的并且容易在细胞内快速降解。
除了蛋白质替代和基因治疗外，已经描述了使用酶抑制剂的小分子治疗来治疗LSD，即小分子抑制剂对于上面提到的缺乏酶前体的底物剥夺是有用的。已经描述小分子抑制剂可以用于治疗包括法布里病、戈谢病、庞皮病、泰-萨病、桑德霍夫病、GM2神经节苷脂沉积症的LSD(见Platt等的美国专利号5,472,969，5,580,884，5,798,366和5,801,185)。
使用ASSC和蛋白质替代的共治疗
本发明通过共施用针对蛋白质的ASSC来增强体外制剂或组合物中和体内的纯化蛋白质的稳定性，从而增强了蛋白质替代治疗的效果。使用本领域常规的方法可以筛选针对靶蛋白质的适当的ASSC，所述的方法例如在2003年2月28日申请的美国专利申请系列号10/377,179中所述，此处引用作为参考。
替代蛋白质的产生
使用本发明的方法能够治疗的疾病包括但不限于LSD、葡糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、遗传性肺气肿、家族性高胆固醇血症、家族性肥厚型心肌病、苯丙酮尿症、贫血症、乙型肝炎和多发性硬化。
使用本领域常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术可以分离和纯化对于本发明方法有用的替代蛋白质。例如使用如文献所述的重组DNA表达可以分离编码替代蛋白质的核酸。见，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(文中为“Sambrook等，1989”)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I和II卷(D.N.Glover著，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait著，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.EHiggins著，1985)；Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins著，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney著，1986)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，1986)；B.EPerbal，A Practical Guide To MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等著，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley和Sons，Inc.(1994)。编码蛋白质的核酸可以是全长的也可以是截短的，只要基因能够编码具有生物学活性的蛋白质即可。例如在Miyamura等的美国专利号6,210,666中所描述的具有生物学活性的截短形式的α-Gal A，该酶是法布里病相关缺陷酶。
将经鉴定并分离的编码靶蛋白质的基因插入到恰当的克隆载体中。可以使用本领域众多的载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或者经修饰的病毒，但是载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。载体的例子包括但不限于大肠杆菌、诸如λ衍生物的噬菌体、诸如pBR322衍生物或者pUC质粒衍生物例如pGEX载体、pmal-c、pFLAG等的质粒。例如通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体上实现对克隆载体的插入。然而，如果用于使DNA片段化的互补限制性酶切位点不存在于克隆载体上时，可以对DNA分子末端进行酶性修饰。备选地，通过将核酸序列(接头)连接到DNA末端可以产生目的位点，这些连接上去的接头可以含有编码限制性内切核酸酶识别序列的特异的化学合成寡核苷酸。通过遗传操作例如包括在N端加上利于分泌的信号肽和加上含有多聚腺苷酸位点的3′非转录序列可以将重组蛋白的产量最大化。
在一个优选的实施方案中，用于转导宿主细胞的构建体是病毒来源的载体，包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、辛德比斯病毒和痘苗病毒。
通过转化、转染、感染、电穿孔等等方法可以将重组分子导入宿主细胞以产生多拷贝的基因序列。优选地，所克隆基因包含于穿梭载体质粒上，所述的质粒用于在诸如大肠杆菌的克隆细胞中进行扩增和方便的纯化，以便于当希望插入到恰当表达细胞系中时可以在随后插入到恰当表达细胞系中。
有效的宿主-载体系统包括但不限于用病毒感染的哺乳动物细胞系统(例如痘苗病毒、腺病毒等等)；用病毒感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒)；诸如含有酵母载体的酵母微生物；或者用噬菌体、DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌。载体表达元件的强度和特异性是可变的。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用许多适宜的转录和翻译元件中的任何一种。不同的宿主细胞具有特色的和特异的蛋白质翻译和翻译后加工和修饰(例如糖基化、剪切[例如信号肽的剪切])机制。为了保证对表达的外来蛋白质进行目的修饰和加工例如糖基化、唾液酸化和磷酸化，可以选择恰当的细胞系或者宿主系统。例如，在细菌中进行表达可以用于生产非糖基化的核心蛋白质产物。然而，在细菌中表达的蛋白质可能是非正确折叠的。在酵母中进行表达可以产生糖基化的产物。在真核细胞中进行表达提高了异源蛋白质的“天然”糖基化和折叠的可能性。然而，在哺乳动物细胞中进行表达提供了一种用于重构或者构建蛋白质的工具。此外，不同的载体/宿主表达系统不同程度地影响加工反应例如蛋白酶剪切。通过使用如美国专利号6,274,597所述的特异的陪伴分子和上述公开的相关家族成员可以提高表达效率。
使用本领域已知的方法例如硫酸铵沉淀、含有疏水相互作用树脂、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和层析聚焦树脂的柱层析，可以实现对重组表达蛋白质地纯化。备选地，使用能够与蛋白质或者与重组蛋白融合的标签特异结合的恰当多克隆或单克隆抗体的免疫亲和层析可以对重组蛋白进行纯化。在一个优选的实施方案中，用于本发明方法的重组蛋白的纯度至少为95％，优选地为97％并且最优选地大于98％。
替代蛋白质的施用
可以采用多种方法实现细胞摄取和靶向替代蛋白质。已经鉴定出能够介导膜转运并且因此而提供多肽向细胞质递送的肽序列。例如，可从触角足(Antennapedia)同源域螺旋3获得此种肽以产生膜转运运载体，例如细胞膜穿透肽(penetratin)(PCT公开WO 00/29427；也见Fischer等，J.Pept.Res.2000；55：163-72；DeRossi等，Trends in Cell Biol.1998；8：84-7；Brugidou等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1995；214：685-93)，从单纯疱疹病毒来源的VP22蛋白质(Phelan等，Nat.Biotechnol.1998；16：440-3)和HIV TAT转录激活子。蛋白质转导结构域包括触角足结构域和HIVTAT结构域(见Vives等，J.Biol.Chem.1997；272：16010-17)具有特征性的正电荷，这导致研发出能够用于转移治疗蛋白质和DNA进入细胞的阳离子12-mer肽(Mi等，Mol.Therapy 2000；2：339-47)。上面提到的蛋白质转导结构域通过化学共价交联共价连接到靶蛋白质上或者作为融合蛋白质而产生。更进一步，Active MotifInc.(Carlsbad，CA)新近研发出了非共价的、人工合成的蛋白质转导结构域。所述的结构域通过疏水相互作用与靶蛋白质进行结合，并且一旦蛋白质进入细胞则该结构域从蛋白质上方便地解离下来(Morris等，Nat.Biotechnol.2001；19：1173-6)。此外，最近研究表明脂类运载体除了具有递送裸DNA的确定用途之外还可以递送蛋白质进入细胞(Zelphati等，J.Biol.Chem.2001；276：35103-10)。蛋白质转运技术综述见Bonetta，The Scientist 2002；16(7)：38。
在一个具体的实施方案中，用于本发明方法的替代蛋白质是与溶酶体贮积病相关的酶(见表1)。编码野生型的此种酶的核酸序列可以在文献或者诸如GenBank的公开数据库中找到，例如对于α-Gal A(AGA)为X14448，对于人葡糖脑苷脂酶(GCB)为J03059，对于人α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)为M74715，对于人酸性α-葡糖苷酶(GAA)为M34424，对于人艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)为AF011889和对于人酸性鞘磷脂酶(ASM)为M59916。
在LSD中的酶替代：当前，在欧洲和美国可以得到针对LSD的几种替代酶。替代酶包括用于治疗戈谢病的葡糖脑苷脂酶的重组形式α半乳糖苷酶A重组形式的
Figure BDA0000135620860000252
用于治疗MPS1的重组酶AldurazymeTM(以上所有均可从Genzyme Corp.得到)以及用于治疗庞皮病病人的重组α葡糖苷酶(Van den Hout等，Lancet 2000；56：397-8)。
活性部位特异的陪伴分子
本发明所考虑的ASSC包括但不限于小分子(例如，分子量小于约2kD，更加优选地小于约1kD的有机或无机分子)，包括底物或结合配偶体模拟物、小的配体衍生肽或其模拟物、诸如DNA、RNA的核酸、包括Fv和单链抗体的抗体和Fab片段、大分子(例如分子量大于约2kD的分子)和来自于诸如D-和/或L-构型氨基酸分子库的组合化学来源的库的成员、磷酸肽诸如随机或部分简并的定向磷酸肽库中的成员(见，例如Songyang等，Cell 1993，72：767-778)。
合成库(Needels等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90：10700-4；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90：10922-10926；Lam等，PCT公开号WO 92/00252；Kocis等，PCT公开号WO 94/28028)提供了本发明有效ASSC的来源。合成化合物库可以商业性地从MaybridgeChemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，NJ)、Brandon Associates(Merrimack，NH)和Microsource(New Milord，CT)得到。稀有化学品库可以从Aldrich(Milwaukee，WI)得到。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库是可得的或者是易于生产的，例如可以从Pan Laboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)得到。此外，天然和人工合成产生的库和化合物可以通过Res.1986；155：119-29容易地进行修饰。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的ASSC是溶酶体酶的抑制剂并且包括葡萄糖和半乳糖的亚氨基糖衍生物，所述的葡萄糖和半乳糖的亚氨基糖衍生物描述于Asano等，J.Med.Chem 1994；37：3701-06；Dale等，Biochemistry 1985；24：3530-39；Goldman等，J.Nat.Prod.1996；59：1137-42；Legler等，Carbohydrate Res.1986；155：119-29。此类衍生物包括但不限于表1中所列出的那些化合物。这些化合物中的一些可以从商业来源例如Toronto Research Chemicals，Inc.(North York，On.Canada)和Sigma买到。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的ASSC是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的激活剂(CFTR)，它包括描述于Dormer等，J.Cell Sci.2001；114：4073-81和Ma等，J.Biol.Chem.2002；277：37235-41的苯并(c)喹啉
Figure BDA0000135620860000261
化合物。
在另一个优选的实施方案中，用于本发明的ASSC是诸如δ阿片样物质受体、V2血管升压素受体和感光色素受体的G蛋白偶联受体的配体，在Petaja-Repo等，EMBO J 2002；21：1628-37；Morello等，J.Clin.Invest.2000；105：887-95；Saliba等，J.Cell Sci.2002；115：2907-18中对它们进行了描述。
在另一个优选的实施方案中，用于本发明的ASSC是如描述于Foster等，Science 1999；286：2507-10；Friedler等，PNAS 2002；99：937-42中的能够稳定p53DNA结合结构域的化合物。
在另一个优选的实施方案中，用于本发明的ASSC是离子通道蛋白如人Long QT综合症的HERG钾离子通道、家族性胰岛素分泌过多症中胰ATP敏感的钾离子(KATP)通道的阻断剂，在Zhou等，J Biol.Chem.1999；274：31123-26；Taschenberger等，J.Biol.Chem.2002；277：17139-46中对它们进行了描述。
制剂
在一个实施方案中，ASSC和替代蛋白质是作为单一组合物来配制的。此种组合物提高了贮存过程中和体内施用过程中蛋白质的稳定性，从而提高了治疗效率。制剂优选地适用于肠胃外施用包括皮下静脉和腹膜内施用，然而也考虑了适用于其它给药途经如口服、鼻内施用或者经皮肤施用的制剂。
在另一个实施方案中，替代蛋白质和ASSC是以分开的组合物来配制的。在该实施方案中，陪伴分子和替代蛋白质可以以相同的路线例如静脉灌注或者以不同的路线例如对于替代蛋白质使用静脉灌注而对于ASSC使用经口的施用而进行施用。
适于注射使用的药物制剂包括无菌水溶液(其为水溶性的)或者分散液和用于临时配制无菌注射溶液或者分散液的无菌粉末。在所有情况下，制剂形式必须是无菌的并且必须是以能够轻易吸到注射器的程度存在的流体。在制造和贮存的条件下它必须是稳定的并且防止诸如细菌和真菌微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、它们的适宜混合物和植物油的溶剂或者分散介质。例如通过使用诸如卵磷脂的被膜、在分散液的情况下通过维持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、山梨酸等等可以阻止微生物的作用。在许多情况下，它优选地包括等渗试剂例如糖或者氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现对注射组合物的延长吸收。
通过将纯化的蛋白质和ASSC以需要的量掺入到具有多种上面列举的其它成分(如果需要的话)的恰当溶剂中，然后通过过滤除菌或者终末灭菌来制备无菌注射溶液。通常，分散液是通过将多种无菌的活性成分掺入到含有基本分散基质和上面列举的所需要的其它成分的无菌媒介物中来制备的。至于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，通过所述的技术可以生产出活性成分以及来源于先前过滤除菌溶液中的任何额外需要成分的粉末。
制剂优选地含有赋形剂。制剂中包含的可药用赋形剂是诸如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液以及碳酸氢盐缓冲液的缓冲液、氨基酸、尿素、乙醇、抗坏血酸、磷脂；诸如血清白蛋白、胶原和明胶的蛋白质；诸如EDTA或者EGTA和氯化钠的盐；脂质体；聚乙稀吡咯烷酮；诸如葡聚糖、甘露醇、山梨醇的糖和甘油；丙二醇和聚乙二醇(例如PEG-4000，PEG-6000)；甘油；甘氨酸或者其它氨基酸；和脂。适用于制剂的缓冲系统包括柠檬酸盐、醋酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐缓冲液。在一个优选的实施方案中是磷酸盐缓冲液。
制剂优选地还含有非离子去污剂。优选的非离子去污剂包括聚山梨酸酯(Polysorbate)20、聚山梨酸酯80、Triton X-100、Triton X-114、NonidetP-40、辛基-α-葡糖苷、辛基-β-葡糖苷、Brij 35、Pluronic和吐温20。
对于蛋白质和陪伴分子制剂的冷冻干燥，蛋白质浓度可以为0.1-10mg/mL。可以将诸如甘氨酸、甘露醇、白蛋白和葡聚糖的填充剂加到冷冻干燥的混合物中。此外，可以向冷冻干燥的混合物中加入诸如二糖、氨基酸和PEG的可能的抗冻剂。还可以添加上面列出的任何一种缓冲液、赋形剂和去污剂。
对于吸入施用的制剂可以包含乳糖或其它赋形剂，或者是含有聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘氨胆酸盐或者脱氧胆酸盐(deoxycocholate)的水溶液。优选的吸入气雾剂特征为具有小质量密度和大尺寸的颗粒。具有小于0.4克/立方厘米的质量密度和平均直径超过5μm的颗粒可以有效的递送所吸入治疗物进入全身循环。此种颗粒可以深吸入肺并且逃脱肺的天然清除机制直到所吸入的颗粒完成对其治疗负载的递送(Edwards等，Science1997；276：1868-1872)。本发明的替代蛋白质制剂可以以气雾化的形式施用，例如可以通过如美国专利号5,654,007，5,780,014和5,814,607(此处引用作为参考)中描述的制备和配制的方法。鼻内施用的制剂可以包括以滴鼻剂形式施用的油溶液或者能够在鼻内使用的凝胶。
用于皮肤表面局部施用的制剂可以通过用皮肤可接受的载体例如洗液、乳剂、软膏或者肥皂将组合物分散来制备。特别有用的是能够在皮肤上形成薄膜或者薄层以致于能够局部使用并防止去除的载体。对于体内组织表面的局部施用，可以将组合物分散在液体组织粘附剂或者已知能够增强组织表面吸收的其它物质中。备选地，可以使用组织包被溶液例如含有胶质的制剂。
在优选的实施方案中，本发明的制剂是以装在装置中的液体或者粉末制剂的形式提供的，所述的装置能够以预先设定剂量方便地施用制剂；此类装置的例子包括用于皮下或者肌肉注射的无针注射器和计量气雾递送装置。在另一种情况下，制剂是以适于持续释放的形式提供的，例如对于经皮肤施用的在皮肤上使用的胶布或者敷裹，或者对于经粘膜施用的易蚀装置。在如ASSC的制剂以片剂或者胶囊形式经口施用的情况下，制剂是以具有可去除的盖的瓶子或者blister patches提供的。
体外稳定性：保证可药用制剂在其贮存期限内的稳定性是一个主要的挑战。在研发可药用蛋白质之前，必须要探究和指出活性成分的内在或者潜在不稳定性。蛋白质和肽治疗剂的不稳定性可以分为化学不稳定性或者物理不稳定性。化学不稳定性的例子有水解、氧化和脱酰胺作用。物理不稳定性的例子有聚集、沉淀和表面吸附。此外，蛋白质可能遭受到诸如pH、温度、剪切应力、冻/融应力和这些应力的组合。
一种最普遍的制剂问题是产物的聚集，产物聚集导致生物活性的损失。添加赋形剂会减慢这一过程但不能够完全阻止。通过物理分析可能检测出也可能检测不出活性的损失并且只有在使用大的变异系数(有时15-20％)的生物测定中或者效价测定中才会检测到活性的明显损失，这使得很难确定实际的损失。
已经表明ASSC能够通过阻止酶的降解和酶蛋白质的聚集来增强酶的活性(Fan等，Nat.Med.1999；5：112-5；图1)。在ASSC和替代蛋白质存在于同一组合物的实施方案中，所配制的本发明组合物是以适于保持无菌的更重要的是在正确运送和贮存过程中保护替代蛋白质活性的容器中提供的。
除了在体内稳定所施用的蛋白质外，ASSC在体外可逆地结合并稳定替代蛋白质的构象，因此阻止了聚集和降解并延长了制剂的贮存期限。使用本领域众所周知的技术例如差示扫描测热法或者圆二色性可以估价ASSC/替代蛋白质的相互作用。
例如在组合物的水溶可注射制剂以适于使用针头和注射器抽取内容物的有塞的玻璃瓶提供时，ASSC的存在抑制了替代蛋白质的聚集。玻璃瓶可以是单次使用或者多次使用。制剂也可以作为预填充的注射器来提供。在另一个实施方案中，制剂是干燥的或者冻干的状态，其需要用标准的或者提供的生理稀释剂重新配制成液体状态。在该情况下，ASSC的存在会在重新配制过程中或配制后能够稳定替代蛋白质以阻止聚集。在制剂为静脉施用液体的实施方案中，ASSC的存在具有同样的好处，所述的液体存在于例如连接到静脉施用线或导管的无菌袋中。
除了稳定欲施用的替代蛋白质外，ASSC的存在可以使药物制剂储存于大约7.0-7.5的中性pH条件下。这对于在正常情况下必须储存于较低pH下才能保持稳定性的蛋白质是有利的。例如表1中列出的那些溶酶体酶在低pH(例如5.0或者更低)时保持稳定的构象。然而，替代蛋白质在低pH条件下长期贮存会加速酶和/或制剂的降解。
分开的制剂：当替代酶和ASSC在分开的制剂中时，ASSC可以是适于任何施用路线的形式，包括上面描述的所有形式例如作为无菌水溶液或者干的冻干粉末，所述的粉末是在重新配制过程中或者重新配制后立即加入到的替代蛋白质制剂中的以防止在使用前出现体外聚集。备选地，可以将ASSC配制成适于经口施用的片剂或者胶囊的形式，该形式是通过常规方法使用药用赋形剂例如结合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或者羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或者磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或者硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或者羧甲基淀粉钠)或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)制备的。使用本领域众所周知的方法可以将片剂进行包封。用于经口施用的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或者悬浮液的形式或者将其制成干燥的产品在使用前用水或者其它适当的媒介物进行配制。此类液体制剂可以通过常规方法使用可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或者氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或者阿拉伯胶)；非水溶性媒介物(例如杏仁油、油酯、乙醇或者分馏的植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或者丙酯或者山梨酸)来制备。制剂还可以根据需要包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂或者甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制成能够控制活性化合物释放的形式。
施用
施用路线可以是经口施用或者肠胃外施用，包括静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼内、肌内、口腔内、直肠内、阴道内、眼眶内、大脑内、牙内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、肺内、鼻内、跨粘膜、经皮施用或者通过吸入施用。
上述肠胃外制剂的施用可以是周期性注射制剂，或者通过从外部(如静脉注射袋)或内部(如生物易蚀植入物、生物人工器官或者能够产生替代蛋白质的植入细胞团)贮器进行静脉内或者腹膜内施用。见例如美国专利号4,407,957和5,798,113，此处引用作为参考。肺内递送方法和器械描述于例如美国专利号5,654,007、5,780,014和5,814,607，此处引用作为参考。其它有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入灌注系统、泵递送、胶囊包封细胞递送、脂质体递送、针递送注射、无针注射、喷雾器、烟雾器、电穿孔和经皮胶布。无针注射器装置描述于美国专利号5,879,327、5,520,639、5,846,233和5,704,911，其说明书在文中引用作为参考。上述的任何一种制剂均可在这些方法中进行施用。
遵循自我施用进行替代蛋白质和/或ASSC的皮肤注射是有好处的，同时与静脉内施用相比导致血浆半衰期延长了。此外，如此处所讨论的为方便患者而设计的多种器械例如可填充注射笔(injection pen)和无针注射设备可以用于本发明的制剂。
时限：当替代蛋白质和ASSC存在于分开的制剂中时施用可以同时进行，或者在替代蛋白质施用之前或者之后施用ASSC。例如在静脉施用替代蛋白质时，可以在0-6小时的阶段之后施用ASSC。备选地，可以在蛋白质施用之前0-6小时施用陪伴分子。
在一个优选的实施方案中，ASSC和替代蛋白质是分别施用并且由于ASSC具有短的循环半衰期(例如小分子)，因此为了维持循环中的恒定水平要连续经口施用ASSC例如每日。此种恒定水平将会是这样一种水平，即经过确定的在施用时间内对患者无毒并且具有最佳的与靶替代蛋白质的相互作用以呈现出非抑制的治疗效应水平。
在另一个实施方案中，在替代蛋白质周转所需要的时间阶段内施用ASSC(通过ASSC的施用延长了替代蛋白质的周转)。
不管时限如何，施用必须是在蛋白质和ASSC浓度必须是陪伴分子能够稳定但不阻止或抑制体内蛋白质活性的浓度条件下的施用。这也应用于替代蛋白质和ASSC在同一制剂中进行施用的情况。
体内稳定性：如上所述对于体外制剂，针对替代蛋白质的ASSC的存在将有利于延长血浆半衰期，从而将替代蛋白质有效水平维持更长的一段时间，这导致临床受累组织和替代蛋白质接触的增加和因此而来的组织对蛋白质吸收的增加。这给病人带来诸如更好地缓解病痛、降低施用次数和/或降低施用剂量的有利效果。这还降低了治疗费用。
除了稳定野生型替代蛋白质以外，ASSC还可以稳定和增强内源突变蛋白质的表达，所述的突变蛋白质是由于能够阻止在ER中进行正确折叠的突变所造成的，例如在诸如LSD的构象疾病中。
剂量
能够有效稳定所施用蛋白质和内源突变蛋白质的ASSC的量可以通过本领域技术人员在个案基础上根据蛋白质和相应的ASSC进行确定。可以通过使用本领域已知的常规方法得到药物代谢动力学和药效动力学如半衰期(t1/2)、血浆浓度峰值(cmax)、达到血浆浓度峰值的时间(tmax)、替代蛋白质和ASSC的通过曲线下面积(AUC)测量的接触和组织分布、还有对于ASSC-取代蛋白质结合的数据(亲和常数、结合常数和解离常数和效价)以确定能够稳定替代蛋白质而不具有抑制活性并因而呈现出治疗效应的所要求的适合的量。
从细胞培养测定和动物研究得到的数据可以用于阐明用于人和非人动物的治疗剂量范围。本发明治疗方法中使用的化合物的剂量优选地在包括ED50浓度(受试群体的50％有效)但有少许毒性或没有毒性的循环浓度的范围内。在所有治疗中所使用的具体剂量会在该范围内有所变化，其变化取决于诸如采用的具体剂型、采用的施用途径、个体(例如病人)的状况等因素。
治疗有效量可以从细胞培养测定最初估计并且在动物模型中进行公式计算以便得到包括IC50在内的循环浓度范围。化合物的IC50浓度是实现症状的半数最大抑制的浓度(例如，像从细胞培养测定中确定的那样)。然后使用此种信息可以更精确地确定在具体个体例如人类患者中使用的合适剂量。
通过诸如高效液相层析(HPLC)和气相层析的技术可以常规测定诸如病人的个体内血浆中的化合物。
通过标准的药学方法，例如细胞培养测定或使用实验动物以确定LD50和ED50，从而可以确定组合物的毒性和治疗效果。参数LD50和ED50在本领域是熟知的，并且分别指对群体的50％是致死的和对群体的50％是治疗上有效的化合物的剂量。毒性和疗效的剂量比称为治疗指数并且可以表达为LD50/ED50比率。表现为较大治疗指数的ASSC是优选的。
根据当前方法，替代蛋白质的浓度为0.05-5.0mg/kg体重，一般每周或每两周施用一次。可以施用的蛋白质剂量从0.1μg/kg到大约10mg/kg，优选地从大约0.1mg/kg到大约2mg/kg。例如对于法布里病的治疗，所施用的重组α-Gal A的剂量一般为0.1-0.3mg/kg并且每周或每两周施用一次。在病人的生命过程中需要定期多次剂量的蛋白质。皮下注射维持较长时期的与药物的全身接触。皮下的剂量优选地为每两周或者每周0.1-5.0mgα-Gal A/kg体重。也可以静脉内施用α-Gal A，例如大丸剂静脉注射、缓慢按压静脉注射或者通过连续静脉注射。连续IV次灌注(例如在2-6小时期间)可维持血液内的特定水平。
ASSC的最佳浓度可以根据能够稳定组织或循环中体内重组蛋白但不阻止其活性、组织或循环中ASSC的生物利用率和ASSC在组织或循环中代谢所需要的量来决定。例如在ASSC是酶的抑制剂时，可以通过计算针对酶的特异陪伴分子的IC50值来确定抑制剂的浓度。考虑到化合物的生物利用率和代谢，基于对酶活性的影响来估计IC50值左右或者比IC50值稍高的浓度，例如增加所施用酶的酶活性的量或延长所施用酶的酶活性所需要的抑制剂的量。作为实例，用于α-Gal A酶的化合物脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)的IC50值是0.04μM，表明DGJ是一种有效的抑制剂。因此，可以预计细胞内α-Gal A的浓度比所施用的α-Gal A低很多。见下面的实施例。
实施例
通过下面的实施例对本发明进行进一步的描述。此种实施例的使用只是例证性的并且无论如何也不能限制本发明或者例证性术语的范围和意义。同样，本发明不限于任何此处描述的特别优选地实施方案。的确，在阅读本说明书后本领域的技术人员显然可对本发明进行许多改变和变化，并且可以在不偏离其精神和范围的情况下进行。因此本发明仅由后附的权利要求书和权利要求书所赋予的等同物的全部范围进行限制。
实施例1：ASSC对α-Gal A的体外稳定性
方法：从用携带人野生型α-Gal A cDNA的重组杆状病毒感染的Sf-9细胞的培养液中纯化了野生型α-Gal A，并且通过过量表达人突变型(R301Q)α-Gal A的转基因小鼠的心脏匀浆物中收集到突变型α-Gal A。在实验前，用作为饮用水的0.5mM DGJ处理小鼠一周。将突变型和野生型酶在1μM、0.1μM、0.03μM DGJ存在的条件下或者在DGJ不存在的条件下，在0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中进行预孵育，对于突变型酶在37℃，对于野生型酶在42℃孵育。将野生型和突变型(R301Q)α-Gal A在DGJ缺乏或者存在(多种浓度)条件下孵育一段时间，并且在用5倍体积的0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)将混合物稀释后，用4-MU-a-Gal A作为底物对剩余的酶活性进行测定。酶活性报导为没有进行预孵育的酶的相对值。
结果：如图1所示，在没有与DGJ孵育的条件下，在37℃孵育20分钟后的突变型酶在中性pH时是不稳定的(图1A)。在没有与DGJ孵育的条件下，在42℃孵育后的野生型酶在中性pH时也有明显的酶活性丧失(图1B)。浓度为1μM的DGJ能够促进两个酶的稳定性，即在60分钟之后反应混合物中仍保留有超过80％的酶活性。这表明ASSC(GDJ)可以作为稳定剂来防止突变型和野生型酶的变性/降解。
实施例2：用ASSC胞内增加野生型α-Gal A
方法：根据以前的参考文献(Osada等，Biochem Biophys Res Commun.1993；142：100-6)，将从用重组杆状病毒转染的昆虫细胞或者重组的CHO细胞中纯化的人野生型α-Gal A偶联到α-2-巨球蛋白(α-2-M)上。由于来源于咖啡豆的α-Gal和α-2-M偶联后能够被培养的来源于法布里病半合子的成纤维细胞进行内化，所以预计将α-Gal A与α-2-M进行偶联也可以被细胞内化。备选地，可以把野生型α-Gal A加入到来源于没有剩余酶活性的法布里病病人的皮肤成纤维细胞的培养液中，所述的来源于法布里病病人的皮肤成纤维细胞描述于如Blom等，Am J Hum Gen.2003；72：23-31。
结果：如以前所述(Osada等，Biochem Biophys Res Commun.1987；143：954-8)咖啡豆α-Gal的半衰期大约为2小时。可以预计α-Gal A-α-2-M偶联物或者加入到培养液中的α-Gal A的半衰期通过在培养液中加入DGJ而延长了，因为已经表明DGJ能够有效地稳定体外的酶(图1)。这表明DGJ能够延长外源α-Gal A被细胞进行细胞内摄取。
实施例3：对于用替代酶灌注治疗的法布里病小鼠共施用DGJ
如上所述，Genzyme Corporation已经研发出对于法布里病的酶替代治疗。可以预计对用替代酶灌注治疗的法布里病敲除(KO)小鼠共施用DGJ能够提高替代酶的体内稳定性例如半衰期，因为ASSC DGJ能够稳定酶并且防止降解。根据以前描述的方法(Ioannu等，Am J Hum Genet.2001；68：14-25)，在灌注野生型的α-Gal A后对小鼠经口施用DGJ。在一段时间内测定了包括心脏、肾、脾、肝和肺的多种组织中以及血清中的α-Gal A活性，并将其与没有接受DGJ的对照小鼠和只接受DGJ但没有接受酶的小鼠的活性进行比较。较长的保持时间表明共施用ASSC能够提高酶替代治疗的疗效。
本发明不限于此处描述的具体实施方案的范围。的确，除了此处所描述的那些，从前面的描述和随图来看，本发明的多种改变对于本领域技术人员是显而易见的。此种改变处于后附的权利要求书的范围之内。
专利、专利申请、公开、操作程序等等在整个本申请中被引用，此处公开全部引用作为参考。

Claims (9)

1.施用于人的药物组合物，其在可药用载体中包含纯化的α-葡糖苷酶和针对α-葡糖苷酶的活性部位特异性陪伴分子，其中所述活性部位特异性陪伴分子是1-脱氧野尻霉素。
2.权利要求1所述的组合物，其中将α-葡糖苷酶、可药用载体和1-脱氧野尻霉素配制成冷冻干燥的粉末或无菌水溶液。
3.体外提高纯化的α-葡糖苷酶的稳定性的方法，其中纯化的α-葡糖苷酶用于施用于人，所述方法包括将可药用载体中的α-葡糖苷酶和有效量针对该α-葡糖苷酶的活性部位特异性陪伴分子相接触，其中所述活性部位特异性陪伴分子是1-脱氧野尻霉素。
4.权利要求3的方法，其中存在活性部位特异性陪伴分子时所述α-葡糖苷酶的体外贮存期限延长。
5.活性部位特异性陪伴分子的用途，用于制备改善疾病治疗的药物，其中所述疾病通过酶替代而治疗，活性部位特异性陪伴分子特异性结合替代酶，且其中所述酶是α-葡糖苷酶，并且其中所述活性部位特异性陪伴分子是1-脱氧野尻霉素。
6.权利要求5的用途，其还包含在药物的制备中使用纯化的野生型α-葡糖苷酶。
7.权利要求6的用途，其中活性部位特异性陪伴分子延长α-葡糖苷酶在个体体内的半衰期和活性。
8.权利要求5的用途，其中疾病是庞皮病。
9.提高非哺乳动物宿主细胞产生重组α-葡糖苷酶的方法，其中宿主细胞包含含有编码重组α-葡糖苷酶的核酸序列的表达载体，其中α-葡糖苷酶不是以无生物学活性构象错折叠的突变α-葡糖苷酶，所述方法包括将宿主细胞培养于包含1-脱氧野尻霉素的培养基中。
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