CN102558049B - 一类双香豆素类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由通式I表示的双香豆素类化合物。其中各取代基的定义如说明书中所述。本发明还涉及上述双香豆素类化合物的制备方法以及其作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂在抗肿瘤方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种双香豆素类化合物及其制备方法以及作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
对于癌症的治疗一直以来都是困扰着人类的一个难题,虽然每年全世界都有巨大的研究经费投入,对于肿瘤的治疗仍然是科学界无法取得突破的一个难点。目前,临床上常用的抗肿瘤药物主要是细胞毒类药物,这类抗癌药具有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点。近年来,随着生命科学研究的飞速进展,恶性肿瘤细胞内的信号转导、细胞周期的调节、细胞凋亡的诱导、血管生成以及细胞与胞外基质的相互作用等各种基本过程正在被逐步阐明。以一些与肿瘤细胞分化增殖及转移相关的细胞信号转导通路的关键酶作为药物筛选靶点,发现选择性作用于特定靶点的高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。
蛋白酪氨酸激酶在细胞内的信号转导通路中占据了十分重要的地位,调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理化过程,蛋白酪氨酸激酶功能的失调会引发生物体内的一系列疾病。已有资料表明,超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性,它们的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱,进而导致肿瘤发生。此外,蛋白酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移,肿瘤新生血管的生成,肿瘤的化疗抗性密切相关。
发明人对于双香豆素类化合物库的筛选时发现了化合物3,3’-亚甲基双(4,7,8-三羟基)香豆素(化合物编号:400)对于蛋白酪氨酸激酶具有广谱的抑制活性,其中对于c-Met(肝细胞生长因子受体),EGFR(上皮生长因子受体)的抑制活性分别的达到了40nM和16nM。通过文献调研,我们发现化合物400是个已知的化合物,其作为中间体经过全乙酰化反应,然后作为工具化合物,用于一项旨在研究比较包括香豆素、双香豆素、色酮(chromone)、黄酮、异黄酮和吨酮(xanthone)的乙酰化衍生物对于乙酰化合物-蛋白转乙酰酶(acetoxydrug-protein transacetylase:功能为把乙酰化多酚性物质的乙酰基转移到蛋白上)的特异性调控作用(Kumar,A.;Raj,H.G.et al,Specificities of acetoxyderivatives of coumarins,biscoumarins,chromones,flavones,isoflavones andxanthones for acetoxy drug:Protein transacetylase,European Journal of MedicinalChemistry,2007,42,447-455)。然而在该文献中化合物400其本身的蛋白酪氨酸激酶抑制活性并未见到报道,在此基础上发明人对其结构做了优化和改造以及评价而得到一系列具有进一步开发潜力的化合物。
3,3′-亚甲基双(4,7,8-三羟基)香豆素
发明内容
本发明的目的在于设计与合成一类新型的具有双香豆素母核(2-(1H)喹啉酮)结构的双香豆素类化合物,其可以作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂,从而为抗肿瘤药物发现开辟新途径。
本发明的另一目的在于提供上述双香豆素类化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述双香豆素类化合物作为蛋白酪氨酸激酶抑制剂的用途。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物,其包括治疗有效量的上述双香豆素类化合物作为活性成分以及药学上可接受的辅料。
本发明所述的双香豆素类化合物可以由以下通式I表示:
其中:
X1和X2各自独立地为氨基、C1-C6烷胺基、芳基取代C1-C6烷胺基、卤代C1-C6烷胺基或氧;
Z基团可以为直接键即两香豆素结构直接相连,或者为氨基、C1-C6烷亚胺基、芳基取代的C1-C6烷亚胺基、卤代C1-C6烷亚胺基、氧、亚芳基、羟基取代的亚芳基、卤代的亚芳基、杂亚芳基、羟基取代的杂亚芳基、卤代的杂亚芳基、芳基取代的C1-C6亚烷基、羟基代芳基取代的C1-C6亚烷基、卤代芳基取代的C1-C6亚烷基、羟基代杂芳基取代的C1-C6亚烷基、卤代杂芳基取代的C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基、羧基取代的C1-C6亚烷基、-NH-、-CH2-NH-C(O)-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-CH2-CH=CH2-、-CH2=CH-CH2-、-CH2-CH2=CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-NH-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-C(O)-CH2-C(O)-、
R1~R10各自独立地选自如下基团中的一种:H、卤素、羟基、C1-C6烷氧基、芳基氧基、芳基取代C1-C6烷氧基、氨基、C1-C6烷胺基、芳基取代C1-C6烷胺基、C1-C6烷基、羟基取代C1-C6烷基、C1-C4烷氧基取代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、芳基取代C1-C6烷基、C2-C6链烯基、羟基取代C2-C6链烯基、C1-C4烷氧基取代C2-C6链烯基、卤代C2-C6链烯基、芳基取代C2-C6链烯基、C2-C6链炔基、羟基取代C2-C6链炔基、C1-C4烷氧基取代C2-C6链炔基、卤代C2-C6链炔基、芳基取代C2-C6链炔基、芳基、杂芳基、C1-C6烷酰基氧基或C1-C6烷酰基取代的C1-C6烷基,或是R1和R2,R2和R3,R3和R4,R7和R8,R8和R9,或R9和R10可以连接形成一个3-6元环或含有1-3个选自N、O和S中的杂原子的3-6元杂环;
优选R1~R10各自独立地为H、F、羟基、C1-C6烷基、羟基取代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6链烯基、羟基取代C2-C6链烯基或卤代C2-C6链烯基,或是R3和R4,或R9和R10可以连接形成一个5-6元环或含有1-3个选自N、O和S中的杂原子的5-6元杂环;
更优选R1~R10各自独立地为H、C1-C6烷基、羟基、羟基取代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6链烯基、羟基取代C2-C6链烯基、或卤代C2-C6链烯基;
特别优选R1~R10各自独立地为H、C1-C6烷基、羟基、羟基取代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C2-C6链烯基、羟基取代C2-C6链烯基、卤代C2-C6链烯基,或是R3和R4或(和)R9和R10形成一个5-6元环或含有1-3个杂原子的5-6元杂环;
最优选R1~R10中R1和R2或/和R7和R8为H、C1-C6烷基或C2-C6链烯基;R3、R4、R9和R10为羟基、C1-C6烷酰基取代的C1-C6烷基、C1-C6链烯基或羟基取代C2-C6链烯基;
所述的烷基是指直链或支链的烷基,烷氧基是指直链或支链的烷氧基,链烯基是指直链或支链的链烯基,链炔基是指直链或支链的链炔基,卤素是指F、Cl、Br或I,芳基为C6-C20的芳基,杂芳基是指含1-3个选自N、O或S的杂原子的5或6元杂芳基。
其中所述亚芳基为C6-C20的亚芳基,优选为C5-C6的亚芳基,更优选为亚苯基;所述杂亚芳基为原子数为6-20的杂亚芳基并且其包含1至3个选自N、O和S中的原子,优选为杂亚芳基为原子数为5-6的杂亚芳基并且其包含1至3个选自N、O和S中的原子。
优选地,本发明所述的双香豆素类化合物为选自以下化合物中的一种:
对于上述本发明所述的香豆素类化合物的制备方法可以通过如下方案中的至少一种来实现:其中,X1、X2、R1~R10的定义同上;
路线一:
具体来说,取代的2-羟基苯甲醛(均通过市售商品途径得到)和NaH/碳酸二乙酯在四氢呋喃(THF)中反应,得到4-羟基香豆素后,和不同的醛(均通过市售商品途径得到)反应即得各种各样的本发明所述3,3’-亚甲基双香豆素。其中R’表示芳基、羟基取代的芳基、卤代的芳基、羟基取代的杂芳基、卤代的杂芳基或羧基;
路线二:
具体来说,取代的3-氨基香豆素(通过参考文献方法制备:Sivakumar,Krishnamoorthy;Xie,Fang;Cash,Brandon M.;Long,Su;Barnhill,Hannah N.;Wang,Qian Organic Letters,2004,vol.6,#24,p.4603-4606)或3-氨基喹啉酮类化合物(通过参考文献方法制备:Saari,Walfred S.;Wai,John S.;Fisher,Thorsten E.;Thomas,Craig M.;Hoffman,Jacob M.;et al.Journal of MedicinalChemistry,1992,vol.35,#21 p.3792-3802)和3-甲酸香豆素或3-甲酸喹啉酮类(两者均通过参考文献方法制备:Leone-Bay,Andrea;Paton et al.Journal of Medicinal Chemistry,1998,vol.41,#7 p.1163-1171)在吡啶(Py)/二氯甲烷(DCM)中,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)反应,反应即得各种各样的本发明所述的以酰胺键连接的3,3’-双香豆素。
路线三:
具体来说,取代的3-溴香豆素(由不同取代的香豆素进行选择性溴化得到,制备途径参考文献:Venkateswarlu,Katta et al.Synthetic Communications,2009,vol.39,#2,p.215-219)在4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽及碳酸铯存在下,于1,4-二氧六环中,钯(优选Pd(OAc)2)催化的条件下发生自身偶联反应,即得各种各样的本发明所述的3,3’-双香豆素。
路线四:
具体来说,取代的3-烯丙基香豆素(通过参考文献方法制备:Kumar,R.Jagdish et al.Synthesis,1990,#6,p.535-538)在Grubbs-Hoveyda催化剂的作用下,以甲苯为溶剂在80℃加热条件下,生成了中间连接为2-丁烯基的双香豆素类系列化合物,然后在THF中,经过钯碳氢化还原得到丁基连接的双香豆素。
路线五:
具体来说,取代的3-溴甲基化合物(溴化物通过参考文献方法制备:Leonetti,Francesco et al Journal of Medicinal Chemistry,2004,vol.47,#27 p.6792-6803)与叠氮化合物,经过叠氮基团取代和钯碳氢化还原得到3-氨甲基香豆素类化合物,随后在三光气及三乙胺的作用下3-氨甲基香豆素类化合物生成了脲连接的双香豆素结构。
本发明不仅提供了一类新型的香豆素及喹啉酮类化合物及其制备方法,还提供了一种抗肿瘤的药物组合物,该组合物包含本发明上述化合物中的一种或多种作为活性成分,并可进一步包含药学上常规的辅剂,例如分散剂、赋形剂、崩解剂、抗氧化剂、甜味剂、包衣剂等。
本发明设计与合成了一类新型的香豆素及喹啉酮类化合物,能有效抑制一些激酶的磷酸化水平以及一些肿瘤细胞的增殖,因此具有制成激酶抑制剂来作为抗肿瘤的药物的可能,本发明涉及到的化合物结构相对简单,易于制备。
附图说明
图1为部分化合物对A549细胞水平c-Met磷酸化的影响。
图2为部分化合物对MNK45细胞水平c-Met磷酸化的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,但本发明不局限于这些实施例。
化合物制备实施例
下述制备实施例中,NMR用Varian生产的Mercury-Vx 300M仪器测定,NMR定标:δH 7.26ppm(CDCl3),2.50ppm(DMSO-d6);质谱用Agilent 1200Quadrupole LC/MS液质联用仪或SHIMADZU GCMS-QP5050A测定;试剂主要由上海化学试剂公司提供;TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产,型号HSGF 254;化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产,型号zcx-11,200-300目。
制备实施例一 3,3’-亚甲基双(4,7,8-三羟基香豆素)(化合物编号:400-1)
4,7,8-三羟基香豆素(制备方法:由2,3,4三羟基-苯乙酮(市售)出发,利用2当量的甲氧基甲基氯保护3位和4位的羟基,随后利用NaH/碳酸二乙酯在四氢呋喃(THF)中反应形成4位羟基取代的香豆素,此中间体利用盐酸脱除7位和8位羟基的保护即可以得到4,7,8-三羟基香豆素)500mg溶于乙醇(10mL)中,加入多聚甲醛50mg,及Et3N(0.5mL)室温反应24h,过滤,柠檬酸洗涤,真空干燥得灰白色固体400(460mg,89%)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):10.05(bs,6H),7.27(d,J=8.7Hz,2H),6.83(d,J=8.7Hz,2H),3.71(s,2H).ESI-MS(m/z):401.4(M+1)+
制备实施例二 N-(7,8-二羟基-2(1H)-喹啉酮-3-)-7,8-二羟基-2(1H)-喹啉酮-3-酰胺(化合物编号:395-1)
7,8-二(甲氧基甲氧基)-2(1H)喹啉酮-3-酸(50mg,0.16mmol)及7,8-二(甲氧基甲氧基)-2(1H)喹啉酮-3-胺(46mg,1eq,0.16mmol)(参考文献方法制备:Saari,Walfred S.;Wai,John S.;Fisher,Thorsten E.;Thomas,Craig M.;Hoffman,Jacob M.;等.Journal of Medicinal Chemistry,1992,vol.35,#21 p.3792-3802)溶于0.7mL DCM/0.3mL吡啶溶剂之后加入EDCI,室温反应3h,体系由澄清变浑浊,过滤,甲醇洗,得固体化合物55mg,摩尔收率:60%。
上述化合物经过溶于3N HCl的乙酸乙酯溶液,加入1d甲醇后,即得到化合物,灰绿色固体38mg。摩尔收率:100%。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):12.42(s,1H),11.16(s,1H),10.87(s,1H),8.77(s,2H),7.35(d,J=8.7Hz,1H),7.00(d,J=8.7Hz,1H),6.88(d,J=8.7Hz,1H),6.76(d,J=8.7Hz,1H),4.10(bs,4H).ESI-MS(m/z):396(M+1)+
制备实施例三 7,7′,8,8′-四羟基-4,4′-二甲基-3,3′-双香豆素(化合物编号:382-1)
3-溴-4-甲基-7,8-二(甲氧基甲氧基)-香豆素(100mg,0.278mmol)(按照文献方法制备:Bowden,Keith;Battah,Sinan Journal of the Chemical Society,Perkin Transactions 2:Physical Organic Chemistry(1972-1999),1998,p.1603-1606),4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(16mg,0.05eq)及碳酸铯(135mg,1.5eq,0.417mmol)溶于10mL无水二氧六环,脱气处理后加入Pd(OAc)2(6mg,0.05eq),升至100℃,12h后小心加入10%柠檬酸酸化后萃取,浓缩过柱(DCM/MeOH=10/1),分得30mg化合物摩尔收率:39%。上述化合物经过溶于3N HCl的乙酸乙酯溶液,加入1滴甲醇后,即得到化合物20mg,灰绿色固体。摩尔收率:100%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):9.47(bs,2H),9.30(bs,2H),7.00(d,J=9Hz,1H),6.85(d,J=9Hz,1H),2.45(s,6H).ESI-MS(m/z):383(M+1)+
制备实施例四 3-(7,8-二羟基-4-甲基香豆素-3-氨基)-7,8-2(1H)二羟基喹啉酮(化合物编号:382-2)
3-溴-4-甲基-7,8-二(甲氧基甲氧基)-香豆素(77mg,1.2eq,0.215mmol),7,8-二(甲氧基甲氧基)-2(1H)喹啉酮-3-胺(50mg,1eq,0.179mmol)和Cs2CO3(87mg,1.5eq,0.269mmol)溶于二氧六环,脱气后加入4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽(9mg,0.05eq,0.001mmol)及Pd(OAc)2(4mg,0.05eq,0.001mmol)升至100℃,4h后停止反应,过柱PE/AC=1/1得到46mg化合物,摩尔收率:46%。
上述化合物经过溶于3mL3N HCl的乙酸乙酯溶液,加入1滴甲醇后,即得到化合物25mg,灰绿色固体。摩尔收率:80%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):9.40(s,1H),7.36(d,J=9Hz,1H),7.20(d,J=9Hz,3H),7.02(dd,2H),6.72(s,1H),6.32(s,1H),5.31(s,2H),5.28(s,2H),5.27(s,2H),5.22(s,2H),3.72(s,3H),3.60(s,2H),3.54(s,2H),3.51(s,2H),2.33(s,3H).ESI-MS(m/z):383(M+1)+
制备实施例五(E)-3,3′-(1,4-丁基-2-烯-)-双(4,7,8-三羟基-香豆素)(化合物编号:440)
3-烯丙基-4-羟基-7,8-双(甲氧基甲氧基)-香豆素(100mg,0.31mmol)溶于8mL甲苯,脱气处理后加入Grubbs-Hoveyda(0.1eq,10mg),80℃反应12h后,体系由淡黄色变棕黑,冷却有固体析出,过滤水洗得18mg灰白色固体。摩尔收率:21%。
上述化合物经过溶于3mL 3N HCl的乙酸乙酯溶液,加入1滴甲醇后,即得到化合物12mg,灰绿色固体。摩尔收率:90%。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):11.00(bs,2H),7.25(d,J=8.7Hz,2H),6.78(d,J=8.7Hz,2H),5.50(s,2H),4.32(bs,活泼氢加H2O峰),3.13(s,4H).ESI[M+1]+=441。
制备实施例六 2,2’-双(4,7,8-三羟基香豆素)乙酸(化合物编号:444)
4,7,8-三羟基香豆素500mg溶于乙醇(10mL)中,加入乙醛酸100mg,及Et3N(0.5mL)室温反应24h,过滤,柠檬酸洗涤,真空干燥得灰白色固体444(440mg,摩尔收率:80%)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):7.13(d,J=8.7Hz,2H),6.66(d,J=8.7Hz,2H),5.54(s,1H),3.25(bs,7H).ESI:[M+1]+=445。
制备实施例七 3,3’-双(7,8-双羟基4-甲基香豆素)(化合物编号:396)
焦性没食子酸104(500mg,4mmol)和上述α,α’-乙酰戊二酸乙酯(Guin,Joyram等.Angewandte Chemie,International Edition,2008,vol.47,#4 p.779-782)(544mg,2mmol)混合均匀后冰浴下加入70%硫酸溶液,0.5h后,加入冰水,过滤得到浅棕色固体396(50mg,摩尔收率5%)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):7.12(d,J=7.2Hz,1H),6.79(d,J=7.2Hz,1H),3.87(s,2H),2.41(s,6H).ESI:[M+1]+=397。
制备实施例八 3,3’-(1,4-哌嗪双甲酰基)-双(7,8-二羟基香豆素)(化合物编号:494)
3-羧基-7,8-双甲氧基甲氧基香豆素(其制备方法可以参考:Ferroud,Didier等.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,1999,vol.9,#19p.2881-2886)(190mg,0.61mmol)溶于DCM后0℃下加入三乙胺(176 1,2eq,1.22mmol)及SOCl2(64μL,1.5eq,0.9mmol),升至室温,1h后加入哌嗪(26mg,0.5eq,0.3mmol)后,旋除溶剂后,反应液直接上柱,PE/AC=2∶1分离可得中间体,上述所得溶于4mL 4N HCl的乙酸乙酯溶液,得到494,摩尔收率50%。
1H NMR(300MHz,CDCl3):10.36(s,2H),9.50(bs,2H),8.05(s,2H),7.09(d,J=8.7Hz,2H),6.84(d,J=8.7Hz,2H),3.63(m,8H).ESI[M+1]+=495。
激酶的分子水平抑制实验和细胞水平抑制实验实施例
激酶抑制活性测试
测试实施例一化合物400对于激酶的抑制活性测试
筛选方法:酶联免疫吸附法测定(ELISA)
酪氨酸激酶:c-Met,Src,KDR,EGFR,ErbB4,c-Kit,ErbB2,Flt-1,PDGFR-β,RET,ABL,IGF 1R,RON,EPHA2,FGFR1,EGFR(T790M),EPHB2
作用时间:1h
将激酶的反应底物Poly(Glu,Tyr)4∶1用无钾离子的PBS(10mM磷酸钠缓冲液,150mM NaCl,pH7.2-7.4)稀释成20μg/mL,125μL/孔包被酶标板,置37℃反应12-16小时。弃去孔中液体后洗板,用200μL/孔的T-PBS(含0.1%Tween-20的PBS)洗板三次,每次5分钟。于37℃烘箱中干燥酶标板1-2小时。
每孔加入用反应缓冲液(50mM HEPES pH 7.4,50mM MgCl2,0.5mMMnCl2,0.2mM Na3VO4,1mM DTT)稀释的ATP溶液50mL,终浓度5μM。化合物400用1%DMSO稀释成合适的浓度,10μL/孔,再加入用40μL反应缓冲液稀释的各种类型的酪氨酸激酶蛋白。置37℃摇床(100rpm)反应1小时。T-PBS洗板三次。(每次实验需设无酶对照孔三孔及相应DMSO浓度的对照孔。)加入一抗PY99100μL/孔(p-Tyr(PY99),抗体用含BSA 5mg/mL的T-PBS1∶1000稀释),37℃摇床反应0.5小时。T-PBS洗板三次。加入二抗辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的IgG 100μL/孔(抗体用含BSA 5mg/mL的T-PBS1∶2000稀释),37℃摇床反应0.5小时。T-PBS洗板三次。加入2mg/mL的OPD显色液100mL/孔(用含有0.03%H2O2的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=5.4)稀释),25℃避光反应1-10分钟。(OPD溶解时需用超声,显色液需现配现用)。加入2M H2SO450μL/孔中止反应,用可调波长式微孔板酶标仪SPECTRAMAX 190读数,波长为492nm。
样品的抑制率通过下列公式求得:
IC50值通过抑制曲线以四参数拟合计算。
表1:化合物400的激酶抑制活性测试(参照化合物为广谱性激酶抑制剂Sorafinib)
测试实施例二部分化合物分子水平受体酪氨酸激酶c-Met酶活抑制试验
将激酶的反应底物Poly(Glu,Tyr)4∶1用无钾离子的PBS(10mM磷酸钠缓冲液,150mM NaCl,pH7.2-7.4)稀释成20μg/mL,125μL/孔包被酶标板,置37℃反应12-16小时。弃去孔中液体后洗板,用200μL/孔的T-PBS(含0.1%Tween-20的PBS)洗板三次,每次5分钟。于37℃烘箱中干燥酶标板1-2小时。
每孔加入用反应缓冲液(50mM HEPES pH 7.4,50mM MgCl2,0.5mMMnCl2,0.2mM Na3VO4,1mM DTT)稀释的ATP溶液50mL,终浓度5μM。此系列化合物分别取用1%DMSO稀释成合适的浓度,10μL/孔,再加入用40μL反应缓冲液稀释的c-Met酪氨酸激酶蛋白。置37℃摇床(100rpm)反应1小时。T-PBS洗板三次。(每次实验需设无酶对照孔三孔及相应DMSO浓度的对照孔。)加入一抗PY99 100μL/孔(p-Tyr(PY99),抗体用含BSA 5mg/mL的T-PBS1∶1000稀释),37℃摇床反应0.5小时。T-PBS洗板三次。加入二抗辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的IgG 100μL/孔(抗体用含BSA 5mg/mL的T-PBS1∶2000稀释),37℃摇床反应0.5小时。T-PBS洗板三次。加入2mg/mL的OPD显色液100mL/孔(用含有0.03%H2O2的0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=5.4)稀释),25℃避光反应1-10分钟。(OPD溶解时需用超声,显色液需现配现用)。加入2M H2SO4 50μL/孔中止反应,用可调波长式微孔板酶标仪SPECTRAMAX 190读数,波长为492nm。
样品的抑制率通过下列公式求得:
IC50值通过抑制曲线以四参数拟合计算。
表2:部分化合物的c-Met抑制活性
化合物名 | IC50(μM) | 化合物名 | IC50(μM) |
400-1 | 0.040 | 379-3 | 1.4 |
400-2 | 0.100 | 379-4 | 0.4 |
428-1 | 0.050 | 379-5 | 1.0 |
494 | 1.28 | 409 | 3.4 |
397 | 0.010 | 396 | 0.063 |
395-1 | 0.025 | 382-2 | 1.6 |
395-2 | 2.1 | 382-1 | 1.4 |
379-1 | 3.1 | 468 | 0.270 |
379-2 | 3.0 |
测试实施例三部分化合物细胞水平受体酪氨酸激酶c-Met酶活抑制试验
实验方法:免疫印迹杂交(Western Blot)检测化合物对HGF诱导的人肺癌A549细胞及人胃癌MNK45细胞中c-Met磷酸化的影响,阳性对照为SU11274(c-Met激酶的高特异性抑制剂)。
实验步骤:将处于对数生长期的A549细胞或MKN45细胞接种于6孔板中。待细胞长至半满后,将培养基换为无血清培养基,饥饿细胞18-24小时。然后加入分子水平评价得到的明确具有c-Met酶活抑制作用的各化合物(10μM)作用6小时后,加入20ng/mL HGF(均购自R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激15分钟。收集细胞。先用冷的PBS(含1mM钒酸钠)洗一次;然后加入85-100℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mM Tris-HCl(pH=6.8),100mMDTT,2%SDS,10%甘油,1mM钒酸钠,0.1%溴酚蓝]裂解细胞。细胞裂解物在沸水浴中加热10分钟后,于4℃12000rpm离心10分钟。
取上清液进行SDS-PAGE电泳(Mini-PROTEAN 3Cell,Bio-Rad,Hercules,CA,USA),电泳结束后,用半干电转移系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Amersham Life Sciences,Arlington Heights,IL,USA),将硝酸纤维素膜置于封闭液(5%脱脂奶粉稀释于含1mM钒酸钠的TBS)中室温封闭2小时,然后将膜置于抗磷酸化形式受体酪氨酸激酶c-Met的抗体溶液中4℃过夜。用含1mM钒酸钠的TBS洗涤三次,每次15min。将膜置于二抗溶液中室温反应1-2小时;同上洗膜3次后,用ECL(Picece,Rockford,IL)试剂发色,压片,显影。
将上述硝酸纤维素膜用Chemicon(Temecula,CA,USA)公司的ReblotTM溶液剥离除去已结合上的抗体后,重新封闭(5%脱脂奶粉稀释于TBS),用相应的非磷酸化形式的受体酪氨酸激酶c-Met的抗体及二抗依上述步骤重新检测。
利用本方法对所列举的化合物进行了活性筛选,部分结果见图1和图2。图1为部分化合物对A549细胞水平c-Met磷酸化的影响。图2为部分化合物对MNK45细胞水平c-Met磷酸化的影响。
测试实施例一表明在分子水平上,化合物400具有与广谱性激酶抑制剂sarafinib同样优秀的活性,同时也部分程度上说明了此系列可能是个广谱性的激酶抑制剂,具有广泛的抗肿瘤治疗应用的潜力。测试实施例二则说明了此一系列化合物对于c-Met激酶的抑制活性。测试实施例三进一步表明了此系列化合物在细胞水平上对于c-Met激活过程中所必须形成的自身磷酸化过程即p-Met的形成具有抑制作用。以上数据表明此系列化合物对于多种与肿瘤发生发展进程密切相关作用的激酶具有显著的抑制作用,因此对于此类化合物应用于肿瘤治疗药物方面的开发,具有很好创新潜力。
Claims (7)
1.一类由通式I表示的双香豆素类化合物:
其中:
X1和X2各自独立地为氨基或氧;
Z基团为-C(O)-NH-、-CH2-NH-C(O)-NH-CH2-、或
R1~R10各自独立地选自如下基团中的一种:H、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基;
当Z为-C(O)-NH-时,R1~R10不为C1-C6烷氧基。
2.一类双香豆素类化合物,其中,所述的双香豆素类化合物为选自以下化合物中的一种:
3.一种双香豆素类化合物的制备方法,该方法通过如下路线中的至少一种来实现:其中,X1、X2、R1~R10的定义与权利要求1相同;
路线二:
取代的3-氨基香豆素或3-氨基喹啉酮化合物和3-甲酸香豆素或3-甲酸喹啉酮在Py/DCM中,加入EDCI反应,即得以酰胺键连接的3,3’-双香豆素;
路线五:
取代的3-溴甲基化合物与叠氮化合物,经过叠氮基团取代和钯碳氢化还原得到3-氨甲基香豆素类化合物,随后在三光气及三乙胺的作用下3-氨甲基香豆素类化合物生成脲连接的双香豆素。
4.一类由通式I表示的双香豆素类化合物在制备蛋白酪氨酸激酶抑制剂的药物中的用途,
其中:
X1和X2各自独立地为氨基、C1-C6烷胺基或氧;
Z基团为直接键、C1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-CH2-NH-C(O)-NH-CH2-或
R1~R10各自独立地选自如下基团中的一种:H、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基。
5.根据权利要求4所述的用途,其中,所述蛋白酪氨酸激酶抑制剂的药物用于治疗肿瘤的侵袭和转移,或者抑制肿瘤新生血管的生成,或者抑制肿瘤的化疗抗性。
6.权利要求1或2所述的由通式I表示的双香豆素类化合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。
7.一种药物组合物,其包括治疗有效量的权利要求1或2所述的由通式I表示的双香豆素类化合物作为活性成分以及药学上可接受的辅料。
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