CN102558288A - 岩大戟内酯型化合物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
以甜菊苷为原料，通过系列化学反应，有效地合成出一种具有通式(I)的岩大戟内酯(Jolkinolide)类化合物，给出详细的制备方法，得到的典型化合物，经过对多种典型的肿瘤细胞株体外筛选，证明具有较好的细胞毒活性，可作为抗肿瘤药物的苗头化合物。本发明的提供的化合物结构类型通式(I)如下。
Description
技术领域：
本发明涉及岩大戟内酯(Jolkinolide)类似物的化学合成方法，及其生物活性。
技术背景：
大戟属(Euphorbia)为大戟科(Euphorbiaceae)植物中最大的一属，全世界约有2000余种，我国约有80余种，且新种仍在被发现。该属植物资源丰富，适应性强，分布于不同的生态环境，从热带到亚热带，陆地到沙漠均有分布。《中药大辞典》和《中草药汇编》记载该属植物中分别有32种和35种入药，民间常用作通便、利尿、治疗水肿、结核、牛皮癣、疥疮和无名肿毒，尤其是除疣、抗肿瘤等。利用其毒性，古人用作箭毒，南美印第安人和东南亚部分地区的人们用作毒鱼植物来捕鱼，在南非作为廉价的蜂食原料。(Evans，F.J.；Schmidt，R.J.Phytochemistry 1976，15(2)，333-335；Mitsuru，H.；Hajime，O.；Yoshinori，O.Agric.Biol.Chem.1980，44，1351-1356；Masahiro，T.；Hiromichi，S.Agric.Biol.Chem.1989，53，425-430.)
狼毒是我国传统中药材，为大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud的根。始载于《神农本草经》，其性辛、味平。具有逐水祛痰和破积杀虫的功效，主治水肿腹胀，痰食虫积，心腹疼痛，慢性气管炎，咳嗽，气喘，淋巴结、皮肤、骨、副睾等结核，疥癣，痔瘘等。现代医学和中医学研究均发现其有抗肿瘤作用。有许多学者已从狼毒大戟原生植物中分离到多种类型的化合物，主要为二萜类、鞣质类、甾醇类等，其中二萜类化合物岩大戟内酯(Jolkinolide A，B，C，D，E)是狼毒大戟的主要成分，具有多种生物活性，如：抗肿瘤、抗菌消炎以及除虫活性，其中抗肿瘤活性较好。(Fred J.Evans，Richard J.Schmidt.Phytochemistry，1976，15(2)：333-335；Liliana Betancur-Galvis，Emilio Palomares，J.Alberto Marco.Journal of Ethnopharmacology，2003，85(2-3)：279-282.)
药理研究发现，Jolkinolide B分别对人的慢性髓细胞样白血病K562细胞株、食道癌Eca-109细胞株和肝癌HepG2细胞株均有抑制细胞增殖活性，其IC50值分别为12.1ug/ml、＞50.0ug/ml和23.7ug/ml。实验发现其作用活性是剂量依赖性和时间依赖性的，如对慢性髓细胞样白血病K562细胞株作用24h、48h和72h后的IC50值分别为12.1±2.55ug/ml、11.3±0.70ug/ml、10.7±2.01ug/ml。进一步研究其作用机制表明，当用15ug/ml的Jolkinolide B作用这些癌细胞24h后，发现绝大部分K562细胞株停止在G1期，细胞核内的染色质发生收缩和片段碎裂(细胞发生凋亡的标志)，细胞膜收缩且与相邻细胞分离，细胞微绒毛结构消失，细胞质内出现空腔和水泡的结构，细胞内微观骨架结构被破坏，最终发生凋亡。研究发现，Jolkinolide B对激素依赖型的LNCaP细胞的细胞毒性作用最显著，有促进前列腺上皮细胞发生神经内分泌分化的生物活性 ，抑制前列腺中激素依赖型的细胞内蛋白质的合成，激活capsase-3凋亡通路，进而抑制癌细胞增殖。(Huiying，L.；Aiqin，W.Canadian journal of physiology and pharmacology 2006，84，959-965；Liu，W.K.；Ho，J.C.K.；Qin，G.；Che，C.-T.Biochemical Pharmacology 2002，63，951-957.)
Jolkinolide D有抑制肿瘤细胞转移的生物活性，研究测试Jolkinolide D对非白血性白血病HL-60细胞的作用，发现Jolkinolide D诱导HL-60细胞细胞凋亡的活性同抗肿瘤药物依托泊苷相当，1ug/ml的Jolkinolide D即能抑制92％的肿瘤细胞扩散，即使在0.1ug/ml的剂量时其活性也与1ug/ml的阿霉素(能抑制57％的肿瘤细胞扩散)相当。Jolkinolide D对鼠非白血性白血病P388细胞和人的肠癌DLD-1细胞的也显示细胞毒性作用，其作用IC50值分别是0.16ug/ml、3.0ug/ml。(Kigoshi，H.；Ichino，T.；Yamada，K.；Ijuin，Y.；Makita，S.F.；Uemura，D.Chemistry Letters 2001，6，518-519；Sakakura，A.；Takayanagi，Y.；Shimogawa，H.；Kigoshi，H.Tetrahedron 2004，60，7067-7075.)
近年来国内外多有关于岩大戟内酯类化合物的抗肿瘤作用靶点的研究报道。有报道其作用靶点为肿瘤细胞的Nuclear factor-κB激酶(IKK)，NF-κB信号通路对于肿瘤细胞的存活，生长，代谢，凋亡至关重要。而其主要的信号启动因子为IKK激酶，IKK激酶通过磷酸化NF-κB蛋白，使其进入肿瘤细胞核调节相关的肿瘤基因的表达。研究发现岩大戟内酯类化合物能特异地抑制肿瘤细胞的IKK去磷酸化作用，从而抑制其激活，阻断NF-κB信号通路，进而阻滞肿瘤细胞的恶性增殖和分化，促使其发生凋亡。(Ferreira M.-J.U.G.Nora，Madureira Ana M.，Molnar，Joseph.Anticancer Research 2005，25(5)：3259-3262；Shou-Sheng Yan，Ying Li，Ying Wang.Mol Cancer Ther 2008；7(6)：1523-1532)
也有文献报道该类化合物对肿瘤细胞JAK/STAT信号通路有抑制作用。当细胞因子与其配体结合，JAK激酶被激活，其能磷酸化STATs家族的蛋白，磷酸化后的STATs家族的蛋白通过磷酸酪氨酸上的巯基相互作用形成二聚体或者异二聚体。这些二聚体将转移到肿瘤细胞核中调节相应的靶基因的表达。研究发现岩大戟内酯类化合物能与JAK激酶形成聚合体，阻断JAK/STAT信号通路，促使肿瘤细胞发生凋亡。(Ying Wang，Xiuquan Ma，Shousheng Yan，Shensi Shen，Cancer Res 2009，69(18)：7302-7310)
与大多数有生物活性的天然产物类似，此类化合物在原生植物中含量较低(一般中药材中含量＜0.01％)，因此国内外一些学者对其天然产物结构的化学合成的工作进行了许多尝试。例如20世纪80年代日本的药物化学家Katsumura，S.，Nakano，T.等对岩大戟内酯类化合物的全合成进行了探索，其分别以β-紫罗兰酮和松香酸等为起始原料，通过系列反应实现了部分岩大戟内酯天然产物及类似物的合成。近年来也有该类化合物的合成及其立体化学研究的 报道，但更多的是结合生物技术的研究，通过生物发酵技术，利用生物酶的催化转化作用获得与天然产物结构相同或相似的化合物。(Shigeo Katsumura，Akihiko Kimura，Sachihiko Isoe..Tetrahedron 1989，45(5)：1337-1346；Takahiro Miyake，Hideo Kigoshi，Hiroyuki Akita.Tetrahedron：Asymmetry 2007，18(24)：2915-2922.)
发明内容：
本发明以甜菊苷为起始原料，通过系列化学反应合成出系列岩大戟内酯(Jolkinolide)类化合物，并测试其化合物的药理活性，证明此类化合物具有较强的抗肿瘤活性。
本发明的提供的化合物结构类型通式(I)如下：
通式(I)结构中，
R1结构可进一步表述为：COOR7，CONR7R7，(CH2)nXR7(其中，n＝1～8)，XR7。
X为O，NH，NR7，S。
R7可表述为：氢，羟基，直链或支链的烷基(C1～C8)，葡萄糖基，或2～5个以不同方式(如：1，2-、1，4-)连接的葡萄糖基，直链或支链的烷氧基(C1～C8)，直链或支链的烷酰基(C1～C8)，直链或支链的卤烷基(C1～C8)，直链或支链的卤烷氧基(C1～C8)，直链或支链的卤烷酰基(C1～C8)，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳香氧基，取代或未取代的芳香酰基，取代或未取代的芳杂基，取代或未取代的芳杂氧基，取代或未取代的芳杂酰基。
R2可表述为：氢，羟基，直链或支链的烷基(C1～C8)、直链或支链的烷(C1～C8)氧基(或氨基、或羰基、或氨基羰基)，直链或支链的卤代烷(C1～C8)氧基(或氨基、或羰基、或氨基羰基)，烷基(C1～C3)直链或支链的烷基(C1～C8)醚、烷基(C1～C3)氨基直链或支链的烷(C1～C8)、甲基、乙基葡萄糖基、葡萄糖基或2～5个以不同方式(如：1，2-、1，4-)连接的葡萄糖基。
R3、R4与R5、R6可以相同或不同，可表述为：氢，羟基，卤素，羰基，羧基。R3、R4或R5、R6之间，可脱水形成环氧结构，或烯烃、烯醇、烯胺等结构。
上述的烷基(C1～C8)是指1～8个碳的直链或支链的烷基。例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。
上述烷氧基(C1～C8)是指1～8个碳的直链或支链的烷氧基。例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、新戊氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基等。
上述的烷酰基(C1～C8)是指1～8个碳的直链或支链的烷酰基。例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、仲丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、庚酰基、辛酰基等。
上述的卤烷基(C1～C8)是指含有卤素的1～8个碳的直链或支链的烷基。例如氯甲基、1-氯乙基、1-氯丙基、1-氯异丙基、1-氯丁基、1-氯异丁基、氯叔丁基、1-氯仲丁基、1-氯戊基、1-氯新戊基、1-氯己基、1-氯庚基、1-氯辛基等。
上述的卤烷氧基(C1～C8)是指含有卤素的1～8个碳的直链或支链的烷氧基。例如1-氯乙氧基、1-氯丙氧基、1-氯异丙氧基、1-氯丁氧基、1-氯异丁氧基、氯叔丁氧基、1-氯仲丁氧基、1-氯戊氧基、1-氯新戊氧基、1-氯己氧基、1-氯庚氧基、1-氯辛氧基等。
上述的卤烷酰基(C1～C8)是指含有卤素的1～8个碳的直链或支链的烷酰基。例如氯乙酰基、1-氯丙酰基、1-氯异丙酰基、1-氯丁酰基、1-氯异丁酰基、氯叔丁酰基、1-氯仲丁酰基、1-氯戊酰基、1-氯新戊酰基、1-氯己酰基、1-氯庚酰基、1-氯辛酰基等。
上述取代的芳基是指含有1～5个取代基的芳环。这些取代基可以为氯，硝基，甲氧基，甲基，甲酰基等。
上述取代的芳香氧基是指含有1～5个取代基的芳香氧环。这些取代基可以为氯，硝基，甲氧基，甲基，甲酰基等。
上述取代的芳香酰基是指含有1～5个取代基的芳香酰环。这些取代基可以为氯，硝基，甲氧基，甲基，甲酰基等。
上述取代的芳杂基是指含有1～5个取代基的芳杂环。这些取代基可以为氯，硝基，甲氧基，甲基，甲酰基等。
上述取代的芳杂氧基是指含有1～5个取代基的芳杂氧环。这些取代基可以为氯，硝基，甲氧基，甲基，甲酰基等。
上述取代的芳杂酰基是指含有1～5个取代基的芳杂酰环。这些取代基可以为氯，硝基，甲氧基，甲基，甲酰基等。
部分代表性的化合物的结构为：
Ia：19-苄氧羰基岩大戟内酯A(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide A)
Ib：19-苄氧羰基岩大戟内酯B(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide B)
Ic：19-甲氧亚甲氧基岩大戟内酯E(19-Methyloxomethenoxo Jolkinolide E)
Id：19-羟基岩大戟内酯E(19-hydroxyl Jolkinolide E)
典型合成方法(途径)如下：
具体实施方式：
以下结合具体事例说明本发明典型化合物的制备方法。
实例1：19-苄氧羰基岩大戟内酯A(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide A)
(1)将108g甜菊苷原料投入到10L的三颈烧瓶中，加入水，再加入100g的高碘酸钠。室温搅拌5～10h，然后加入200g 90％的KOH，加热回流1～3h后，待反应液温度降至室温。加入冰乙酸调PH值至7，有白色絮状物析出。乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠洗涤两次。无水硫酸钠干燥，蒸干得约16g白色固体化合物1，收率为37.6％，mp：141～142℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：11.99(s，1H，-COOH)，5.82(s，1H，17-H)，5.35(s，1H，17-H)，2.32(d，14-Hα)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).；ESI-MS m/z：317[M-H]-.
(2)16g化合物1投入250ml单颈瓶中，加入150ml DMF，DEMF或DMSO等偶极非质子性溶剂中溶解，加入10g碳酸钾，11ml溴化苄，催化量的碘化钾。加热40～80℃搅拌3～6h，有大量淡黄色固体析出。冷却反应液至室温，蒸干DMF，加水过滤，得约18g淡黄色固体化合物2，粗收率为90％，mp：123～125℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.82(s，1H，17-H)，5.35(s，1H，17-H)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，2.32(d，1H J＝12Hz，14-Hα)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：409[M+H]+
(3)18g化合物2投入250ml单颈瓶中，加入120ml THF溶解，加入2.1g二氧化硒，1ml过氧叔丁醇。室温搅拌6h后，蒸干溶剂，析出白色固体，加水过滤得约18g白色固体化合物3，粗收率为95％，mp：163～165℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.82(s，1H，17-H)，5.35(s，1H，17-H)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，3.82(s，1H，15-H)，2.32(d，1H J＝12Hz，14-Hα)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：425[M+H]+
(4)18g化合物3投入250ml单颈瓶中，加入120ml CH2Cl2溶解，外温降至-78℃，向反应瓶中通入O3，恒温反应1～3h。停止反应，浓缩反应液，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝3∶1)的得约5g白色固体化合物4粗收率为45％，mp：177～178℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：11.99(s，1H，-COOH)，7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，2.32(d，1H J＝12Hz，14-Hα)，1.14(s，3H，16-CH 3)，0.95(s，3H，18-CH 3).ESI-MS m/z：411[M-H]-
(5)5g化合物4投入100ml单颈瓶中，加入50ml干燥的苯溶解，分别加入25ml吡啶，0.8g醋酸铜，2g四醋酸铅，氮气保护加热回流反应1h。蒸去溶剂，乙酸乙酯溶解，分别用36％HCl，饱和NaHCO3洗涤两次。干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝6∶1)得2.4g淡黄色油状化合物5，粗收率为51％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.86(s，1H，14-H)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，1.14(s，3H，15-CH 3)，0.95(s，3H，17-CH 3).ESI-MS m/z：367[M+H]+.
(6)2g化合物5投入100ml单颈瓶中，加入50ml甲醇或THF溶解，冰水浴条件下加入2ml10％NaOH，缓慢滴加30％H2O2，室温反应2～10h。蒸去部分溶剂，乙酸乙酯提取，干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝10∶1)得1.3g无色透明油状化合物6，粗收率为45％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，3.21(s，1H，14-H)，1.14(s，3H，15-CH 3)，0.95(s，3H，17-CH 3).ESI-MS m/z：383[M+H]+
(7)1.3g化合物6投入25ml单颈瓶中，加入2.9g叔丁氧基双二甲氨基甲烷，5ml DMF溶解，加热120℃反应6h，冷却至室温，反应液加水，乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干得淡黄色固体。加50ml CH2Cl2溶解，加入3g四苯基卟啉，外温降至-78℃，向反应瓶中通入O2，恒温反应5h。柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝10∶1)得0.9g无色透明油状化合物7，粗收率为67％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.74(d，1H，11-H)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，3.21(s，1H，14-H)，2.61(d，1H，9-H)，1.14(s，3H，15-CH 3)，0.95(s，3H，17-CH 3).ESI-MSm/z：419[M+Na]+.
(8)0.9g化合物7投入100ml单颈瓶中，加50ml CH2Cl2溶解，分别加入0.8g2-(Diethylphosphono)propanoic acid，1.8g DCC，0.2g DMAP。室温反应4h，反应液过滤，滤液分别用10％HCl，饱和NaHCO3洗涤两次，干燥，柱层(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝4∶1)析得0.4g无色透明油状化合物8。
化合物8投入25ml单颈瓶中，加入20ml THF溶解，加入0.5g 60％NaH，室温反应2h。冰水浴条件下，向反应液中滴加1ml H2O，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯萃取，干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝6∶1)得0.1g目标化合物19-苄氧羰基岩大戟内酯A(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide A)，粗收率为30％，mp：154～157℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.74(d，1H，11-H)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，3.21(s，1H，14-H)，2.61(d，1H，9-H)，2.07(s，3H，17-CH 3)1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：435[M+H]+.
实例2：19-苄氧羰基岩大戟内酯B(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide B)
(1)0.1g 19-苄氧羰基岩大戟内酯A(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide A)投入25ml单颈瓶中，加入15ml CH2Cl2溶解，加入0.1g 80％m-CPBA，室温反应7h。蒸去部分溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和NaHCO3洗涤两次。干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝6∶1)得0.03g目标化合物19-苄氧羰基岩大戟内酯B(19-Benzyloxocarbonyl JolkinolideB)，粗收率为31％，mp：161～163℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，，3.98(d，1H，11-H)3.65(s，1H，14-H)，2.07(s，3H，17-CH 3)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：473[M+Na]+.
实例3：19-甲氧甲氧基岩大戟内酯E(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide E)
参照实例1的方法得中间体化合物3
(2)18g化合物3投入250ml单颈瓶中，加入150ml DMF，DEMF或DMSO等偶极非质子性溶剂中溶解，加入10g PDC，室温搅拌12～24h后，反应液中加水，乙酸乙酯萃取，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠洗涤两次，干燥，蒸干得褐色油状物。柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝2∶1)得13g白色固体化合物11，粗收率为72.6％，mp：117～119℃。
1H-NMR(CDCl3.300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2 Ph)，5.82(s，1H，17-H)，5.35(s，1H，17-H)，5.17，5.07(dd，2H，CH 2Ph)，2.32(d，1H J＝12Hz，14-Hα)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：423[M+H]+
(3)13g化合物11投入250ml单颈瓶中，加入150ml二氯甲烷或氯仿溶解，分别加入18g 80％m-CPBA，8.7g碳酸氢钠。室温搅拌12h后，加入饱和亚硫酸钠溶液50ml。蒸去二氯甲烷，乙酸乙酯萃取，干燥。柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝3∶1)，得6g无色透明油状化合物12，粗收率为42.8％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：7.28～7.39(m，5H，CH2Ph)，5.17，5.07(dd，2H，CH2Ph)，2.98(d，1H，17-H)，3.11(d，1H，17-H)，2.32(d，1H J＝12Hz，14-Hα)，1.14(s，3H，18-CH3)，0.95(s，3H，20-CH3).ESI-MS m/z：477[M+Na]+
(4)6g化合物12投入250ml单颈瓶中，加入100ml干燥的THF，加入3.3g LAH。加热回流5h后，冷却反应液至室温，冰水浴条件下依次加入1.5ml水，3ml 4M的氢氧化钠溶液，1.5ml水。过滤。蒸干滤液得5g黄色油状物。加入50ml THF使其溶解，分别加入25ml水， 10g高碘酸钠。室温搅拌12h后，加入稀盐酸，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯萃取。干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝1∶1)得2g白色固体化合物13，粗收率为52.6％，mp：156～158℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：5.86(s，1H，14-H)，4.23，3.90(d，1H，d，1H，CH 2OH)，1.14(s，3H，15-CH 3)，0.95(s，3H，17-CH 3).ESI-MS m/z：263[M+H]+
(5)2g化合物13投入100ml单颈瓶中，加入50ml二氯甲烷，12ml N，N-二异丙基乙胺，2ml氯甲醚。加热回流1h后，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯溶解，依次用稀盐酸，饱和碳酸氢钠洗涤两次。干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝6∶1)得1.4g淡黄色油状化合物14，粗收率为60.8％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：5.86(s，1H，14-H)，4.59(s，2H，-OCH2O-)，4.23，3.90(d，1H，d，1H，CH 2OH)，3.32(s，3H，-OCH 3)，1.14(s，3H，15-CH 3)，0.95(s，3H，17-CH 3).ESI-MS m/z：307[M+H]+
(6)5ml二异丙胺投入到100ml三颈瓶中，加入5ml THF，降温至-78℃加入6ml正丁基锂，反应搅拌1h后，加入1.4g化合物14的THF溶液。-78℃反应3h后升温至-15℃，加入TMSCl。室温反应3h后，蒸干反应液，乙酸乙酯萃取，干燥，蒸干的无色油状物。15ml二氯甲烷溶解，加入2.4g m-CPBA，降温至-60℃反应3h后，升至室温，向反应液中加入2g TABF的四氢呋喃溶液，室温搅拌6h后，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，依次用稀盐酸，饱和碳酸氢钠洗涤两次，干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝4∶1)得0.8g淡黄色油状化合物15，粗收率为54.4％。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：5.86(s，1H，14-H)，5.42(m，1H，12-H)，4.59(s，2H，-OCH2O-)，4.23，3.90(d，1H，d，1H，CH 2OH)，3.32(s，3H，-OCH 3)，1.14(s，3H，15-CH 3)，0.95(s，3H，17-CH 3).ESI-MSm/z：323[M+H]+
(7)0.8g化合物15投入50ml单颈瓶中，加入20ml CH2Cl2，加入1.2g DCC，加入0.6g2-(diethoxyphosphoryl)propanoic acid。室温反应1h后，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯溶解，依次用稀盐酸，饱和碳酸氢钠洗涤两次。干燥，蒸干得无色油状物，四氢呋喃溶解，加入1.3g氢化钠，室温反应6h后，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，饱和碳酸氢钠洗涤两次。干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝6∶1)得0.32g目标化合物19-甲氧甲氧基岩大戟内酯E(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide E)，粗收率为35.9％，mp：145～147℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：5.86(s，1H，14-H)，5.42(m，1H，12-H)，4.59(s，2H，-OCH2O-)，4.23，3.90(d，1H，d，1H，-CH 2O-)，3.32(s，3H，-OCH 3)，2.07(s，3H，17-CH 3)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：361[M+H]+.
实例4：19-羟基岩大戟内酯E(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide E)
(1)0.1g化合物17投入25ml单颈瓶中，加入10mlTHF溶解，加入5ml 10％HCl，室温反应1h。蒸去部分溶剂，饱和NaHCO3洗涤两次，干燥，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝3∶1)得0.04g目标化合物19-羟基岩大戟内酯E(19-Benzyloxocarbonyl Jolkinolide E)，粗收率为43％，mp：174～177℃。
1H-NMR(CDCl3，300MHz)δ：5.86(s，1H，14-H)，5.42(m，1H，12-H)，4.23，3.90(d，1H，d，1H，CH 2OH)，3.32(s，3H，-OCH 3)，2.07(s，3H，17-CH 3)，1.14(s，3H，18-CH 3)，0.95(s，3H，20-CH 3).ESI-MS m/z：323[M+H]+.
初步抗肿瘤体外药理筛选结果：
(1)细胞株与实验动物
MCF-7、Hela、MDA-MB-231、SGC-7901、LNCaP人肿瘤细胞株由中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库购买。清洁级BALB/C小鼠，体重18～22g，雌雄兼用，南京凯基生物科技发展有限公司。
(2)主要仪器设备
Hitachi-600型透射电子显微镜，倒置显微镜和显微摄像装置，日本Olympus计算机图像分析系统，北航CM-2000B型生物医学图像分析系统，SHELL LAB型CO2培养箱，美国Bio-Radmodel 550型酶联免疫吸附检测仪，Becon Dicknson公司FACSCalibu流式细胞仪，瑞士Lightcyclor 480实时定量荧光PCR系统。
(3)体外抑瘤实验
(1)取处于指数生长期状态良好的细胞，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用RPMI-1640培养液制成细胞悬液，调整细胞浓度为2～4×104个/ml。
(2)取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO2培养箱中培养24h。
(3)换液，加入受试化合物，20μl/孔，培养48h。
(4)将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4h。
(5)吸去上清液，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇10min。
(6)用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制率，再按Bliss法计算IC50值。
(4)初步筛选结果
时间：72h，单位：ug/ml
Claims (5)
1.一种具有通式(I)的岩大戟内酯(Jolkinolide)型化合物的制备方法及其作为抗肿瘤、抗菌、消炎药物和杀虫剂的有效成分。
2.具有通式(I)结构的化合物，其中，
[1]R1结构可进一步表述为：COOR7，CONR7R7，(CH2)nXR7(其中，n＝1～8)，XR7。
[2]X为O，NH，NR7，S。
[3]R7可表述为：氢，直链或支链的烷基(C1～C8)，卤素取代的直链或支链的烷基(C1～C8)，烯丙基，炔丙基，苯基，苄基，1-萘基，2-萘基，呋喃或吡喃型五、六元糖基或取代糖基，或2～5个以不同方式(如：1，2-、1，4-、1，6-)连接的葡萄糖基或取代葡萄糖基。
[4]R2可表述为：氢，羟基，羧基，羧酸酯基(C1～C10)，直链或支链的烷基(C1～C8)、直链或支链的烷(C1～C8)氧基(或氨基、或羰基、或氨基羰基)，直链或支链的卤代烷(C1～C8)氧基(或氨基、或羰基、或氨基羰基)，直链或支链的烷基(C1～C8)醚，甲基或乙基葡萄糖基、呋喃或吡喃型五、六元糖基或取代糖基，或2～5个以不同方式(如：1，2-、1，4-、1，6-)连接的葡萄糖基或取代葡萄糖基。
[5]R3、R4与R5、R6可以相同或不同，可表述为：氢，羟基，卤素，羰基，羧基，羧酸酯基(C1～C10)，取代或非取代烃基(C1～C10)醚基，三氟甲基，氰基。
[6]R3、R4或R5、R6之间，可脱水形成环氧结构，或形成烯烃、烯醇、烯胺结构。
3.通式(I)化合物的制备方法
(a)通式(I)中，当R1为COOR7，其中R7为苄基、R2为甲基，R3与R4形成环氧基，R5与R6为烯键，即19-苄氧羰基岩大戟内酯(Jolkinolide)A(Ia)，其制备方法为：
[1]将甜菊苷溶于水中，加入高碘酸钠搅拌5～50h。反应体系中加入氢氧化钾加热搅拌1～10h。反应体系放冷后酸化。然后用有机溶剂提取。提取物浓缩柱层析得甜菊醇。
[2]甜菊醇溶解于DMF、DMSO、THF或HMPA等偶极非质子性溶剂中，分别加入碳酸钾或碳酸钠或苛性碱，卤化苄。加热0～100℃搅拌1～20h。冷却反应液至室温，加水，过滤得到甜菊醇苄酯。
[3]甜菊醇苄酯溶解于丙酮或THF或DMF或醇类溶剂中，分别加入二氧化硒，过氧叔丁醇。室温搅拌1～12h后，反应体系加水，用有机溶剂提取。提取物浓缩后柱层析得到15-羟基甜菊醇苄酯。
[4]15-羟基甜菊醇苄酯溶解于CH2Cl2或醇类溶剂中，外温降至-10～-78℃，经臭氧氧化断键，所得产物溶解于干燥的苯中，分别加入吡啶，醋酸铜，四醋酸铅，氮气保护加热回流反应1～8h。蒸去溶剂，柱层析得化合物19-苄氧羰基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮。
[5]化合物19-苄氧羰基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮溶解于丙酮或THF或DMF或醇类溶剂中，分别加入10％NaOH，30％H2O2，室温反应1～10h。蒸去部分溶剂，乙酸乙酯提取，柱层析得化合物8，14-环氧-13-Podocarpanone。
[6]化合物8，14-环氧-13-Podocarpanone溶解于DMF中，加入叔丁氧基双二甲氨基甲烷，加热25～80℃反应1～8h，冷却至室温，反应液加水，乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂后溶解于CH2Cl2，加入四苯基卟啉，冷浴-20～-78℃下通入O2，恒温反应1～10h。柱层析得化合物8，14-环氧-12-羟基-13-Podocarpanone。
[7]化合物8，14-环氧-12-羟基-13-Podocarpanone溶解于CH2Cl2中，分别加入自制的2-(Diethylphosphono)propanoic acid，DCC，DMAP。室温反应1～24h，反应液过滤，乙酸乙酯萃取，柱层析得化合物8，14-环氧-12-羟基-13-Podocarpanone，该化合物溶解于THF或乙醚中，加入50～60％NaH，室温反应1～12h，乙酸乙酯萃取，柱层析得目标化合物19-苄氧羰基岩大戟内酯(Jolkinolide)A(Ia)。
(b)通式(I)中，当R1为COOR7，其中R7为苄基、R2为甲基，R3与R4形成环氧基，R5与R6形成环氧基，即19-苄氧羰基岩大戟内酯(Jolkinolide)B(Ib)，其制备方法为：
[1]化合物19-苄氧羰基岩大戟内酯A(Ia)溶解于CH2Cl2或氯仿中，加入65～85％m-CPBA，室温反应5～24h。乙酸乙酯萃取，柱层析得目标化合物19-苄氧羰基岩大戟内酯(Jolkinolide)B(Ib)。
(c)通式(I)中，当R1为(CH2)nXR7、其中n＝1，X为O，R7为甲氧甲基，R3与R4之间为烯键，R5与R6都代表氢，即19-甲氧亚甲氧基岩大戟内酯(Jolkinolide)E(Ic)，其制备方法为：
[1]参照19-苄氧羰基岩大戟内酯A(Ia)的制备方法得到化合物15-羟基甜菊醇苄酯。
[2]15-羟基甜菊醇苄酯溶解于DMF，THF或DMSO等偶极非质子性溶剂中，加入氧化剂PDC或PCC，室温搅拌12～24h后，反应液中加水，乙酸乙酯萃取，分别用稀盐酸，饱和碳酸氢钠洗涤两次，干燥，蒸干得褐色油状物。柱层析得15-羰基甜菊醇苄酯。
[3]15-羰基甜菊醇苄酯溶解于二氯甲烷或氯仿溶解，分别加入80％m-CPBA，碳酸氢钠。室温搅拌6～12h后，加入饱和亚硫酸钠溶液。乙酸乙酯萃取，干燥，柱层析得油状物。分别加入干燥的四氢呋喃溶解，四氢锂铝，加热回流反应5～10h。冷却反应液至室温，冰水浴条件下依次加入水，4M的氢氧化钠溶液。过滤。蒸干滤液得黄色油状物。加入四氢呋喃使其溶解，分别加入水，高碘酸钠。室温搅拌12～24h后，加入稀盐酸，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯萃取。干燥，柱层析得化合物19-羟基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮。
[4]化合物19-羟基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮溶解于二氯甲烷或氯仿中，分别加入氯甲醚，N，N-二异丙基乙胺，加热回流反应1～3h后，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯溶解，依次用稀盐酸，饱和碳酸氢钠洗涤两次。干燥，柱层析得化合物19-甲氧甲氧基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮。
[5]二异丙胺溶解于THF或乙醚等溶剂，降温至-78℃加入正丁基锂，反应搅拌1～3h后，加入化合物19-甲氧甲氧基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮的THF或乙醚溶液。-78℃反应3h后升温至-15℃，加入TMSCl。室温反应3h后，蒸干反应液，乙酸乙酯萃取，蒸干溶剂后溶解于CH2Cl2中，加入80％m-CPBA，降温至-60℃反应3～5h后，升至室温，向反应液中加入TABF的四氢呋喃溶液，室温搅拌6～12h后，蒸干溶剂，乙酸乙酯溶解，柱层析得化合物19-甲氧甲氧基-12-羟基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮。
[6]化合物19-甲氧甲氧基-12-羟基-Δ8(14)-Podocarpen-13-酮溶解于CH2Cl2或氯仿中，加入DCC，2-(diethoxyphosphoryl)propanoic acid。室温反应1～5h后，蒸去部分溶剂，乙酸乙酯溶解，蒸干溶剂后溶解于THF或乙醚中，加入氢化钠，室温反应6～10h后，蒸干溶剂，乙酸乙酯萃取，柱层析得目标化合物19-甲氧甲氧基岩大戟内酯(Jolkinolide)E(Ic)。
(d)通式(I)中，当R1为(CH2)nXR7，其中n＝1，X为O，R7为羟基，R3与R4之间为烯键，R5与R6均为氢，即19-羟基岩大戟内酯(Jolkinolide)E(Id)，其制备方法为：
[1]化合物19-甲氧甲氧基岩大戟内酯(Jolkinolide)E(Ic)溶解于四氢呋喃中，加入10％HCl，室温反应1～3h。蒸去部分溶剂，饱和碳酸氢钠洗涤两次，干燥，柱层析得目标化合物19-羟基岩大戟内酯(Jolkinolide)E(Id)。
4.具有通式为(I)的化合物及其衍生物，或与其它药物的任意组合，与适量的载体化学助剂掺合，配成适当的制剂，作为抗肿瘤、抗菌、消炎药物。
5.具有通式为(I)的化合物及其衍生物，或与其它农药的任意组合，与适量的载体、表面活性剂、分散剂或通用的农用化学助剂掺合，配成适当的制剂作为杀虫剂农药。
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