CN102573866A - 抗流感病毒剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供使用可日常安心使用的安全性高的植物提取物，流感病毒吸附抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒cRNA合成抑制剂、病毒膜融合活性试验中的溶血抑制剂及流感病毒的包膜破坏剂。抗流感病毒剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。

Description

抗流感病毒剂
技术领域
本发明涉及以具有流感病毒的感染抑制作用的植物来源的提取物为有效成分的抗流感病毒剂、流感病毒吸附抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒cRNA合成抑制剂、病毒膜融合活性试验中的溶血抑制剂及流感病毒的包膜破坏剂。
背景技术
每年都会引发流感流行的流感病毒是直径为万分之一毫米左右的具有包膜的RNA病毒。根据其抗原性的不同被分为甲型、乙型、丙型这3型，流行范围较广的是甲型、乙型。在这些病毒的粒子表面，红细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)这2种糖蛋白呈刺突状突起，内部存在分节为8条的基因RNA。位于病毒表面的HA和NA在同一亚型内频繁地发生突变，每年都出现新的抗原突变株。
通过咳嗽的飞沫释出的流感病毒从人的鼻或口侵入，通过病毒表层的刺突状糖蛋白HA吸附于上呼吸道的粘膜上皮细胞，侵入到细胞中后开始增殖。通过近年来的研究，已经清楚病毒的感染机理。病毒与存在于人的靶细胞表层的糖链形成的受体结合，被摄入到核内体，通过病毒膜与核内体膜的融合而侵入到细胞内，经过脱壳、迁移，开始病毒基因的表达和复制，最终通过自宿主细胞膜的出芽形成子代病毒粒子而增殖。
自流感病毒的感染起数日，出现突然的发热、头疼、关节痛、全身乏力等症状，并伴随出现咳嗽或咽喉疼痛、鼻涕、鼻塞等呼吸器官症状。与所谓的感冒不同，其特征是感染力强，短期内引发爆发式的流行。此外，流感病毒的HA蛋白的结构每年都反复发生突变，过去的感染所产生的抗体无太大作用也是感染扩散的主要原因。
为了抑制流感病毒的感染，可考虑对上皮细胞的吸附的阻碍、对细胞的侵入的阻碍、基因的转录和复制的抑制、蛋白质合成的阻碍、自细胞的释放的抑制等，分别都成为抗病毒药的靶点。目前为止，开发出了金刚烷胺、金刚乙胺、扎那米韦等抗病毒药，但报道了过敏症、精神神经症状、消化器官系统症状、自主神经系统症状等副作用，对于其应用必须多加注意。
此外，流感病毒在呼吸道粘膜上皮中感染、增殖，无法准确预计当年的流行型，所以通过疫苗的接种来抑制感染也被认为很困难。频繁的漱口、避免喉咙的干燥、充足的营养和休息等被认为是目前最有效的预防对策。期待开发出感染抑制效果好且安全性没有问题、可日常使用的抗流感病毒剂。
近年来，作为天然物来源的抗流感原材料，报道有茶或红茶的多酚成分(非专利文献1和2)，人体试验表明，用红茶漱口可抑制实际的病毒感染(非专利文献3)。此外，报道了来自黄芩的类黄酮成分通过病毒的唾液酸酶抑制活性而显示出流感感染抑制效果(非专利文献4)。另外，还报道了作为中药制剂的桂枝二越婢一汤(专利文献1)、黑加仑提取物(专利文献2)、马铃薯花色苷(专利文献3)、番石榴叶提取物(专利文献4)、罗布麻提取物(专利文献5)等的抗病毒效果。
此外，对于蔷薇科植物，揭示有以其花蕾或花瓣的提取物为有效成分的抗流感剂(专利文献6)，报道了木瓜的提取物(专利文献8)、木瓜的柱色谱分离物(非专利文献5)的抗流感病毒效果。然而，未见到关于本发明专利所示的木瓜的柱色谱分离物的流感病毒吸附抑制效果、流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制效果、流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制效果、流感病毒感染细胞中的病毒cRNA合成抑制效果、病毒膜融合活性试验中的溶血抑制效果及流感病毒的包膜破坏效果的报道，是由本发明首次公开的。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开平6-199680号公报
专利文献2：日本专利特开2000-212092号公报
专利文献3：日本专利特开2001-316399号公报
专利文献4：日本专利特开2000-273048号公报
专利文献5：日本专利特开平11-71296号公报
专利文献6：日本专利特开2002-145790号公报
专利文献7：日本专利特表2002-020305号公报
专利文献8：日本专利特开2005-343836号公报
非专利文献
非专利文献1：感染症学杂志，68(7)824-829(1994)
非专利文献2：感染症学杂志，70(11)1190-1192(1996)
非专利文献3：感染症学杂志，71(6)487-494(1997)
非专利文献4：Chem.Pharm.Bull.38(5)1329-1332(1990)
非专利文献5：Journal of Ethnopharmacology，118，108-112(2008)
发明的概要
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于使用可日常安心使用的安全性高的植物提取物，提供流感病毒吸附抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒复制抑制剂、病毒膜融合活性试验中的溶血抑制剂及流感病毒的包膜破坏剂。
解决技术问题所采用的手段
为了解决上述课题，本发明人着眼于无副作用、安全性高的木瓜，通过添加有流感病毒的MDCK细胞中的mRNA、vRNA、cRNA的RT-PCR法分析、使用鸡红细胞的溶血反应、病毒粒子的电子显微镜观察发现了木瓜提取物的效果，从而完成了本发明。
即，本发明提供以将木瓜(Chaenomeles sinensis，Pseudocydoniasinensis)提取物作为有效成分为特征的流感病毒吸附抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒cRNA合成抑制剂、病毒膜融合活性试验中的溶血抑制剂及流感病毒的包膜破坏剂。另外，本发明提供含木瓜提取物的具有抗流感病毒作用的饮食品。
发明的效果
本发明提供以安全性高的木瓜提取物为有效成分、对流感病毒有较强作用的流感病毒吸附抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制剂、流感病毒感染细胞中的病毒复制抑制剂、病毒膜融合活性试验中的溶血抑制剂及流感病毒的包膜破坏剂。此外，作为本发明的有效成分的木瓜提取物的安全性高，所以可通过吸附、浸含、添加于口罩、空调滤网、衣服、湿纸巾、喷雾液等而作为流感病毒感染抑制用品广泛地在日常生活中应用。另外，也可以添加到口香糖、糖果、压片糖、饮料等饮食品中，作为具有抗流感病毒作用的饮食品进行日常的利用、摄取。本发明对流感病毒的感染预防和流感病毒引起的疾病的治疗有效。
附图的简单说明
图1表示木瓜提取物对病毒包膜的破坏活性。
图2表示木瓜提取物的吸附抑制活性和vRNA合成抑制活性、mRNA合成抑制活性、cRNA合成抑制活性。
图3表示木瓜提取物的溶血抑制活性。
实施发明的方式
作为本发明的原料的木瓜中，较好是使用其果实。
对于由上述植物的粉碎物获得本发明的提取物的方法无特别限定，加入水、甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇等低级醇、醚、乙酸乙酯、丙酮、甘油、丙二醇等有机溶剂中的1种或2种以上的混合溶剂，通过以往所采用的提取方法提取。但是，如果考虑到通过口服摄取本发明的抗流感病毒剂，从安全性的角度，较好是使用乙醇或其混合液提取。
作为提取条件，无特别限定，较好是在50～90℃1～5小时左右。过滤提取液并馏去提取溶剂后，在减压下进行浓缩或冷冻干燥，可以使用所得的制品。此外，也可以使用通过有机溶剂分配、柱色谱法等将这些提取物分离纯化而得的制品。
对于本发明的利用形态无特别限定，可通过向作为有效成分示例的植物提取物中添加溶剂、分散剂、制剂用载体、乳化剂、稀释剂、稳定剂等而制成散剂、片剂、含片剂、吸入剂、漱口剂、含漱剂、栓剂、注射剂等任意的制剂，给药途径可示例口服给药、呼吸道给药、静脉内给药、直肠给药、皮下给药、皮内给药等。这时，对成人的给药量对于各提取物较好是10～2000mg/天，但并不仅限于该值。作为提取物向各种制剂的添加量，根据该制剂的形态而不同，优选以0.001重量％以上、较好是约0.01重量％以上的比例添加。
此外，通过将本发明吸附、浸含、添加于口罩、空调滤网、衣服、湿纸巾、喷雾液等，可提供有利于流感预防的感染抑制用品。这些用途中的植物提取物的吸附、添加量根据该感染抑制用品的形态而不同，无法一概而论，优选以0.001～5重量％的比例添加。
此外，本发明的安全性高，所以可掺入如下的饮食品在日常生活中利用：例如口香糖、糖果、压片糖、软糖、巧克力、饼干等零食，冰淇淋、雪糕等冷饮，饮料，汤，果酱等饮食品。作为添加量，根据其利用形态和提取物的口味而不同，优选相对于饮食品以0.001～5重量％、较好是约0.01～1重量％的比例添加。
以下，例举实施例、试验例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于这些例子。
[实施例1]
(木瓜提取物的制备)
将木瓜的干燥粉碎物用50％EtOH提取后用Diaion HP-20分离，获得5个分离部分(CSD1～5)。将这些分离部分中活性最高的CSD3(40％EtOH洗脱部分)作为试样。
即，在加入有300g木瓜果实干燥物和3000ml 50％乙醇的烧瓶上安装回流冷凝器，回流1小时的同时进行提取。过滤分离所得的提取液，除去溶剂后冷冻干燥，从而获得69g提取物。
将上述木瓜50％乙醇提取物上Diaion HP-20(三菱化成工业株式会社(三菱化成)制)柱。以水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇的顺序洗脱。采集通过该乙醇浓度40％水溶液洗脱的成分(CSD3)。本分离部分的收量以干燥重量计为约8.6g。本品的采用香草醛-盐酸法得到的酚含量为54％[以(-)-表儿茶素为标准]，确认主要含有酚性物质。
[实施例2]
基于CSD3的病毒的吸附抑制效果、vRNA合成抑制效果、mRNA合成抑制效果、cRNA合成抑制效果通过提取病毒RNA以RT-PCR法分析。将CSD3按照达到50mg/ml的条件用50％乙醇溶解，所得的溶液作为试样原液。将试样原液用Tris葡萄糖生理盐水(TGS)适当稀释(稀释102至106倍)，将50μl这些试样稀释液与50μl病毒液(4×104至4×106PFU(噬菌斑形成单位)/ml)混合，在室温下反应10分钟。将0.1ml上述试样接种至添加有0.4ml TGS的马-达二氏犬肾(MDCK)细胞的单层培养(6孔板)，在室温下使病毒吸附30分钟，反应后除去上清，添加0.5ml培养液，在37℃培养0、1、2、3、4、6、8、12小时后，将感染细胞中的病毒基因组RNA通过硫氰酸胍溶解25％乙醇沉淀法回收。以下，对各试验法中的自RNA的cDNA合成法和PCR扩增法进行详细说明。
(流感病毒的吸附抑制试验及vRNA合成抑制试验)
吸附抑制试验及vRNA合成抑制试验中，从回收的0.5～5μg的RNA按照附带的说明书用Super Script III(英杰公司(インビトロジエン社))逆转录酶和T7cRNA(1-12)引物进行逆转录反应，合成vRNA的cDNA。将合成的cDNA作为模板，通过病毒(Udorn)NP基因特异性的1组寡核苷酸引物进行PCR的扩增。PCR用SYBR Premix taq聚合酶II(英杰公司)实施45个循环(5秒，95℃；34秒，64℃)。
所得的各孔的vRNA的拷贝数示于图2。CSD3未处理病毒的0小时的吸附拷贝数为6.7×108/孔，而通过1μg/ml的CSD3处理后为2.2×108/孔，吸附被抑制至约1/3。此外，CSD3未处理病毒的vRNA合成量为2.2×1010/孔(培养12小时后)，而通过1μg/ml的CSD3处理后为3.2×108/孔，vRNA合成量减少至约1/70。
(mRNA合成抑制试验)
基于CSD3的病毒的一次/二次转录抑制试验中，使用逆转录酶和T7T(18)VN引物进行逆转录反应，合成mRNA的cDNA。将合成的cDNA作为模板，通过NP基因特异性的1组寡核苷酸引物进行PCR的扩增。PCR用SYBR Premixtaq聚合酶II(英杰公司)实施45个循环(5秒，95℃；34秒，64℃)。
所得的各孔的mRNA的拷贝数示于图2。CSD3未处理病毒的mRNA合成量为2.6×1010/孔(培养12小时后)，而通过1μg/ml的CSD3处理后为4.3×107/孔，mRNA合成量减少至约1/600。
(cRNA合成抑制试验)
基于CSD3的病毒的复制阶段抑制试验中，使用逆转录酶和T7vRNA(1-13)引物进行逆转录反应，合成cRNA的cDNA。将合成的cDNA作为模板，通过NP基因特异性的1组寡核苷酸引物进行PCR的扩增。PCR用SYBRPremix taq聚合酶II(英杰公司)实施45个循环(5秒，95℃；34秒，64℃)。所得的各孔的cRNA的拷贝数示于图2。CSD3未处理病毒的cRNA合成量为9.7×106/孔(培养8小时后)，而通过1μg/ml的CSD3处理后为2.5×104/孔，cRNA合成量减少至约1/400。
[实施例3]
(溶血抑制试验)
将CSD3溶解于5％乙醇(5mg/ml)作为试样原液。将流感病毒(10HA至320HA)和CSD3(试样原液用TGS稀释102至106倍)，在室温下孵育10分钟。反应后，将通过CSD3处理了的流感病毒与10％鸡红细胞100μl混合，在室温下保持30分钟。离心分离收集红细胞，使沉淀悬浮于pH5.3的缓冲液(136mMNaCl、2.68mM KCl、10mM CH3COONa)。将悬浮液在37℃孵育30分钟后离心分离。测定上清的409nm的吸光度，将木瓜未处理病毒的吸光度设为1，评价添加木瓜时的溶血活性。
所得的结果示于图3。
[实施例4]
向病毒(16000HA)添加CSD3，室温下保持1小时。病毒粒子的电子显微镜观察通过采用2％乙酸铀的负染色法进行。
这些结果示于图1。
图1是表示木瓜提取物(CSD3)对病毒包膜的破坏活性的电子显微镜图像。
经CSD3处理的病毒的电子显微镜图像中，粒子表面的HA、NA刺突的外侧观察到约2nm宽的被认为是CSD3的附着层，且包膜有损伤部位，粒子内部浸透染色剂，内部结构可视化(图1(a))。
(结论)
木瓜提取物(CSD3)处理病毒显示出在一次转录前的阶段病毒增殖停止。还呈现出病毒的吸附·膜融合阶段的失活，RNA的合成被更大程度地抑制，提示存在与膜融合到一次转录的过程相关的某种缺陷。通过电子显微镜所呈现的包膜的损伤可能是导致该缺陷的原因。
使用实施例1中制成的木瓜提取物制备漱口剂、吸入剂、含片剂、喷雾液、口香糖、糖果、压片糖、饮料、粉末剂、片剂、含漱剂、软糖、巧克力、饼干、冰淇淋、雪糕、汤、果酱、湿纸巾、口罩。以下，作为实施例，示出其配方。
[实施例5]
漱口剂的配方
Figure BPA00001530475100081
[实施例6]
吸入剂的配方
Figure BPA00001530475100082
[实施例7]
含片剂的配方
Figure BPA00001530475100083
[实施例8]
喷雾液的配方
Figure BPA00001530475100091
[实施例9]
口香糖的配方
Figure BPA00001530475100092
[实施例10]
糖果的配方
Figure BPA00001530475100093
[实施例11]
压片糖的配方
Figure BPA00001530475100094
[实施例12]
饮料的配方
Figure BPA00001530475100101
[实施例13]
粉末剂的配方
Figure BPA00001530475100102
[实施例14]
片剂的配方
Figure BPA00001530475100103
[实施例15]
含漱剂的配方
Figure BPA00001530475100104
Figure BPA00001530475100111
[实施例16]
软糖的配方
Figure BPA00001530475100112
本申请要求基于2009年9月24日提出申请的日本专利申请2009-218643号和2009年12月8日提出申请的日本专利申请2009-278462号的优先权，引用其内容作为本申请的一部分。

Claims (9)

1.抗流感病毒剂，其特征在于，以木瓜(Chaenomeles sinensis，Pseudocydonia sinensis)提取物为有效成分。
2.抗流感病毒剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
3.流感病毒吸附抑制剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
4.流感病毒感染细胞中的病毒mRNA合成抑制剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
5.流感病毒感染细胞中的病毒vRNA合成抑制剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
6.流感病毒感染细胞中的病毒cRNA合成抑制剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
7.病毒膜融合活性试验中的溶血抑制剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
8.流感病毒的包膜破坏剂，其特征在于，将木瓜用50％乙醇水溶液提取，对该提取液进行柱色谱分离而纯化，以所得的提取物为有效成分。
9.饮食品，其特征在于，含木瓜提取物，具有抗流感病毒作用。
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