CN102575279B - 咸味调节物质的筛选方法 - Google Patents

咸味调节物质的筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102575279B
CN102575279B CN201080045012.6A CN201080045012A CN102575279B CN 102575279 B CN102575279 B CN 102575279B CN 201080045012 A CN201080045012 A CN 201080045012A CN 102575279 B CN102575279 B CN 102575279B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
albumen
taste
mentioned
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201080045012.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102575279A (zh
Inventor
石渡裕
开裕子
前川誉实
江藤让
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of CN102575279A publication Critical patent/CN102575279A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102575279B publication Critical patent/CN102575279B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

通过使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较，来筛选咸味替代化合物、或者增强或抑制咸味感受的化合物等咸味调节物质。

Description

咸味调节物质的筛选方法
技术领域
本发明涉及筛选含有替代咸味或修饰咸味的物质的咸味调节物质的方法。咸味替代或咸味调节物质在食品领域等中是有用的。
背景技术
味觉对于检测食品中的营养成分或有害成分是重要的。哺乳动物的味觉感受经由存在于口腔内的味蕾中所含的味觉受体细胞来实现。所感受的信号从味觉受体细胞向进入味蕾中的味神经传递，再传递至中枢。通常，哺乳动物的味觉分为五种基本味质。即甜味、苦味、酸味、咸味和鲜味(umami)，将它们称作五种基本味道。
近年来随着研究的进展，这五种基本味道所对应的受体日益清楚(非专利文献1、2)。新型味觉受体的鉴定和分离使味觉感受的新的调节方法成为可能。例如，通过使用味觉受体进行高亲和性激动剂或拮抗剂的探索，可以进行味觉调节物质的筛选。这种味觉调节物质能够带来各种消费品的味质的改善或改良。
作为五种基本味道之一的咸味，其参与钠离子或其他无机阳离子的检测，对于保持体内的内环境稳定至关重要。在咸味的感受通路中，认为存在受利尿剂阿米洛利(amiloride)抑制的阿米洛利敏感性通路和不受阿米洛利影响的阿米洛利非敏感性通路(非专利文献3)。参与两种咸味感受通路的分子存在于味蕾内的味觉受体细胞中并发挥作用(非专利文献2)。
认为阿米洛利敏感性通路是由上皮性钠通道(ENaC)介导的。ENaC由4种亚基α、β、γ、δ构成，以包含α、β和γ、或δ、β和γ的组合的异源多聚体(hetero-multimer)的形式发挥作用(非专利文献13)。但是，虽然在啮齿类动物中观察到咸味感受明显被阿米洛利抑制，但是只在一部分人中观察到这种抑制，暗示在人咸味感受机制中存在不同的受体。如上所述，关于咸味感受机制包括受体在内尚未清楚的部分颇多。
从食品中摄取过剩的盐分被认为是高血压或循环系统疾病的要因之一，包括日本在内，全世界都在开展限制盐分摄取量的行动(国际保健机构、非专利文献4)。
一直都存在着减少盐分摄取量的传统技术，例如使用氯化钾作为氯化钠的替代品的低盐调味品和低盐食品，但氯化钾存在着具有苦味和刺激味的问题。因此，使用氯化钾的食物的味道明显差。为了改善这种缺陷，有人开发了：一种调味品组合物，其中除氯化钾以外，还以特定比例混合氯化铵、乳酸钙、L-天冬氨酸钠、L-谷氨酸盐和/或核酸类呈味物质(专利文献1)；包含抗坏血酸的低钠咸味调味品(专利文献2)；以及使用卡拉胶的苦味抑制方法(专利文献3)等。但是，减盐技术尚未达到以下水平，即去除咸味以外的不愉快的味道、同时提供与氯化钠同等程度的咸味强度。
并且，有使用即使减少氯化钠也不会损及咸味强度的咸味增强物质的减盐方法。例如已知碱性氨基酸、特别是L-精氨酸具有增强咸味的效果(非专利文献5、6)。作为应用该知识的技术，有人开发了L-精氨酸、L-天冬氨酸和氯化钠的组合(专利文献4)，使用碱性氨基酸和枸橼酸的中和盐的呈味改良剂(专利文献5)等。但从减盐效果、风味、咸味强度等角度考虑，尚未开发出任何的可以充分补偿氯化钠的不足的技术。
另一方面，Kv3家族作为钾通道家族而已知，该钾通道家族原来被认为在进行高频率刺激的神经细胞中发挥作用，当细胞的膜电位去极化至-20mV以上时释放钾离子，显示出外向电流(非专利文献7)。但是，对于这些，只知道其作为电位依赖性钾通道的作用(非专利文献8～11)，关于其在静止膜电位(约-60mV～-80mV)附近根据细胞外钠浓度作为阳离子通道的作用则完全不知。
至于与味觉的关系，报道了：在从大鼠菌状乳头分离的味觉细胞中，通过PCR法确认了Kv3.1和Kv3.2的基因表达(非专利文献12)。然而，关于在该味觉细胞中的作用则完全不知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-187841号公报
专利文献2：日本特开平1-281054号公报
专利文献3：日本特开平4-262758号公报
专利文献4：美国专利第5145707号说明书
专利文献5：日本特开2003-0144088公报
非专利文献
非专利文献1：Chandrashekar，J.等人，Nature，444：288～294(2006)
非专利文献2：Bachmanov，A.A.等人，Ann.Rev.Nutr，27：387～412(2007)
非专利文献3：DeSimone，J.A.等人，Am.J.Physiol.Regulatory IntegrativeComp.Physiol.，249：52～61(1985)
非专利文献4：Reducing salt intake in populations-Report a WHO Forumand Technical Meeting，[online]，[2009年9月20日检索]，互联网URL：http://www.who.int/dietphysicalactivity/reducingsalt/en/
非专利文献5：Riha，W.等人，Chem.Senses，22：778(1997)
非专利文献6：Estrella，N.L.等人，Chem.Senses，34：A117-8(2009)
非专利文献7：Rudy，B.等人，Trends in Neuroscience，24：517～526(2001)
非专利文献8：Gutman，G.A.等人，Pharmacological Reviews 57：473～508(2005)
非专利文献9：McCormack，T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：5227～5231(1990)
非专利文献10：HERNANDEZ-PINEDA，R.等人、J.Neurophysiol.82：1512～1528(1999)
非专利文献11：Madeja，M.等人，Neuropharmacology 39：202～210(2000)
非专利文献12：Liu，L.等人，Am.J.Physiol.Cell Physiol.289：868～880(2005)
非专利文献13：Stahler，F.等人，Chemosensory Perception 1：78～90(2008)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于：鉴定咸味受体蛋白和编码该蛋白的基因，提供用于探索增强或抑制咸味感受的化合物或咸味替代物质的筛选系统。
解决课题的方法
本发明的发明人设想：若在使用咸味受体或调节该受体的分子时，可以有效率地探索、鉴定增强或抑制咸味感受的化合物或咸味替代物质，则进而可以开发不改变呈味的有效的减盐方法，其结果，可以制造维持呈味不变的含盐浓度低的食品。而且，进行了深入研究，结果成功地鉴定了参与咸味感受的分子，从而完成了本发明。
本发明如下。
(1)咸味调节物质的筛选方法，该方法包括下述步骤：使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较。
(2)(1)所述的方法，其中，通过在钠离子存在下测定上述细胞的细胞膜电流，来测定上述阳离子的流入量。
(3)(1)所述的方法，其中，通过在钠离子非存在下测定上述细胞的细胞膜电流，来测定上述阳离子的流入量。
(4)上述(1)或(2)所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味增强物质或咸味抑制物质。
(5)上述(1)或(3)所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味替代物质。
(6)上述方法，其中，Kv3.2蛋白具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：40、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
(7)上述方法，其中，Kv3.2蛋白与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：40、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的序列显示至少78％以上的序列同一性，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。
(8)上述方法，其中，Kv3.2蛋白具有包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47、SEQID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的氨基酸序列，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。
(9)上述方法，其中Kv3.2蛋白由下述(a)或(b)所示的DNA编码：
(a)DNA，其中具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52的核苷酸序列；
(b)DNA，其能够在严格的条件下和与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或可由上述核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白。
(10)上述方法，其中，Kv3.2蛋白为：选自来自人、小鼠、大鼠、爪蟾属的蛙、狗、马、黑猩猩、恒河猴、鸡、负鼠、猪或牛的Kv3.2蛋白同系物，以及它们的突变体、它们的片段和它们的嵌合蛋白。
(11)上述方法，其中，上述细胞为以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的卵母细胞。
(12)上述方法，其中，上述细胞表达从选自味觉细胞、舌上皮、肾上腺、松果体、甲状腺、黑素细胞和肾脏的组织中分离的Kv3.2基因。
(13)Kv3.2蛋白变体，该变体为下述(a)～(c)中任一项所示的蛋白：
(a)蛋白，其中具有SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的序列；
(b)蛋白，该蛋白与SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的序列显示至少78％以上的序列同一性，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道；
(c)蛋白，其具有包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的SEQID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的氨基酸序列，并且能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。
(14)DNA，其编码Kv3.2蛋白变体，该DNA是下述(a)或(b)所示的DNA：
(a)DNA，其具有SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52的核苷酸序列；
(b)DNA，其能够在严格的条件下和与SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52的核苷酸序列互补的核苷酸序列、或可上述核苷酸序列制备的探针进行杂交，并且编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白。
(15)探索具有正向或负向调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白的方法，该方法包括：鉴定在Kv3.2基因表达细胞中表达的基因中的显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因、或在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因。
(16)通过鉴定与Kv3.2蛋白或表达该蛋白的细胞作用的化合物来探索咸味调节物质的方法。
(17)探索呈味物质或风味物质的方法，该方法包括：鉴定与由Kv3.2蛋白和在味觉细胞中特异性表达的蛋白构成的通道或复合体作用的化合物。
(18)分离的卵母细胞或味觉细胞，其中以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸。
发明效果
根据本发明鉴定的咸味受体蛋白构成在味觉细胞中表达的咸味受体离子通道。激活该受体的物质作为咸味调节物质、即咸味替代物、咸味增强剂或咸味抑制剂的候选物质是有效的。另外，若使用在细胞表面表达上述受体的细胞，则可以提供咸味替代物、咸味增强剂或咸味抑制剂的简便的筛选系统。
另外，包含咸味替代物质或咸味增强物质的食品对抑制过剩的盐分摄取有效，从而对高血压或循环系统疾病的预防有效。
附图说明
图1显示表明小鼠的各种组织中的Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4基因表达的RT-PCR结果(电泳照片)。泳道1：舌尖部分(包括菌状乳头)、泳道2：轮廓乳头区、泳道3：舌两侧部分(包括叶状乳头)、泳道4：不含味蕾的舌上皮、泳道5：无逆转录酶、泳道6：肾脏。
图2显示当细胞外钠离子浓度发生变化时所观察到的表达Kv3.2蛋白(人)的非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜电流的变化。KCNC2显示Kv3.2cRNA的注入。
图3显示当细胞外钠离子浓度由0mM变为96mM时所观察到的表达Kv3蛋白(人)的非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜电流之差。
图4显示表明小鼠舌上皮中的Kv3.2基因的表达位点的原位杂交结果(显微镜照片)。
图5显示所观察到的表达与低分子有机化合物A接触的Kv3.2蛋白(人)的卵母细胞的细胞膜电流。KCNC2显示Kv3.2cRNA的注入。
图6显示当细胞外钠离子浓度发生变化时所观察到的表达Kv3.2蛋白(非洲爪蟾)的非洲爪蟾卵母细胞的细胞膜电流。XlKv3.2显示非洲爪蟾的Kv3.2cRNA的注入。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本发明的发明人在含有味蕾的小鼠舌上皮组织中确认到编码属于Kv3家族的离子通道Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4(Rudy等人，Trends in Neuroscience，24：517～526(2001))的基因的表达，所述离子通道是原来被认为在进行高频率刺激的神经细胞中发挥作用，当细胞的膜电位去极化至-20mV以上时显示出电流的钾通道；还发现人Kv3.2基因在非洲爪蟾卵母细胞中的表达能够以细胞膜电流随着细胞外钠离子浓度变化而变化的形式参与咸味感受。基于该发现，发现Kv3.2发挥咸味受体离子通道的作用，可用于筛选新的咸味调节物质。另外，他们确认Kv3.2基因在味蕾中表达，在咸味响应灵敏度不同的两种小鼠中发现了Kv3.2基因存在着相应于灵敏度的表达量之差，进一步确认Kv3.2为咸味受体。另外，本发明的发明人新发现了味蕾中的Kv3.2蛋白的剪接变体。
本发明的方法包括下述步骤：使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较。
Kv3.2蛋白是构成作为Kv3家族的一员的钾通道的蛋白，由本发明的发明人首次发现了：Kv3.2蛋白具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性。Kv3.2蛋白是由Kcnc2基因(也记作KCNC2)编码的多肽。
在本发明中，Kv3.2蛋白的例子包括：具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的氨基酸序列的蛋白。
作为编码人Kv3.2蛋白的多核苷酸，有4种核苷酸序列注册在基因数据库(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/或Ensembl project，http://www.ensembl.org/index.html，NM_139136，NM_139137，NM_153748，AY243473)中。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核苷酸序列相当于上述各核苷酸序列。由各核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。这些各氨基酸序列除C末端区外具有共通的序列(相当于SEQ ID NO：2的1～538位的部分)，认为它们是剪接变体。
另外，在同样的数据库中，有1种编码小鼠Kv3.2蛋白的多核苷酸被注册(NM_001025581，SEQ ID NO：9)。由SEQ ID NO：9的核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：10。另外，作为编码大鼠Kv3.2蛋白的多核苷酸，有4种核苷酸序列注册(NM_139216，NM_139217，ENSRNOT00000049943，X62839)。这些核苷酸序列见SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17。由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：12、SEQID NO：14、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18。这些氨基酸序列除C末端区外也具有共通的序列(相当于SEQ ID NO：12的1～593位的部分)，认为它们是剪接变体。
另外，如后述实施例所示，非洲爪蟾的Kv3.2蛋白基因被分离出来，显示该蛋白具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性。该基因的核苷酸序列见SEQ IDNO：39，由该基因编码的Kv3.2蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：40。
并且，如后述实施例所示，从包含味蕾的小鼠舌上皮组织中分离出4种小鼠Kv3.2基因的剪接变体。这些剪接变体的核苷酸序列见SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52。由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列分别见SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：53。SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQID NO：51和SEQ ID NO：53的氨基酸序列除C末端区外具有共通的序列(相当于SEQ ID NO：10的1～597位的部分)。
本发明的方法中使用的Kv3.2蛋白还包含种间同系物，例如除了上述的具有来自人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的序列的蛋白外，还可以是来自狗、马、黑猩猩、鸡、负鼠、猪或牛的Kv3.2蛋白。编码这些蛋白的基因的序列信息分别以下述编号注册，即，狗：XM_538289、马：XM_001488185、黑猩猩：XR_020952、鸡：XM_001235254、负鼠：XM_001363374、XM_001363455、猪：XM_001926426、XM_001924780、以及牛：XM_590276。另外，关于恒河猴、变色龙蜥蜴、绒猴、豚鼠、懒猴、犰狳、长鼻袋鼠、小马岛猬、刺猬、三刺鱼、大猩猩、大象、沙袋鼠、狐猴、小蝙蝠、鼠兔、兔、婴猴、红毛猩猩、蹄兔、果蝠、鼩鼱、松鼠、斑马雀、横纹东方鲀、眼镜猴、树鼩、以及海豚，编码它们的Kv3.2蛋白的基因的序列信息分别以下述编号注册，即，恒河猴：ENSMMUG00000012362、变色龙蜥蜴：ENSACAG00000007691、绒猴：ENSCJAG00000001261、豚鼠：ENSCPOG00000003474、懒猴：ENSCHOG00000007167、犰狳：ENSDNOG00000013383、长鼻袋鼠：ENSDORG00000000056、小马岛猬：ENSETEG00000010484、刺猬：ENSEEUG00000002220、三刺鱼：ENSGACG00000019441、大猩猩：ENSGGOG00000003896、大象：ENSLAFG00000031982、沙袋鼠：ENSMEUG00000007789、狐猴：ENSMICG00000017734、小蝙蝠：ENSMLUG00000010813、鼠兔：ENSOPRG00000017272、兔：ENSOCUG00000004467、婴猴：ENSOGAG00000000768、红毛猩猩：ENSPPYG00000004780、蹄兔：ENSPCAG00000015808、果蝠：ENSPVAG00000010964、鼩鼱：ENSSARG00000006415、松鼠：ENSSTOG00000004842、斑马雀：ENSTGUG00000007354、横纹东方鲀：ENSTRUG00000003532、眼镜猴：ENSTSYG00000010689、树鼩：ENSTBEG00000001105、以及海豚：ENSTTRG00000013226。
编码Kv3.2的基因并不限于具有上述基因信息的基因或具有公知序列的基因，只要由所选择的基因编码的Kv3.2蛋白能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道，这些基因的同系物或人工修饰体等具有保守突变的基因也可使用。即，可以是编码下述蛋白的基因：具有在1个或多个位置包含1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的公知蛋白的氨基酸序列的蛋白等。所述Kv3.2蛋白“能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道”是指，当表达该蛋白的细胞与钠离子接触时，具有增加由于阳离子向细胞内流入所产生的细胞膜电位的活性。阳离子的例子包括：钠离子、钙离子、镁离子、锂离子、铵离子等，优选为钠离子。
这里，尽管“1个或多个”氨基酸残基的数目是指根据氨基酸残基在蛋白的立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而不同，但具体可以优选1～20个、更优选1～10个、进一步优选1～5个、特别优选1～3个。保守突变的代表性突变为保守取代。作为保守取代，当取代位点为芳族氨基酸时，是指Phe、Trp和Tyr间互相取代的突变；当取代位点为疏水性氨基酸时，是指Leu、Ile和Val间互相取代的突变；当为极性氨基酸时，是指Gln和Asn间互相取代的突变；当为碱性氨基酸时，是指Lys、Arg和His间互相取代的突变；当为酸性氨基酸时，是指Asp和Glu间互相取代的突变；当为具有羟基的氨基酸时，是指Ser和Thr间互相取代的突变。被看作保守取代的取代具体包括：由Ala取代成Ser或Thr；由Arg取代成Gln、His或Lys；由Asn取代成Glu、Gln、Lys、His或Asp；由Asp取代成Asn、Glu或Gln；由Cys取代成Ser或Ala；由Gln取代成Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg；由Glu取代成Gly、Asn、Gln、Lys或Asp；由Gly取代成Pro；由His取代成Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr；由Ile取代成Leu、Met、Val或Phe；由Leu取代成Ile、Met、Val或Phe；由Lys取代成Asn、Glu、Gln、His或Arg；由Met取代成Ile、Leu、Val或Phe；由Phe取代成Trp、Tyr、Met、Ile或Leu；由Ser取代成Thr或Ala；由Thr取代成Ser或Ala；由Trp取代成Phe或Tyr；由Tyr取代成His、Phe或Trp；以及由Val取代成Met、Ile或Leu。上述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还可以是由于基因所来源的微生物的个体差异或种的不同等天然发生的突变或变异的结果(突变体或变体)。这样的基因例如可以通过位点特异性诱变法修饰公知的基因的核苷酸序列使所编码的蛋白的特定位点的氨基酸残基包括氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加而获得。
并且，上述的具有保守突变的基因可以是编码下述蛋白的基因：相对于所编码的氨基酸序列整体具有78％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选97％以上、特别优选99％以上的同源性，并且与野生型Kv3.2蛋白具有同等功能的蛋白。在本说明书中，“同源性”(homology)有时是指“同一性”(identity)。
另外，基因序列中的各密码子可被取代成在导入有基因的宿主中容易使用的其它密码子。
具有保守突变的基因可以是通过诱变剂处理等通常用于突变处理的方法获得的基因。并且，Kv3.2基因只要可以在基因导入到宿主细胞中时表达Kv3.2蛋白，可以包含1个或多个内含子。
编码Kv3.2的DNA(以下有时记作“Kv3.2基因”。)的例子包括：在严格的条件下可以和与公知的基因序列互补的核苷酸序列或可由该互补序列制备的探针进行杂交，并且编码与公知的Kv3.2蛋白具有同等功能的蛋白的多核苷酸。
“严格的条件”是指，形成所谓的特异性杂化物、而不形成非特异性杂化物的条件。虽然难以将该条件明确地数值化，但严格条件的例子包括：同源性高的多核苷酸彼此之间、例如具有78％以上同源性、优选80％以上同源性、进一步优选90％以上同源性、更优选95％以上同源性、特别优选97％以上同源性的多核苷酸彼此之间杂交、而同源性较其低的多核苷酸彼此之间不杂交的条件；或普通DNA杂交的清洗条件、即在相当于在60℃下、1×SSC、0.1％SDS，优选在60℃下、0.1×SSC、0.1％SDS，进一步优选在68℃下、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下清洗1次、更优选2或3次的条件。
作为探针，还可以使用与该基因互补的部分序列。这样的探针可以以根据公知的基因序列制作的寡核苷酸为引物、以包含这些核苷酸序列的DNA片段为模板，通过PCR来制作。例如，当使用具有约300bp长度的DNA片段作为探针时，杂交的清洗条件可以是50℃、2×SSC、0.1％SDS。
比较各种Kv3家族蛋白的同源性时，虽然在上述各种动物的Kv3.2蛋白同系物间显示出78％以上的同源性(同一性)，但在比较Kv3.2蛋白与其他Kv3家族蛋白时最高的同源性为74％。
Kv3.2基因可如下获得：根据公知的Kv3.2基因或本说明书中公开的新的Kv3.2基因、例如编码具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的核苷酸序列的信息设计适当的引物或探针，使用上述引物或探针和来自目标生物[例如哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、狗、马、黑猩猩、恒河猴、鸡、负鼠、猪或牛等)]的试样(例如总RNA、mRNA组分、cDNA文库)，通过实施聚合酶链反应(PCR)法、DNA杂交或RNA杂交等而获得。
Kv3.2基因只要编码能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的蛋白即可，可以是片段，也可以是编码Kv3.2蛋白或其片段与其他蛋白的嵌合蛋白的基因。
例如，如上所述，存在Kv3.2蛋白的剪接变体，该共通部分(例如SEQ ID NO：2的1～538位)的C末端侧区域可被缺失或取代成其他序列的可能性高。
将编码Kv3.2蛋白的多核苷酸以可表达的形态导入适当的宿主细胞中，使Kv3.2蛋白表达，从而可以获得具有咸味受体离子通道的细胞。例如，通过将编码Kv3.2蛋白的直链状DNA或包含编码Kv3.2蛋白的序列的载体导入宿主细胞中，可以使Kv3.2蛋白表达。可表达的形态的序列的例子包括：根据DNA信息制备的、并且在编码Kv3.2蛋白的序列的上游包含编码Kv3.2蛋白的序列和转录和翻译所必需的序列的序列，使能够生成Kv3.2蛋白。另外，通过向宿主细胞中注入编码Kv3.2蛋白的cRNA，也可以获得具有咸味受体离子通道的细胞。此时，在cRNA的5’末端侧包含翻译所必需的序列。转录所必需的序列的例子包括：启动子和增强子等表达调节序列。还可以包含转录终止序列。翻译所必需的序列的例子包括核糖体结合位点。并且，根据需要可以包含加工信息位点、例如RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点等。启动子的例子包括：来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
作为导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的细胞，优选动物细胞、昆虫细胞或酵母，特别优选动物细胞。例如，可以使用味觉细胞被浓缩的组分、分离的味觉细胞、或从选自舌上皮、肾上腺、松果体、甲状腺、黑素细胞和肾脏的组织中分离的组织等。认为在导入表达编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的重组载体时可以进行暂时的功能表达的细胞的具体例子包括：非洲爪蟾卵母细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚肾(HEK)细胞、Sf-9昆虫细胞等。本发明提供以能够表达的形态导入有这样的编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的细胞。作为细胞，优选卵母细胞或味觉细胞，特别优选味觉细胞，其适用于咸味调节物质的筛选。
作为向这些细胞中导入编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的方法，可以采用公知的方法。向细胞中导入多核苷酸等的操作所必需的技术记载在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，第二版”，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1989)等中。
如实施例所示，表达Kv3.2蛋白的细胞具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性。因此，在细胞中表达的Kv3.2蛋白能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。推测Kv3.2蛋白以多聚体的形式构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道，但只要表达Kv3.2蛋白的细胞具有随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性，Kv3.2蛋白可以是单体或多聚体。“阳离子通道”是指，允许钠离子、钙离子和钾离子等阳离子流入或流出细胞内的通道。
并且，如实施例所示，编码Kv3.2蛋白的基因在味觉感受器即舌的味蕾中表达，由于其表达量在咸味感受灵敏度高的小鼠种系中较在咸味感受灵敏度低的小鼠种系中高，由此支持了Kv3.2蛋白是调节咸味感受灵敏度的咸味受体蛋白。
因此，通过鉴定与Kv3.2蛋白或表达该蛋白的细胞作用的化合物，可以探索咸味调节物质。
作为这样的化合物的鉴定方法，除上述方法外，例如还可以通过测定纯化的Kv3.2蛋白与受检物质的结合来进行。此外，通过以相关蛋白(例如Kv1.2、Chen等人、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，107：11352～11357(2010))的立体结构信息为参考使用计算机推测其立体结构，再使用计算机选择与能够影响离子通道活性的位点具有亲和性的化合物，可以有效率地探索与Kv3.2蛋白作用的化合物。
使受检物质与如上操作得到的表达Kv3.2蛋白的细胞接触，再将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较，从而可以筛选咸味调节物质。
若在受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量较未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量多，则判断为受检物质激活咸味受体通道；若在受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量较未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量少，则判断为受检物质使咸味受体通道失活。
另外，在Kv3.2基因表达细胞中表达的基因中，通过鉴定显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因或在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因，还可以探索具有正向或负向调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白。
Kv3.2活性是指，Kv3.2蛋白构成在表达其的细胞中随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道的功能。另外，Kv3.2活性还是指Kv3.2蛋白作为咸味受体蛋白的活性。
显示表达概况与Kv3.2基因类似的基因是指，基因表达的组织特异性与Kv3.2基因表达的组织特异性类似的基因。作为鉴定显示表达概况类似的基因的方法之一，可以列举DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法。具体而言，从各种组织中提取RNA，利用DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法探索与Kv3.2基因显示基因表达的组织特异性类似的基因，从而可以鉴定这样的基因。
在Kv3.2基因表达细胞中表达被抑制的基因是指，在Kv3.2基因表达的细胞中表达被抑制、在Kv3.2基因未表达的细胞中可以确认到表达的基因。作为鉴定表达被抑制的基因的方法之一，可以列举DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法。具体而言，从各种组织中提取RNA，利用DNA微阵列法等综合性基因表达分析方法在Kv3.2基因表达组织中探索未观察到表达的基因，从而可以鉴定这样的基因。
如上所述鉴定的基因，是编码具有调节Kv3.2活性的功能的蛋白或构成咸味受体的蛋白的基因，推测这样的蛋白与Kv3.2蛋白一同构成通道或复合体，参与味觉感受。
并且，通过鉴定与由作为味觉受体的Kv3.2蛋白和在味觉细胞中特异性表达的蛋白构成的通道或复合体作用的化合物，还可以探索呈味物质或风味物质。风味物质是指修饰呈味的物质，其可以作为风味添加剂在食品中使用。作为呈味物质或风味物质，更具体而言，可以列举咸味调节物质。
已知激活味觉受体的物质通过促进味觉受体细胞的兴奋而显示出呈味或增强呈味。因此，使用在细胞膜上表达咸味受体通道的细胞，可以筛选激活咸味受体通道或使其失活的物质、即咸味调节物质。即，激活咸味受体通道的物质被期待着通过促进原来咸味受体离子通道被表达的咸味受体细胞的兴奋来增强咸味感受。因此，在钠离子非存在下激活咸味受体通道的物质作为咸味替代物质的候选是有效的，而在钠离子存在下激活咸味受体通道的物质作为咸味增强物质的候选物质是有效的。因此，可以将表达Kv3.2蛋白的细胞本身用于筛选咸味替代或咸味增强物质。另外，使咸味受体通道失活的物质作为咸味抑制物质的候选是有效的。
表达Kv3.2蛋白的细胞内的阳离子流入量，可以通过将细胞悬浮于包含阳离子的溶液中，之后直接或间接地测定流入细胞内的阳离子的量来测定。
细胞内的阳离子流入量，例如可以通过测定在细胞外阳离子存在下的上述细胞的电生理学性质、例如细胞电流来测定。例如，在钠离子的存在下使表达Kv3.2蛋白的细胞与受检物质接触，检测细胞膜电位或膜电流的变化、或细胞内阳离子浓度，从而可以筛选咸味增强物质或咸味抑制物质等咸味调节物质。另外，通过在钠离子非存在下使表达Kv3.2蛋白的细胞与受检物质接触，之后检测细胞膜电位或膜电流的变化、或细胞内阳离子浓度，可以筛选咸味替代物质。
以下例示使用表达Kv3.2蛋白的细胞筛选咸味调节物质的具体方法。
(1)使编码Kv3.2蛋白的cRNA在非洲爪蟾卵母细胞中表达，按照双极电压钳法，以咸味受体离子通道电流的增强或减弱为指标，检索与咸味受体离子通道发生作用的配体。例如，若向膜电位夹钳在保持电位-60～80mV的细胞的细胞外液中添加试验化合物时与未添加试验化合物时相比内向电流增加，则可以判定上述试验化合物是激活本发明的多肽的物质。另外，使细胞外钠离子浓度阶段性或连续地发生变化，可以测定内向电流。
(2)对于使咸味受体离子通道在细胞表面表达的细胞，在按照电压钳法、特别是全细胞膜电压钳法进行了膜电位夹钳的状态下，以咸味受体离子通道电流的增强或减弱为指标，检索与咸味受体离子通道发生作用的配体。例如，若在钠离子存在下向膜电位夹钳在保持电位-80mV的细胞的细胞外液中添加试验化合物时与未添加试验化合物时相比内向电流增加，则可以判定上述试验化合物为激活本发明的多肽的物质、即咸味增强物质。
(3)对于使咸味受体离子通道在细胞表面表达的细胞，预先使其摄取膜电位敏感性色素，之后在钠离子存在下添加试验化合物，通过分析(即测定或检测)此时细胞内的上述色素的荧光强度的变化，来分析Kv3.2蛋白是否被活化。本方法利用了膜电位敏感性色素可以光学检测离子通道的开放所伴随的膜电位的变化的性质。更具体而言，作为上述膜电位敏感性色素，可以使用DiBAC[双(1，3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧杂菁，MolecularProbes]或其衍生物、或膜电位测定试剂盒(Molecular Devices)等。
(4)对于使咸味受体离子通道在细胞表面表达的细胞，预先导入阳离子敏感性色素(例如，SBFI，CoroNa Green，Sodium Green(Molecular Probes等)，之后在钠离子存在下使配体候选化合物与咸味受体离子通道表达细胞接触一定时间，以此时的荧光强度比(细胞内阳离子浓度)的变化为指标，检索咸味增强或抑制的物质。
(5)通过在钠离子非存在下实施上述(2)～(4)所述的方法，可以探索咸味替代物质。
实施例
以下，参照实施例来具体说明本发明，但这些实施例并不限定本发明的范围。只要没有特别说明，则按照公知的方法(Maniatis，T.等人，“Molecular Cloning-A LaboratoryManual”，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1～982；和Hille，B.，Ionic Channels ofExcitable Membranes，第二版，Sinauer Associates Inc.，MA，1992)实施这些实施例的程序。
〔实施例1〕小鼠Kv3家族通道基因的表达分析
使用小鼠舌上皮组织，通过RT-PCR法，按照以下程序分析编码具有SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的蛋白的Kv3家族通道基因在舌上皮中的表达分布。
从小鼠的舌上分离上皮，再分别切除包含菌状乳头的舌尖部分、包含轮廓乳头的区域(舌中央后部)、包含叶状乳头的舌两侧部分、以及不含味蕾的上皮。另外切除肾脏，并粉碎。
使用RNA提取试剂盒(Absolutely RNA Microprep试剂盒，Stratagene)，从各组织中提取RNA。使用RT-PCR用Super Script III第一链合成系统(Invitrogen)使提取的RNA逆转录，合成第一链cDNA。以得到的第一链cDNA为模板，组合表1所示的引物进行PCR，扩增Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3和Kv3.4各蛋白的基因的cDNA。
表1
使用FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Aplpied Science)，通过热启动法进行PCR。上述各引物的核苷酸序列为小鼠Kv3.1基因(NM_001112739)、小鼠Kv3.2基因(NM_001025581，SEQ ID NO：9)、小鼠Kv3.3基因(NM_008422)和小鼠Kv3.4基因(NM_145922)特异性序列，Kv3.1：241bp、Kv3.2：574bp、Kv3.3：204bp、Kv3.4：287bp的DNA片段分别被扩增。基因名称后的括号内为GenBank检索号。
对来自小鼠的包含菌状乳头的舌尖部分、包含轮廓乳头的区域(舌中央后部)、包含叶状乳头的舌两侧部分、不含味蕾的上皮的mRNA以及来自肾脏的mRNA进行RT-PCR分析。作为对照，对来自这些组织的mRNA，在不加入逆转录酶的情况下进行同样的反应。
其结果，在包含味蕾的上皮组织中、即包含菌状乳头的舌尖部分、包含轮廓乳头的区域、包含叶状乳头的舌两侧部分，对于Kv3.1、Kv3.2、Kv3.3、Kv3.4所有蛋白，想定的大小的DNA片段被扩增(图1)。由该结果可知：在舌上皮中在包含味蕾的部分发现Kv3家族的离子通道蛋白的mRNA的表达。特别是阐明了Kv3.2基因在舌上皮中只存在于包含菌状乳头的舌尖部分、包含轮廓乳头的区域、包含叶状乳头的舌两侧部分等包含味蕾的部分。同时，在肾脏中，Kv3.1、Kv3.2和Kv3.3的想定大小的DNA片段被扩增。至于Kv3.4，与想定的尺寸不同的DNA片段被扩增，这暗示有可能存在剪接变体。〔实施例2〕编码人Kv3.2蛋白的多核苷酸的分离和表达载体的构建
虽然编码人咸味受体蛋白的全长cDNA例如可以由人的mRNA克隆，也可以作为哺乳动物基因采集(http://mgc.nci.nih.gov/)中包含的该相应的全长cDNA而购入(MGC：120670，IMAGE：7939480，目录号：MHS1010-98052225，Open Biosystems)。以该可以购入的质粒为模板，以由SEQ ID NO：19所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(5’末端添加有KpnI识别序列)作为正向引物、以由SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸(5’末端添加有XhoI识别序列)作为反向引物，进行PCR反应。得到的DNA片段经限制酶KpnI和XhoI消化后克隆到质粒pcDNA3.1(+)中。将得到的克隆命名为pcDNA3.1-KCNC2。上述质粒pcDNA3.1(+)具有来自巨细胞病毒的启动子序列，可用于在动物细胞中表达由克隆片段编码的多肽。
按照双脱氧终止子法，使用DNA测序仪(3130xl遗传分析仪；Applied Biosystems)分析所得克隆pcDNA3.1-KCNC2的核苷酸序列，得到了SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。SEQID NO：5所示的核苷酸序列具有由1677个碱基对组成的可读框。由上述可读框预测的氨基酸序列由558个氨基酸残基组成(SEQ ID NO：6)。
〔实施例3〕Kv3.2蛋白在非洲爪蟾卵母细胞中的表达
为了检测具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的蛋白的、活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性，以上述实施例2中得到的表达载体pcDNA3.1-KCNC2为模板合成cRNA，并将其注入非洲爪蟾卵母细胞中，从而使上述蛋白表达。利用限制酶XhoI在一个位点切断上述表达载体pcDNA3.1-KCNC2以形成线状，之后使用市售的cRNA合成试剂盒即Megascript高收率转录试剂盒(Ambion)合成编码Kv3.2蛋白的cRNA。使用玻璃毛细管和微量注射器(World Prescision Instruments)，将合成的cRNA注入按照常规方法制备的非洲爪蟾卵母细胞中，使Kv3.2蛋白表达。另外，作为对照细胞，以相同的方式制作注入了水的卵母细胞。得到的这些卵母细胞在ND96+溶液(96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl2，1.8mMCaCl2，5mM HEPES，2mM丙酮酸钠，1/100青霉素-链霉素混合液(15140-122，Invitrogen)，用NaOH调整至pH7.4)等标准卵母细胞培养液中、在18℃下保存2～4天后，在以下的实施例4中使用。
〔实施例4〕检测Kv3.2蛋白的随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性
通过双极电压钳法夹钳上述实施例3中得到的各卵母细胞的膜电位，测定全细胞电流。在该测定中使用ND96溶液(96mmol/L NaCl，2mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，1.8mmol/LCaCl2和5mmol/L HEPES(pH7.5))。
在注入有以质粒pcDNA3.1-KCNC2为模板制作的cRNA的非洲爪蟾卵母细胞中，当细胞外液中的NaCl浓度为96mM时，在保持电位-80mV下测定100nA以上的内向电流。通过将上述ND96溶液中的NaCl取代成N-甲基-D-葡糖胺盐酸盐而使细胞外液中的NaCl浓度在0～96mM间变动时，观察到该电流随着细胞外钠离子浓度的增加而增加(图2)。另一方面，在注入了水的对照卵母细胞中，当细胞外液中的NaCl浓度为96mM时，在保持电位-80mV下没有观察到显著的内向电流，而且当细胞外液中的钠离子浓度发生变化时，也没有观测到电流量的变化。
〔实施例5〕确认Kv3家族蛋白是否存在随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性
对于象Kv3.2一样属于Kv3家族的通道Kv3.1、Kv3.3和Kv3.4，按照与实施例2相同的方式构建表达载体。购入编码该相应蛋白的全长cDNA(Kv3.1：目录号ORK11519、Promega，Kv3.3：目录号OHS4559-99848374、Open Biosystems，Kv3.4：目录号MHS 1010-98052650、Open Biosystems)。以这些全长cDNA为模板，并使用表2所示的引物的组合，分别进行PCR，制作编码Kv3.1、Kv3.3和Kv3.4的各蛋白的基因DNA片段。所得DNA片段的5’和3’两末端用限制酶消化(Kv3.1：XbaI和XhoI，Kv3.3：NheI和EcoRI，Kv3.4：NheI和XhoI)，之后将消化产物克隆到质粒pcDNA3.1(+)中。所得克隆分别命名为：pcDNA3.1-KCNC1(Kv3.1)、pcDNA3.1-KCNC3(Kv3.3)和pcDNA3.1-KCNC4(Kv3.4)。
表2
按照与实施例2相同的方式，以这些质粒为模板合成cRNA，并将其注入非洲爪蟾卵母细胞中，从而使上述蛋白表达。上述表达载体pcDNA3.1-KCNC1、pcDNA3.1-KCNC3和pcDNA3.1-KCNC4用限制酶(Kv3.1：XhoI，Kv3.3：EcoRI，Kv3.4：XhoI)在1个位点切断以形成线状。之后使用市售的cRNA合成试剂盒即Megascript高收率转录试剂盒(Ambion)，分别合成编码Kv3.1、Kv3.3和Kv3.4蛋白的cRNA。使用玻璃毛细管和微量注射器(WorldPrescision Instruments)将合成的cRNA注入按照常规方法制备的非洲爪蟾卵母细胞中，使由各cRNA编码的蛋白表达。作为对照细胞，还制作按照与实施例2相同的方式注入了Kv3.2以使蛋白表达的卵母细胞和注入了水的卵母细胞。得到的各卵母细胞在ND96+溶液(96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl2，1.8mM CaCl2，5mM HEPES，2mM丙酮酸钠，1/100青霉素-链霉素混合液(15140-122，Invitrogen)，用NaOH调整至pH7.4)等标准卵母细胞培养液中、在18℃下保存2～4天后，利用双极电压钳法夹钳膜电位，测定全细胞电流。该测定中使用ND96溶液(96mmol/L NaCl，2mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，1.8mmol/L CaCl2和5mmol/L HEPES(pH7.5))。
在使用ND96使细胞外液中的NaCl浓度达到96mM的情况下和通过将ND96溶液中的NaCl置换成N-甲基-D-葡糖胺盐酸盐使细胞外液中的NaCl浓度达到0mM的情况下，对于各卵母细胞测定在保持电位-80mV下的电流量之差。其结果，只在注入编码Kv3.2蛋白的cRNA的情况下，测定到平均为约80nA以上的电流量差(图3)。另一方面，在注入了水的对照卵母细胞中无法观察电流量之差。并且，在注入了编码其他Kv3家族的通道即Kv3.1、Kv3.3和Kv3.4蛋白的cRNA的卵母细胞中，只测定到不足15nA的电流，且没有发现与注入了水的对照卵母细胞的显著差异。根据这些测定结果确认：在类似性高的Kv3家族通道中，也只有Kv3.2显示出电流量随着细胞外钠离子浓度的增加而增加。
以上结果显示：Kv3.2蛋白能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。
〔实施例6〕在显示咸味感受灵敏度差异的小鼠种系间比较Kv3.2基因的表达量
迄今为止，有人报道了利用行为学方法测定小鼠的咸味阈值的方法(Ishiwatari，Y.和Bachmanov，A.A.，Chemical Senses，34：277-293(2009))。还有报道称：在小鼠种系间在咸味感受灵敏度方面存在差异(Ishiwatari，Y.和Bachmanov，A.A.，Chemical Senses，32：A26(2007))。利用上述行为学方法，对于咸味感受灵敏度显示差异的两个种系C57BL/6J(显示咸味感受灵敏度高的种系)和A/J(显示咸味感受灵敏度低的种系)，测定咸味阈值之差。其结果，确认两者间存在约5倍的阈值差(表3)。然后，对于这两个种系，定量并比较舌上皮中的编码Kv3.2蛋白的基因的表达量。
表3
种系 咸味阈值(mM)
C57BL/6J 8.6
A/J 43.3
从两个种系(C57BL/6J、A/J)的小鼠的舌上分离上皮，再分别切除包含菌状乳头的舌尖部分和不含味蕾的上皮。使用RNA提取试剂盒(Absolutely RNA Microprep试剂盒；Stratagene)从各组织中提取RNA。使用RT-PCR用Super Script III第一链合成系统(Invitrogen)使提取的RNA逆转录，合成第一链cDNA。以得到的第一链cDNA为模板，使用TaqMan Gene Expression Assays(Life Technologies)，利用StepOnePlus实时PCR系统(Life Technologies)进行定量RT-PCR分析。定量结果，除了通过各位点的β-肌动蛋白基因(actb)的表达量来补正以外，还比较种系间的表达量。对Kv3.2基因进行两种测定(探针1：Mm01234233_m1，探针2：Mm01234232_m1)，其结果，在A/J和C57BL/6J两种系间在舌尖部分的表达量上发现差异。C57BL/6J种系的表达量较A/J种系的表达量高3～5倍，认为该表达量之差影响到咸味感受灵敏度之差(表4)。另一方面，在两种系的不含味蕾的上皮中均未检测到表达。
表4
*：根据actb基因表达量进行标准化的B6(C57BL/6J)、A(A/J)的表达量之比
由以上结果确认：Kv3.2基因编码有助于咸味感受的蛋白。
〔实施例7〕利用原位杂交法确认小鼠Kv3.2基因在味蕾中的表达
编码小鼠的咸味受体蛋白全长的cDNA，可以通过以SEQ ID NO：9和基因数据库中注册的类似序列(GenBank检索号：BY281762)为参考设计引物组并进行PCR来克隆。以由SEQID NO：35所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为正向引物、以由SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为反向引物，以实施例6中得到的、由包含菌状乳头的舌尖部分制作的第一链cDNA为模板，进行PCR反应。将所得的DNA片段克隆到质粒pGEM-T Easy(Promega)中。将得到的克隆命名为pGEM-T-mKcnc2。按照双脱氧终止子法，使用DNA测序仪(3130xl遗传分析仪，Applied Biosystems)，分析所得克隆的核苷酸序列，确认得到了与SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列。再使用限制酶SphI在1个位点切断质粒pGEM-T-mKcnc2以形成线状，之后使用DIG RNA标记试剂盒(Roche Diagnostics)，合成洋地黄毒苷标记的小鼠Kv3.2基因的反义RNA。
使用恒冷箱，由浸在冷冻组织包埋剂中、在-80℃下冷冻保存的小鼠舌的包含味蕾的部分制作切片。对切片进行固定处理(在4％低聚甲醛溶液中浸渍10分钟)，之后进行10分钟的酰基化处理，再使用PBS用10分钟清洗3次，之后浸在杂交缓冲液(5×SSC、50％甲醛、1×Denhardt杂交溶液、1mg/ml的鲑精DNA、1mg/ml的tRNA)中。在洋地黄毒苷标记的UTP存在下，使用T7 RNA聚合酶制备cRNA探针。在5×SSC、50％甲醛溶液中、在72℃下进行杂交。为了进行信号检测，使用碱性磷酸酶结合抗洋地黄毒苷抗体(Roche Diagnostics)，以NBT/BCIP为底物进行显色反应，之后在光学显微镜(BX61，Olympus)下观察切片。以洋地黄毒苷标记的小鼠Kv3.2基因的反义RNA作为探针进行杂交，结果，在小鼠舌上皮的包含轮廓乳头的区域，在味蕾中检测到信号(图4)。因此，判明Kv3.2基因在味蕾中表达。
由以上结果确认：Kv3.2蛋白存在于味蕾中。若考虑Kv3.2蛋白有助于咸味感受灵敏度、且构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道，则得出Kv3.2蛋白构成咸味受体离子通道的结论。该Kv3.2蛋白可用于筛选新的咸味调节物质。
〔实施例8〕使用Kv3.2筛选通道活性调节化合物
向从非洲爪蟾(雌)中取出的成熟卵母细胞中注入人Kv3.2通道的cRNA，在ND96+溶液(96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl2，1.8mM CaCl2，5mM HEPES，2mM丙酮酸钠，1/100青霉素-链霉素混合液(15140-122，Invitrogen)，用NaOH调整至pH7.4)等标准的卵母细胞培养液中、在18℃下保存。注入起2～4天后，将卵母细胞设置在非洲爪蟾卵母细胞用平行夹具系统OpusXpress 6000A(Molecular Devices Japan)中。将卵母细胞用测定缓冲液(66mM N-甲基-D-葡糖胺盐酸盐，30mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl2，1.8mM CaCl2，5mM HEPES，用KOH调整至pH7.4)灌流，保持膜电位在-80mV。在该状态下测定细胞膜电流，根据在添加受检物质溶液时检测电流的变化进行筛选。就电流而言，当观察到内向电流时，认为使用化合物Kv3.2通道被激活，当观察到外向电流时，认为Kv3.2通道活性被抑制。另外，为了与由受检物质对卵母细胞自身的影响引起的非特异性电流的变化进行区分，向注入了水的卵母细胞中也添加受检物质溶液来代替cRNA，以确认电流没有变化。例如，通过筛选而得到的低分子有机化合物A，虽然其在表达人Kv3.2的卵母细胞中在添加化合物时浓度依赖性地增加电流，但在注入了水的卵母细胞中并没有确认到这样的电流的变化(图5)。
〔实施例9〕所得活性调节化合物的咸味增强效果
对于发现Kv3.2通道活性调节作用的化合物，通过对化合物进行定量的感官评价试验，确认其对咸味的影响。
定量的感官评价试验如下实施。将作为试样的化合物A以0.0001～0.002g/dl与含有0.5g/dl的氯化钠的蒸馏水混合，测定该化合物的咸味增强活性的强度。以含有0.55g/dl、0.60g/dl或0.65g/dl的氯化钠的蒸馏水作为比较对象。采用基于线性尺度法的方法，评审员在显示氯化钠浓度为混合物浓度的1.0倍(0.50g/dl)、1.1倍(0.55g/dl)、1.2倍(0.60g/dl)和1.3倍(0.65g/dl)的位置的直线上标记相应的采点位置。通过将评审员标记的位置平均化得到测试评分，并将其表记为咸味增强率(倍)。以n＝6进行试验。以食品的调味开发累积1年以上的经验、可以识别不同浓度的0.50g/dl、0.55g/dl和0.60g/dl的氯化钠溶液的人(定期确认)作为评审员。评价为“前味(initial taste)”是指含在口腔中后2秒内的咸味的强度，“中后味(middle and after tastes)”是指中味和后味组合的味道，评价为自含在口腔中起2秒后的咸味的强度。代表性的浓度下的结果见表5。由这些结果判明：添加化合物A使咸味强度浓度依赖性地增强。
表5
〔实施例10〕非洲爪蟾Kv3.2基因的克隆
尚无编码非洲爪蟾(Xenopus laevis)Kv3.2通道蛋白的cDNA的信息。但在作为近缘物种的热带爪蟾(Xenopus tropicalis)的基因数据库(http://genome.jgi-psf.org/Xentr4/Xentr4.home.html)中注册有预测编码Kv3.2的核苷酸序列(C_scaffold_541000003)。根据本序列和人、小鼠、大鼠的Kv3.2基因序列信息，以由SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为正向引物、以由SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为反向引物，以非洲爪蟾脑的cDNA为模板，进行PCR反应。将得到的DNA片段克隆到质粒pGEM-T Easy中。将所得克隆命名为pGEM-T-xlKcnc2。按照双脱氧终止子法，使用DNA测序仪(3130xl遗传分析仪，Applied Biosystems)分析所得克隆的核苷酸序列，确认得到了SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列具有由1716个碱基对组成的可读框。由上述可读框预测的氨基酸序列由571个氨基酸残基组成(SEQ ID NO：40)。
〔实施例11〕非洲爪蟾Kv3.2蛋白在非洲爪蟾卵母细胞中的表达
为了检测具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列的蛋白的、活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性，以上述实施例10中得到的克隆为模板合成cRNA，并将其注入非洲爪蟾卵母细胞中，从而使上述蛋白表达。以上述质粒pGEM-T-xlKcnc2为模板，以由SEQ ID NO：41所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为正向引物、以由SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为反向引物，进行PCR反应。得到的DNA片段用限制酶NheI和XhoI消化后克隆到质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中。将所得克隆命名为pcDNA3.1-xlKcnc2。所得质粒用限制酶XhoI在1个位点切断以形成线状，之后使用市售的cRNA合成试剂盒Megascript高收率转录试剂盒(Ambion)合成编码Kv3.2蛋白的cRNA。使用玻璃毛细管和微量注射器(World Prescision Instruments)将合成的cRNA注入按照常规方法制备的非洲爪蟾卵母细胞中，使Kv3.2蛋白表达。并且，作为对照细胞，以相同方式制作注入了水的卵母细胞。得到的这些卵母细胞在ND96+溶液(96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl2，1.8mMCaCl2，5mM HEPES，2mM丙酮酸钠，1/100青霉素-链霉素混合液(15140-122，Invitrogen)，用NaOH调整至pH7.4)等标准卵母细胞培养液中、在18℃下保持2～4天，之后在以下的实施例12中使用。
〔实施例12〕检测非洲爪蟾Kv3.2蛋白的、随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道活性
对于上述实施例11中得到的各卵母细胞，利用双极电压钳法夹钳膜电位，测定全细胞电流。在该测定中使用ND96溶液(96mmol/L NaCl，2mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，1.8mmol/L CaCl2和5mmol/L HEPES(pH7.5))。在注入有以质粒pcDNA3.1-xlKcnc2为模板制作的cRNA的非洲爪蟾卵母细胞中，当细胞外液中的NaCl浓度为96mM时，在保持电位-80mV下测定到100nA以上的内向电流。当细胞外液中的NaCl浓度为0mM时没有确认到该电流，并观察到电流量随着细胞外钠离子浓度的减少而减少(图6)。另一方面，在注入了水的对照卵母细胞中，当细胞外液中的NaCl浓度为96mM时，在保持电位-80mV下没有观察到显著的内向电流，而且即使在细胞外液中的钠离子浓度变成0mM时也没有观测到电流量的变化。
以上结果显示：非洲爪蟾Kv3.2蛋白能够构成活性随着细胞外钠离子浓度变化而变化的阳离子通道。
〔实施例13〕克隆在味蕾中表达的小鼠Kv3.2基因
已有1种小鼠Kv3.2基因(SEQ ID NO：9)被注册。至于人，有4种认为是剪接变体的Kv3.2基因注册在基因数据库中(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7)，小鼠中也有可能同样存在多个剪接变体。因此，为了获得在小鼠的味蕾中表达并发挥作用的Kv3.2基因，克隆来自包含味蕾的舌上皮的小鼠Kv3.2基因。首先，从小鼠的舌上分离上皮，切除包含味蕾的部分，使用RNA提取试剂盒(Absolutely RNA Microprep试剂盒，Stratagene)提取RNA。使用RT-PCR用Super Script III第一链合成系统(Invitrogen)使提取的RNA逆转录，合成第一链cDNA。以得到的第一链cDNA为模板，通过PCR扩增cDNA。使用由SEQ ID NO：35所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为正向引物，使用由SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸、以及分别由SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为反向引物。由SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：45所示的核苷酸序列组成的寡核苷酸作为由人Kv3.2基因序列(SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7)与包含小鼠Kv3.2基因的小鼠基因组DNA序列(GenBank检索号NC 000076)的对比预测的小鼠Kv3.2剪接变体所对应的反向引物来设计。PCR中使用Phusion Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs)。
〔实施例14〕从味蕾中分离的小鼠Kv3.2基因的剪接变体
将所得DNA片段克隆到质粒pGEM-T Easy中。按照双脱氧终止子法，使用DNA测序仪(3130xl遗传分析仪，Applied Biosystems)分析所得的30种克隆的核苷酸序列，将它们大致分成5组种类相似的核苷酸序列。这5组由下述序列组成：具有与作为小鼠Kv3.2基因唯一注册在基因数据库中的SEQ ID NO：9相同的核苷酸序列的序列、以及分别具有SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52所示的可读框的序列。各核苷酸序列的长度和由可读框预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：53)的长度分别见表6。这些氨基酸序列除C末端区外具有共通的序列(相当于SEQ IDNO：10的1～597位的部分)，认为它们是剪接变体。这些由味蕾克隆的小鼠Kv3.2基因的剪接变体分别有可能以其自身或与其他变体的复合体的形式形成咸味受体通道。
表6

Claims (6)

1.咸味调节物质的筛选方法，该方法包括下述步骤：在钠离子存在下使受检物质与表达Kv3.2蛋白的细胞接触，测定上述细胞的细胞膜电流，并将所观察到的上述细胞内的阳离子流入量和未使上述受检物质与上述细胞接触时所观察到的上述细胞内的阳离子流入量进行比较，其中，Kv3.2蛋白由下述的氨基酸序列组成：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 53。
2.权利要求1所述的方法，其中，咸味调节物质为咸味增强物质或咸味抑制物质。
3.权利要求1或2所述的方法，其中Kv3.2蛋白由下述(a)所示的DNA编码：
(a) DNA，其由下述的核苷酸序列组成：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48、SEQ IDNO: 50或SEQ ID NO: 52。
4.权利要求1或2所述的方法，其中，Kv3.2蛋白为：来自人、小鼠、或爪蟾属的蛙的Kv3.2蛋白。
5.权利要求1或2所述的方法，其中，上述细胞为以可表达的形态导入有编码Kv3.2蛋白的多核苷酸的卵母细胞。
6.权利要求1或2所述的方法，其中，上述细胞表达从选自味觉细胞、舌上皮、肾上腺、松果体、甲状腺、黑素细胞和肾脏的组织中分离的Kv3.2基因。
CN201080045012.6A 2009-09-29 2010-09-29 咸味调节物质的筛选方法 Expired - Fee Related CN102575279B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009-224942 2009-09-29
JP2009224942 2009-09-29
PCT/JP2010/066962 WO2011040475A1 (ja) 2009-09-29 2010-09-29 塩味調節物質のスクリーニング方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102575279A CN102575279A (zh) 2012-07-11
CN102575279B true CN102575279B (zh) 2018-03-20

Family

ID=43826289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080045012.6A Expired - Fee Related CN102575279B (zh) 2009-09-29 2010-09-29 咸味调节物质的筛选方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9222944B2 (zh)
EP (1) EP2386651B1 (zh)
JP (1) JP5206882B2 (zh)
CN (1) CN102575279B (zh)
SG (1) SG175260A1 (zh)
WO (1) WO2011040475A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6540989B2 (ja) * 2015-02-26 2019-07-10 小川香料株式会社 呈味を増強する化合物をスクリーニングする方法および呈味増強剤並びに呈味増強剤を含む飲食品
JP6167152B2 (ja) * 2015-10-29 2017-07-19 花王株式会社 上皮型ナトリウムチャネル活性化剤
EP3273243A3 (en) 2016-07-19 2018-03-21 Ajinomoto Co., Inc. Method for screening salty-taste modifying substance
CN111527215B (zh) * 2017-12-28 2024-01-05 日清食品控股株式会社 利用咸味受体筛选咸味增强剂的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060223117A1 (en) * 2005-02-07 2006-10-05 Senomyx, Inc. Novel splice variants of human epithelial sodium channel genes expressed in human taste tissue and uses thereof

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2630423B2 (ja) 1988-05-06 1997-07-16 富山化学工業株式会社 低ナトリウム塩味料
JPH02131552A (ja) * 1988-11-10 1990-05-21 Ajinomoto Co Inc 塩味代替物質の苦味を除去する方法及び塩味代替組成物
JP3073544B2 (ja) 1991-02-18 2000-08-07 三栄源エフ・エフ・アイ株式会社 塩化カリウムの脱苦味方法
US5145707A (en) 1991-12-12 1992-09-08 Kraft General Foods, Inc. Salt enhancer
JP2991687B2 (ja) 1997-12-25 1999-12-20 武田薬品工業株式会社 調味料用組成物
WO1999051777A2 (en) 1998-04-06 1999-10-14 Bunsen Rush Laboratories, Inc. Directed evolution biosensors
EP1292827A4 (en) 2000-04-07 2006-07-12 Senomyx Inc T2R GUSTIVE RECEIVERS AND GENES ENCODING THEM
GB2372503A (en) * 2000-10-19 2002-08-28 Glaxo Group Ltd Voltage-gated potassium channel polypeptides
JP4042397B2 (ja) 2001-11-07 2008-02-06 ひかり製菓株式会社 呈味改良剤
CA2596913A1 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Nestec S.A. Salt taste receptor and its use in an assay for salt taste
JP2007108949A (ja) * 2005-10-12 2007-04-26 Ajinomoto Co Inc 遺伝子発現制御配列の推定方法
FR2900799A1 (fr) 2006-05-15 2007-11-16 Lesaffre & Cie Nouvel agent substitut du sel naci, son utilisation et produits en contenant
JP2009539377A (ja) * 2006-06-08 2009-11-19 セノミックス インコーポレイテッド 新規味細胞遺伝子および塩味受容体標的を同定するための理論的根拠、方法、およびアッセイならびにこれらの同定された遺伝子または遺伝子産物を使用するアッセイ
JP2009544282A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 塩味のエンハンサーまたはマスカーをスクリーニングするための方法
JP4824628B2 (ja) * 2007-05-25 2011-11-30 日清食品ホールディングス株式会社 食塩代替物、及び減塩加工食品とその製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060223117A1 (en) * 2005-02-07 2006-10-05 Senomyx, Inc. Novel splice variants of human epithelial sodium channel genes expressed in human taste tissue and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Expression and characterization of delayed rectifying K+ channels in anterior rat taste buds;Lidong Liu,et al;《American Journal of Physiology-Cell Physiology》;20050601;第289卷;第C868页左栏摘要，右栏第第2段，第C876页左栏第1段，图4、6 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011040475A1 (ja) 2011-04-07
JP5206882B2 (ja) 2013-06-12
CN102575279A (zh) 2012-07-11
US20120028263A1 (en) 2012-02-02
SG175260A1 (en) 2011-11-28
EP2386651B1 (en) 2015-12-02
US9222944B2 (en) 2015-12-29
EP2386651A4 (en) 2012-11-14
JPWO2011040475A1 (ja) 2013-02-28
EP2386651A1 (en) 2011-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Han et al. A Novel Octopamine Receptor with Preferential Expression inDrosophila Mushroom Bodies
Kang et al. Olfactory receptors in non-chemosensory tissues
Zhang et al. Coding of sweet, bitter, and umami tastes: different receptor cells sharing similar signaling pathways
Deng et al. The stimulatory Gαs protein is involved in olfactory signal transduction in Drosophila
US7282557B2 (en) Nucleic acids encoding a G-protein coupled receptor involved in sensory transduction
Ugawa et al. Amiloride-insensitive currents of the acid-sensing ion channel-2a (ASIC2a)/ASIC2b heteromeric sour-taste receptor channel
Abaffy et al. Functional analysis of a mammalian odorant receptor subfamily
Starich et al. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system
CN102575279B (zh) 咸味调节物质的筛选方法
JP2010115201A (ja) 新規な味覚受容体ｔ１ｒ３
CN101611049A (zh) 人咸味觉受体和调节咸味感觉的方法
US20090117563A1 (en) Identification of TRPML3 (MCOLN3) as a Salty Taste Receptor and Use in Assays for Identifying Taste (Salty) Modulators and/or Therapeutics that Modulate Sodium Transport, Absorption or Excretion and/or Aldosterone and/or Vasopressin Production or Release
US7601883B2 (en) Mammalian sour/acid taste and CSF receptor genes, polypeptides and assays
WO2001098526A2 (en) Receptor fingerprinting, sensory perception, and biosensors of chemical sensants
US20140248639A1 (en) Assays for identifying compounds that modulate bitter taste
CN111527215B (zh) 利用咸味受体筛选咸味增强剂的方法
JP7039483B2 (ja) Ｇｐｒ９２の調節因子の同定方法
US20100119454A1 (en) Use of the conserved Drosophila NPFR1 system for uncovering interacting genes and pathways important in nociception and stress response
JP2019010058A (ja) フェノリック香料素材のスクリーニング方法
EP1473305B1 (en) Novel glutamate receptor and utilization thereof
US7271257B2 (en) Glutamate receptors and utilization thereof
WO2020175562A1 (ja) ナトリウムの作用を調節する物質のスクリーニング方法
Tognoli Molecular biomarkers for fish welfare and species authentication.
Marton Major urinary proteins: functional characterization of a novel pheromone family that promotes intermale aggression
US20080307536A1 (en) Voltage-Gated, Ph-Sensitive Anion Channel And Its Novel Splice Variant Involved In Taste Sensation

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180320

Termination date: 20200929

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee