CN102565423A - 一种定量检测氮末端脑钠肽的荧光免疫层析方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测急性心肌梗塞标志物氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析方法及其试剂盒。本发明的定量检测氮末端脑钠肽的荧光免疫层析方法利用量子点优良的荧光特性，结合双色标记技术和免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件的基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明试剂盒对NT-proBNP进行定量检测，适用于全血、血清和血浆样本的检测，可为心脑血管疾病诊断提供参考，可广泛用于基层医院和诊所。

Description

一种定量检测氮末端脑钠肽的荧光免疫层析方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析方法及其试剂盒。

背景技术

1988年日本学者Tetsuji Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为BNP1。以后的研究表明，不只是BNP这一种多肽，而是有一组多肽在生物进化的过程中逐渐发展产生(在人类和脊椎动物至少包括ANP、BNP、CNP和DNP等)，称为利钠肽(NP)家族。其功能是维持循环系统的容量、渗透压和压力调节的稳态。大量基础和临床研究表明，血液中的BNP水平在心力衰竭时显著升高，作为一种新的生物标记物，对心力衰竭的诊断、病程进展的监测、对疗效和预后评估具有重要的价值，还可用于急性心肌梗塞患者在治疗后对其心室功能的恢复状况进行评估。

目前用于临床检测的BNP包括BNP和NT-proBNP两种。虽然两者有相同的生物学来源，但生物学效应和临床意义不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体(pre-proBNP)，该肽的一个26氨基信号肽被立即去除，形成含108个氨基酸的的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和含有32个氨基酸、有活性的B型利钠肽(BNP)。BNP的清除主要通过与BNP清除受体结合，而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，因此其血浓度受肾功能影响大于BNP。BNP半衰期短(22分钟)，体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期较长(120分钟)，体外稳定性强，在心衰患者中的浓度较BNP高，与BNP相比更有利于心衰的诊断。

BNP和NT-proBNP检测在本世纪初先后进入我国，十年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。

测定NT-proBNP的主要方法有放射免疫法、电化学发光法、酶联免疫法和胶体金免疫层析法等；放射免疫法采用夹心法测定血浆中NT-proBNP浓度，此法虽较敏感、准确、易于操作，但存在着放射线辐射和污染等问题，且不适合心脏病的急性诊断和小样本检测。电化学发光法较放射免疫法更为敏感、准确，精密，但成本昂贵，需要配套化学发光仪才能检测。酶免疫法(ELISA)存在着操作繁琐，检测耗时长等缺点。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。

中国专利申请号CN201010241048.3公布了一种免疫层析试纸条的测试使用及应用这种测试方法的NT-proBNP快速定量试剂。其采用上转发光材料即UCP作为生物标记物，标记物上结合了NT-proBNP抗体。然而上转换发光材料激发效率较低，需要功率较高的光源激发，且配套的仪器价格昂贵。

中国专利申请号CN200720140931.7公布了一种脑钠肽颜色颗粒诊断试纸。同时专利CN200720140928.5，公布了一种氮末端脑钠肽前体/C-反应蛋白/肌钙蛋白I诊断试纸，利用快速免疫层析法，定性检测临床标本(全血/血清/血浆)中氮末端脑钠肽前体/C-反应蛋白/肌钙蛋白I。其利用金属胶体颗粒(如胶体金)或标记颗粒(如荧光染料颗粒)，定性检测3中标志物。该方法具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。

美国专利US60/576327和60/592202，及其在中国申请的专利200580025931.6都对胶体金免疫层析检测进行了论述。但相比于荧光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄等缺陷。

因此，研发检测成本低、快速、高灵敏度检测方法及试剂的制备方法，并在国内普及，具有巨大的发展潜力和应用前景。

量子点(quantum dots，QDs)又叫半导体纳米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素组成的稳定的、尺寸介于1～20nm之间的纳米微晶体。其具有许多优良的光学特性：(1)量子点的荧光发射光谱窄而对称，荧光发射波长可调，且覆盖范围可从紫外到近红外区。(2)量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记。(3)量子点具有较强的光学稳定性。CdSe/ZnS量子点的光稳定性是罗丹明6G的100倍以上。(4)量子点摩尔吸光系数可以高达10⁶L/(mol·cm)，且荧光量子产率高(50～80％)，因而可产生较强荧光信号。(5)量子点斯托克斯位移较大，荧光寿命长(20～50ns)，使得信号可以显著区分于背景和其它荧光基团。量子点是一种理想的应用于超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针。将量子点与抗体结合可应用于荧光免疫分析和检测。

针对现有NT-proBNP检测方法的不足和缺陷，量子点荧光定量检测方法利用量子点多波长激发、高强度荧光强度、发射峰窄、峰形对称、发光稳定性好的荧光特性，可提供一种量子点标记快速免疫层析试纸条的检测方法，对NT-proBNP进行定量检测。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有技术中检测NT-proBNP灵敏度低、线性范围窄、定量不准确和仪器昂贵等缺点，提供了一种定量检测NT-proBNP的荧光免疫层析方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析方法，包括以下步骤：

步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将氮末端脑钠肽NT-proBNP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550～1300nm；

步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550～1300nm，在层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应NT-proBNP的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；

步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现NT-proBNP的定量检测。

本发明提供的一种定量检测NT-proBNP的荧光免疫层析方法，是一种以量子点为荧光信号的，采用双色标记技术，在免疫层析试纸条上实现NT-proBNP快速灵敏检测的方法。

本发明定量检测NT-proBNP的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样本的检测。由于量子点荧光受激发光干扰很小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的10～1000倍。

本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用将NT-proBNP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，其中特异性抗体为对应NT-proBNP的一个或多个抗原表位的抗体。

本发明中的化学交联为：当量子点表面有活性基团，可与抗体或质控分子直接反应时，不需用化学交联剂，反之用化学交联剂把抗体修饰到量子点表面。

在本发明的实施例中采用化学交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的方法为：利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、戊二醛等交联剂将量子点表面的官能团(如羧基、氨基)与蛋白质分子(如抗原、抗体等)表面的官能团(如氨基、羧基、醛基等)连接。

作为优选，在本发明的一个实施例中，采用EDC/NHS交联法对量子点进行修饰。其中EDC/NHS交联法对量子点进行蛋白质分子修饰的一般步骤为：将量子点溶液与EDC和NHS混合，然后加入一定量的蛋白质，以缓冲液为反应介质，培育4h，加入L-甘氨酸封闭，以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白质修饰的量子点荧光纳米颗粒。

生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选，在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统的结合方式对标记物进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用。具体为：以EDC将链霉亲和素连接到量子点表面，生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，把蛋白质分子连接到量子点表面。

为了提高与背景的区分度，本发明选用发射光波长为550～1300nm的量子点。因为在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度NT-proBNP检测时产生一定的影响，故可优选发射波长大于550nm的量子点。另外层析膜、底板和扣卡在近红外区域(750～1300nm)荧光强度极弱，并结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750～1300nm)可进一步提高灵敏度。

本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP组成的组中选择的，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

质控分子修饰的量子点与NT-proBNP抗体修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点。但在本发明中，为了减弱质控分子修饰的量子点对定量带及背景信号的影响，采用双色标记技术，即选用两种发射波长不同的量子点分别标记质控分子和抗体。

作为优选，在本发明的实施例中，使用有机相方法合成570nm、600nm和650nm的CdSe/ZnS，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧光无明显变化；使用水相方法合成900nm的InAs。

作为优选，在本发明的一个实施例中，标记垫中NT-proBNP的抗体修饰的量子点发射波长为650nm，质控分子修饰的量子点发射波长为570nm。

作为优选，在本发明的另一个实施例中，标记垫中NT-proBNP的抗体修饰的量子点发射波长为900nm，质控分子修饰的量子点发射波长为600nm。

为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱荧光层析膜、低荧光底板和低荧光扣卡，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。

作为优选，在本发明实施例中，底板(8)为黑色，表面附有不干胶，且层析膜(4)、扣卡、底板(8)和不干胶均不含有荧光剂。如扣卡含有润湿孔(13)时，则润湿孔可在层析膜的近样品垫一端或在近吸水垫一端。

为区别于胶体金免疫层析试纸条的检测带，本发明中层析膜上固定NT-proBNP抗体的区域称为定量带，用于准确定量检测NT-proBNP的浓度，并以质控带作内质控校正定量带，以减弱样本、环境因素等的影响。

本发明的免疫层析试纸条可采取常规的层析方式，作为优选，本发明采用预润免疫层析进行NT-proBNP定量检测。其中预润免疫层析试纸条有直接和间接预润两种，在一个实施例中，直接预润免疫层析试纸条由样品垫(1)、过滤膜(2)、标记垫(3)、层析膜(4)、吸水垫(7)和底板(8)组成，如图1所示。在标记垫上固定有NT-proBNP的特异性抗体修饰的量子点，以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有两条定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应NT-proBNP的与上述标记垫中特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体。并且通过增加定量带的条数可扩大检测范围，避免HOOK效应。

在本发明的另一个实施例中，间接预润免疫层析试纸条由样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)组成，如图2所示。

本发明实施例中，发明人分别选用的样本为全血和血清，且样本进一步包含血浆。当样本为全血时，荧光免疫层析试纸条还包括在标记垫与层析膜之间设置的过滤膜，用于凝固、过滤红细胞，该过滤膜可分别与样品垫和标记垫直接毛细作用接触，如图1所示，也可与标记垫和层析膜直接毛细作用接触。

本发明实施例采用预润免疫层析方法对样本中的NT-proBNP进行定量检测。其中预润免疫层析为：加入一定体积的缓冲液到层析膜上，润湿一定时间后，把样本加入样品垫中，样本沿层析膜向吸水垫方向流动。预润的目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均匀通过层析膜，且减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样本流动速度，从而增加特异性结合。其中缓冲液体积一般为20～80μl，润湿时间一般为10秒～2分钟，而样本层析时间一般为8～25分钟。

本发明的预润免疫层析可为将缓冲液直接或间接滴加于层析膜。而将缓冲液间接滴加于层析膜时，荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。缓冲液通过润湿垫到达层析膜。

本发明采用的缓冲液为pH 7.2～11的碱性缓冲液，且该缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂。其中表面活性剂可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为优选，本发明实施例中，使用缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH 9.0的磷酸缓冲液。

本发明的检测用荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块和软件系统。其中激发光源模块包含光源和聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，波长选择300～400nm之间或500～600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包含图像传感器或光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号，经过滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，转换为数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光强度有一定相关性，主要影响因素有温度、湿度、基质等。

本发明检测结果的判定方法为：如果质控带荧光信号强度值超过荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效的前提下，定量带荧光强度与质控带比值越高，表示NT-proBNP浓度越高，反之越低。

本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(C)。校正荧光信号强度为F＝αF_定量带/F_质拉带，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中NT-proBNP浓度。

本发明还提供了一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析试剂盒，包括缓冲液、扣卡(11)和荧光免疫层析试纸条，如图3所示。该试剂盒采用间接预润免疫层析方法。扣卡(11)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(12)、视窗(14)和润湿孔(13)，且具低荧光特性，优选为不含荧光剂。

荧光免疫层析试纸条结构如图2所示，其包含样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)。层析膜(4)包含质控带(5)和定量带(6)。其中样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上，样品垫(1)连接于标记垫(3)，且位于上样孔(12)的下方，标记垫(3)连接于层析膜(4)，层析膜(4)上固定有两条质控带(5)和两条定量带(6)，且质控带(5)位于定量带(6)的两侧，层析膜(4)位于视窗(14)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(13)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(7)。

进行全血样本层析时，试纸条还包括过滤膜(2)，具体结构如图1所示，其中试纸条包含样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、吸水垫(7)、底板(8)和过滤膜(2)。过滤膜(2)与样品垫(1)和层析膜(4)毛细作用接触，即过滤膜可连接于样品垫(1)与标记垫(3)之间，也可连接于标记垫(3)与层析膜(4)。

本发明构建的预润免疫层析试纸条，其特征是，增加润湿垫(9)和连接垫(10)，其中润湿垫分别与层析膜(4)和连接垫(10)毛细作用接触，用于减小滴加缓冲液时，缓冲液对层析膜的冲击，以润湿层析膜(4)，并减少非特异性吸附。

而连接垫(10)分别与润湿垫(9)和吸水垫(7)毛细作用接触，具有缓慢的吸水速度，以减少润湿时的吸水量，促使缓冲液充分润湿层析膜(4)，当加样本层析时，吸水垫(7)可通过连接垫(10)吸水，促使样本层析。

试纸条的层析膜(4)具有弱荧光特性，优选不含荧光剂，其荧光噪声在大于550nm时很弱，以减少对低浓度目标物检测的影响。

本发明的主要优点如下：

1)本发明定量检测NT-proBNP的荧光免疫层析方法采用量子点作为特异性抗体的标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。并优选了550～1300nm的量子点，以提高与背景的区分度。

2)本发明试剂盒的组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，以减少对量子点荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。

3)本发明采用荧光定量仪检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带校正定量带荧光信号强度，进而依据荧光定量仪获取的标准曲线实现NT-proBNP的定量检测。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(C)。校正荧光信号强度为F＝αF_定量带/F_质控带，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样本，依据标准曲线获得样本中NT-proBNP浓度。

4)本发明可利用量子点双色标记技术，减少质控分子对NT-proBNP检测的影响，也可减少质控分子修饰的量子点对定量带和层析膜背景的影响，方法简单快速，灵敏度高，有利于高灵敏定量检测。

5)本发明可利用预润免疫层析技术，增强特异性结合，减少非特异性吸附，增强试剂盒的检测灵敏度，有利于样品中NT-proBNP含量极低时的准确定量。

6)本发明方法简单、快速、准确、成本低，且灵敏很高。与传统的化学发光法和酶联免疫法检测肌酸激酶同工酶相比，具有操作简便、快速、不需昂贵的检测设备，适合单人份或小批量检测等优点；与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。

附图说明

图1为直接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为过滤膜，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板；

图2为间接预润免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，3为标记垫，4为层析膜，5为质控带，6为定量带，7为吸水垫，8为底板，9为润湿垫，10为连接垫；

图3为荧光免疫层析试剂盒示意图，其中11为扣卡，12为上样孔，13为润湿孔，14为视窗，5为质控带，6为定量带。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及试剂盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和试剂盒进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的技术方案为：

步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将氮末端脑钠肽NT-proBNP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550～1300nm；

步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550～1300nm，在层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应NT-proBNP的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；

步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现NT-proBNP的定量检测。

本发明荧光免疫层析的原理和检测方法为：采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测人样本(全血、血清或血浆)中氮末端脑钠肽(NT-proBNP)的含量。检测时，首先向润湿孔中滴加缓冲液，然后将样本滴加到上样孔中，样本先与标记垫中的量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带和质控带。若样本中含有NT-proBNP，则与量子点表面的NT-proBNP抗体相结合，当层析至定量带时，会被预先包被于该条带的抗体捕获，从而构成双抗体夹心复合物。光源激发下，采用荧光定量仪获取定量带和质控带的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而分析样本中NT-proBNP浓度。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：以化学交联法将抗体修饰于量子点并采用直接预润免疫层析对NT-proBNP的定量检测

(一)量子点与抗体的修饰

向pH 7.4磷酸缓冲液中加入60pmol发射波长为650nm的量子点、10μg EDC和15μg NHS溶液和10～30μg羊抗人NT-proBNP单抗溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入1mg甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到NT-proBNP抗体修饰的量子点。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点。其中NT-proBNP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为650nm，羊抗兔抗体修饰的量子点的荧光发射波长为570nm。

(二)试剂盒的构建

以摩尔比1∶1的比例混合均匀上述两种量子点标记物，其中混合液中含有1～15％蔗糖、0.01～2％牛血清白蛋白(BSA)和吐温20、吐温80、曲拉通X-100等表面活性剂，其中表面活性剂含量在0.01～1％之间，然后均匀喷涂在标记垫上，37℃干燥后密封，4℃下保存。

以划膜仪在弱荧光层析膜上划四条平行条带，条带间隔5mm，条带宽都约为1mm。其中两侧的两条为质控带，中间两条为定量带。质控带上喷涂兔免疫球蛋白(兔IgG)，浓度分别为0.2～1mg/ml和1～3mg/ml；定量带喷涂NT-proBNP多抗，浓度分别为0.2～1mg/ml和0.5～2mg/ml，其中定量带喷涂的NT-proBNP多抗与量子点标记的NT-proBNP单抗的抗原决定簇不同。37℃干燥后密封，4℃下保存。

在黑色底板上，依次粘贴上层析膜(长30cm，宽2.5cm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、过滤膜(长30cm，宽16mm)、样品垫(长30cm，宽16mm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成荧光免疫层析试纸大板，示意图如图1所示。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中组装成不含缓冲液的免疫层析试剂盒，干燥后密封，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒，4℃避光保存。

(三)样本检测

用正常人全血作稀释液，将NT-proBNP标准品配制系列浓度标准品溶液如下：0.025ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.6ng/mL、3.2ng/mL和6.4ng/mL。

缓冲液为含有0.05～0.2％BSA和0.05～1％Tween-20的pH9.0磷酸缓冲液。层析时先将50μl缓冲液滴加到层析膜上，1分钟后，将100μl阴性全血或标准品溶液滴加到上样孔中，13分钟后以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。

将50μl缓冲液滴加到层析膜上，1分钟后，将100μl全血样本滴加到上样孔中，13分钟后以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中NT-proBNP的浓度。

结果表明，其最低检测限为0.05ng/mL，最低定量限为0.1ng/mL，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心血管疾病诊断提供参考。

实施例2：以生物素-亲和素法将抗体修饰于量子点并采用间接预润免疫层析对NT-proBNP的定量检测

(一)量子点合成及修饰

根据实施例1的方法，制备链霉亲和素修饰的量子点。同理得到羊抗兔抗体修饰的量子点。

将NT-proBNP单抗用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0)稀释到1mg/ml，用1ml二甲亚砜(DMSO)溶解1mg N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHSB)，取1ml单抗溶液加入20～120μl NHSB溶液，室温下反应4小时。加入1mol/L NH₄Cl，在室温下搅拌10分钟。以超滤离心纯化，以除去游离的生物素，得到生物素化的单抗。

以1∶3～1∶12的比例混合链霉亲和素修饰的量子点和生物素化的单抗，得到NT-proBNP单抗修饰的量子点。其中到抗NT-proBNP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为900nm，羊抗兔抗体修饰的量子点的荧光发射波长为600nm。

(二)试剂盒的构建及样本检测

根据实施例1的方法把量子点标记物喷涂于标记垫，把抗体和质控分子喷涂于层析膜的定量带和质控带。

在黑色底板上，依次粘贴上层析膜(长30cm，宽2.5cm)、标记垫(长30cm，宽8mm)、样品垫(长30cm，宽16mm)、连接垫(长30cm，宽10mm)、润湿垫(长30cm，宽10mm)和吸水垫(长30cm，宽16mm)。膜与膜之间都要紧密相连，制成荧光免疫层析试纸大板，示意图如图2所示。用切条机将粘贴好的试纸大板纵向切成4mm宽的试纸条，放入低荧光扣卡中组装成不含缓冲液的免疫层析试剂盒，如图3所示，干燥后密封，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒，4℃避光保存。

(三)样本检测

根据实施例1进行标准品配制。

缓冲液为含有0.05～0.2％BSA和0.05～1％Tween-20的pH9.0磷酸缓冲液。层析时先将50μl缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100μl阴性血清或标准品溶液滴加到上样孔中，13分钟后以荧光定量仪检测(每个样本分别用3个试纸条测定3次，取平均值)，绘制标准曲线。

将50μl缓冲液滴加到润湿孔中，1分钟后，将100μl血清样本滴加到上样孔中，13分钟后以荧光定量仪检测，依据标准曲线获得样本中NT-proBNP的浓度。

结果表明，其最低检测限为0.025ng/mL，最低定量限为0.05ng/mL，在定量检测范围内，相关系数R²＞0.99，未出现HOOK效应，且批内与批间重复性均较好，可为心血管疾病诊断提供参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (17)

1.一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将氮末端脑钠肽NT-proBNP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550～1300nm；

步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550～1300nm，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应NT-proBNP的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；

步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带荧光信号强度，进而实现NT-proBNP的定量检测。

2.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述抗体修饰的量子点的发射波长为650nm，步骤2)所述质控分子修饰的量子点的发射波长为570nm。

3.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述抗体修饰的量子点的发射波长为900nm，步骤2)所述质控分子修饰的量子点的发射波长为600nm。

4.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤1)所述量子点为单一化合物形成的量子点或几种化合物组成的复合量子点。

5.根据权利要求4所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述化合物为选自ZnS、CdS、HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe、InAs、InP中的任意一种或几种，且可掺杂Cu、Mn和Hg。

6.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤3)所述层析膜在大于550nm处荧光很弱或不含荧光剂。

7.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤3)所述底板为黑色，表面附有不干胶，且两者均不含荧光剂。

8.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤3)所述荧光免疫层析试纸条还包括能使样本中液体与细胞分离的过滤膜。

9.根据权利要求1所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，步骤4)所述免疫层析为预润免疫层析，其中预润免疫层析为先以缓冲液预润层析膜，再加入样本到样品垫中，样本流经定量带和质控带后，进行荧光定量检测。

10.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述预润层析膜为将缓冲液直接滴加于层析膜。

11.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，当所述预润层析膜为将缓冲液间接滴加于层析膜时，步骤3)所述荧光免疫层析试纸条还包括润湿垫和连接垫，其中润湿垫分别与层析膜和连接垫以毛细作用接触，连接垫分别与润湿垫和吸水垫以毛细作用接触。

12.根据权利要求9所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 7.2～11的碱性缓冲液。

13.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性剂的碱性缓冲液。

14.根据权利要求12所述的荧光免疫层析方法，其特征在于，所述碱性缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH9.0的磷酸缓冲液。

15.一种定量检测氮末端脑钠肽NT-proBNP的荧光免疫层析试剂盒，包括缓冲液、扣卡(11)和荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述扣卡(11)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(12)、视窗(14)和润湿孔(13)；所述荧光免疫层析试纸条包括样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)、吸水垫(7)和底板(8)，其中样品垫(1)、标记垫(3)、层析膜(4)、润湿垫(9)、连接垫(10)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上，样品垫(1)连接于标记垫(3)，且位于上样孔(12)的下方，标记垫(3)连接于层析膜(4)，层析膜(4)上固定有两条质控带(5)和两条定量带(6)，且质控带(5)位于定量带(6)的两侧，层析膜(4)位于视窗(14)的下方，层析膜(4)连接于润湿垫(9)，且润湿垫(9)位于润湿孔(13)的下方，润湿垫(9)连接于连接垫(10)，连接垫(10)连接于吸水垫(7)。

16.根据权利要求15所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述荧光免疫层析试纸条还包括过滤膜(2)，其中所述过滤膜(2)分别与样品垫(1)或层析膜(4)毛细作用接触。

17.根据权利要求15所述的荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述扣卡(11)具有低荧光特性或不含荧光剂。

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