CN102552893B - 鸡球虫adf重组卡介苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸡球虫ADF重组卡介苗，同时还提供了该疫苗的的制备方法，获得鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊，提取RNA，反转录成cDNA，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，与PMD-18T载体连接进行克隆，测序鉴定正确后，酶切回收目的片段，再分别与用同种酶进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，连接正确的重组质粒转化到BCG中，经抗性筛选和PCR鉴定，获得阳性鸡柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗。该活载体疫苗稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产,产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验.免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。

Description

鸡球虫ADF重组卡介苗及制备方法

技术领域

本发明提供了一种鸡球虫ADF重组卡介苗，同时还提供了该疫苗的的制备方法，属基因工程技术领域。

背景技术

鸡球虫病是一种由艾美尔属的一种单细胞寄生性原虫引起的，全球性的原虫病，是严重危害养鸡业的重要疾病之一，其中以柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的危害最为严重。E.tenella主要寄生于鸡的盲肠上皮细胞。其裂殖体在盲肠上皮细胞内大量繁殖，严重破坏肠粘膜，盲肠肿胀出血，病鸡明显消瘦、食欲减退、发育停滞甚至死亡。该病分布广泛，长期以来主要依赖于药物和球虫活苗进行防治，但最近几年由于耐药虫株的出现，以及药物残留对人们的身体健康造成威胁而研发新药成本高、周期长，同时球虫活苗虫种毒力返强等潜在危害问题的存在，使人们将目光转向了分子疫苗。人们曾尝试过将球虫的抗原基因在不同的表达环境进行表达，但目前仍没有一种抗原基因能够提供完全的免疫保护，而且受表达系统的限制，以大肠杆菌为原核表达系统的重组蛋白抗原性较差；痘病毒载体疫苗由于病毒的特性, 只能进行一次免疫,无法满足球虫免疫的要求; 真核载体疫苗虽然可以引起机体的细胞免疫, 但是免疫途径比较麻烦; 沙门氏菌载体在实验室应用相对来说比较安全, 但若应用于临床, 就必须考虑安全性问题。因此，有必要采用基因工程方法发展一种高效，廉价的新型鸡球虫疫苗。

目前，卡介苗是世界上应用最为广泛和安全的疫苗。因与其它细菌载体和病毒载体相比有不可比拟的优势而成为重组活载体疫苗的首选。它本身是一种很好的非特异免疫增强剂,能增加机体免疫功能，免疫持久，单次接种即能诱导机体产生的细胞免疫和体液免疫,副作用小，并且易于生产,价格低廉,适宜于广大农村。

肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)是申请者在柔嫩艾美耳球虫cDNA表达文库和制备柔嫩艾美耳球虫子孢子特异性单抗的基础上，利用特异性单抗对柔嫩艾美耳球虫cDNA表达文库筛选获得的。ADF序列含有357bp的开放阅读框，可编码118个氨基酸，分子量为13.34kDa。其序列与其他生物体的ADF蛋白有高度的同源性，且与刚地弓形虫ADF同源性最高。CDD分析显示该蛋白具有肌动蛋白解聚因子保守结构域特征。含有肌动蛋白结合位点， F-actin 结合位点。 细胞骨架中的肌动蛋白参与了一系列重要生理活动，如肌肉收缩、胞质环流、细胞运动、胞质分裂等。这些过程的发生除了需要肌动蛋白以外，还需要一些与之结合的调节蛋白参与，如肌动蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)等，在一定条件下可以使肌动蛋白微丝解聚。因此柔嫩艾美耳球虫ADF基因对研究虫体的运动和侵入有重要意义。并且侵入蛋白也是重要的疫苗候选分子。ADF亚单位疫苗和核酸疫苗对鸡柔嫩艾美耳球虫的免疫保护试验表明，其有一定的免疫保护作用，但球虫ADF重组卡介苗尚无报导。

发明内容

本发明提供一种鸡球虫ADF重组卡介苗，为两种抗鸡柔嫩艾美耳球虫的新型活载体疫苗，解决了目前鸡球虫尚无理想疫苗的问题。

本发明还进一步公开了鸡球虫ADF重组卡介苗的制备方法，适用于工业化生产。

一、本发明提供的鸡球虫ADF重组卡介苗，是通过以下方法制成的：

首先获得鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊，提取RNA，反转录成cDNA，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，与PMD-18T载体连接进行克隆，测序鉴定正确后，酶切回收目的片段，再分别与用同种酶进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，连接正确的重组质粒转化到BCG中，经抗性筛选和PCR鉴定，获得阳性鸡柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗。

二、所述的鸡球虫ADF重组卡介苗，包括：

穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗，将其命名为rBCG PMV261-ADF和rBCG PMV361-ADF。

三、本发明公开的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：

从本试验室构建的柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2cDNA表达文库中筛选出ADF基因，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆。测序鉴定正确的质粒进行酶切，回收目的片段，与同种酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，提取质粒，将重组质粒ADF-261经电穿孔转化到卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，挑去菌落，筛选BCG重组子，PCR方法证实为阳性克隆后，45℃热诱导表达，对该表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定。

将制备好的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF以10⁷CFU/只的剂量,通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，同时设BCG组和红、白对照组，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，对体液免疫水平、ACI和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。

穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF可对抗中等剂量球虫的攻击,试验组和对照组相比,攻虫后卵囊排出量明显减少,体重增长明显增加，盲肠病变计分数值较小,保护率达到72.58%以上。各项指标均优于对照组。其中阴性对照组ACI值为104.31，而rBCG PMV261-ADF免疫组ACI值分别为161.47、152.73、149.35，说明使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，而滴鼻点眼ACI值达到160以上，以这种途径免疫抗球虫效果非常有效。BCG免疫的三组其ACI值在134.85~147.74之间，效果也高于对照组，提示我们单独使用BCG对增强鸡球虫免疫保护效果也有一定的作用，其中以滴鼻点眼方式免疫效果更好。穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗PMV261-ADF免疫雏鸡后，能同时诱导有效的细胞和体液免疫,表现为CD4+ T细胞数量和特异性抗体滴度明显高于对照组(P<0.01)。

四、本发明整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：

根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物并引入酶切位点，进行PCR，TA克隆，对测序鉴定正确的质粒进行双酶切，回收目的片段，与同种酶切的pMV361整合表达载体进行连接，转入DH5α感受态细胞中，提取质粒，将重组质粒ADF-361经电穿孔法转化到卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，挑去菌落，筛选BCG重组子，PCR方法证实为阳性克隆后，45℃热诱导表达，对该表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定。

将制备好的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF以10⁷CFU/只的剂量,通过滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射三种不同免疫途径免疫雏鸡，同时设BCG组和红、白对照组，三免一周后口服接种柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，对体液免疫水平、ACI和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。

使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，其中rBCG PMV361-ADF滴鼻点眼，口服和皮下注射免疫组ACI值分别为169.21，156.7和153.34，具有较好的抗球虫效果。整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV361-ADF可对抗中等剂量球虫的攻击,试验组和对照组相比,攻虫后卵囊排出量显著减少,体重增长显著增加，盲肠病变计分数值较小,三种免疫途径保护率分别为86.71%、77.70%、75.34%。以滴鼻点眼免疫方式效果更为明显。用整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗免疫雏鸡后能诱导有效的细胞免疫和体液免疫,CD4+ T细胞数量和特异性抗体滴度均较之阴性对照组有不同程度的提高(P<0.05)。本发明所提供的两种重组卡介苗疫苗菌株，本专利申请将其命名为rBCG PMV261-ADF和rBCG PMV361-ADF.

本发明提供的两种球虫重组卡介苗通过三种不同免疫途径即滴鼻点眼、口服、颈部皮下注射，免疫雏鸡，共免疫三次，在第三次免疫后一周，口服接种鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊进行攻虫试验，通过体液免疫水平、ACI和细胞免疫水平检测等指标进行综合评价。结果显示，球虫重组卡介苗rBCG PMV261-ADF和rBCG PMV361-ADF组均具有明显的免疫保护作用，各指标均强于阴性对照组，能够有效地抵抗柔嫩艾美耳球虫卵囊的攻击，ACI值到达170以上，具有很好的抗球虫效果。

卡介苗活载体疫苗是用于实验动物和人的最强免疫佐剂，本身能诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫作用，免疫力持久，而且又能高效表达重组蛋白，同时使表达的球虫蛋白发挥较好的免疫保护作用，两者的优势互相组合，达到更好的预防鸡球虫病的目的。rBCG 可以根据不同病原体的致病机制，采用不同的接种方式，而采用口服 呼吸道粘膜免疫不仅可诱导全身体液和细胞免疫反应，而且还能够诱发全身粘膜免疫反应，诱导具有特异性分泌性的IgA 产生，这对于鸡球虫病的预防来说尤其重要。ADF蛋白是组成微线的一类重要的肌动蛋白结合蛋白，在肌动蛋白纤维骨架的重建过程中以及寄生虫侵染宿主的过程中有重要作用。因此ADF基因有望成为防治柔嫩艾美耳球虫病的疫苗候选基因。

本发明的积极效果在于：这种活载体疫苗能发挥卡介苗本身较强的细胞免疫佐剂作用，同时使表达的蛋白发挥较强的免疫保护作用，达到更好的预防鸡球虫病的目的。这种新型活载体疫苗稳定性好，运输和保存较为容易，易于生产,产品不需纯化，可直接用于免疫保护试验.免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了成本，适宜于广大农村。

附图说明

图1为PMV261-ADF载体构建示意图；

图2为PMV361-ADF载体构建示意图；

图3为重组卡介苗pMV261-ADF经 SDS-PAGE分析结果；

重组卡介苗pMV261-ADF经 SDS-PAGE分析，在 17kD左右出现一条新的蛋白带，而非重组卡介苗蛋白则未见相应带出现。M 为标准蛋白marker；1 为卡介苗阴性对照；2 为重组质粒pMV261-ADF在卡介苗中表达的结果；

图4为重组卡介苗pMV361-ADF经 SDS-PAGE分析结果；

重组卡介苗pMV361-ADF经 SDS-PAGE分析，在 17kD左右出现一条新的蛋白带，而非重组卡介苗蛋白则未见相应带出现。M 为标准蛋白marker；1为重组卡介苗pMV361-ADF在卡介苗中表达的结果；2为卡介苗阴性对照；

图5为重组卡介苗pMV261-ADF经Western blotting分析的结果；

重组卡介苗pMV261-ADF表达的重组蛋白在相对分子质量约17kD处可见特异性反应条带。

图6为重组卡介苗pMV361-ADF经Westernblotting分析的结果；

重组卡介苗pMV361-ADF表达的重组蛋白，在相对分子质量约17kD处可见特异性反应条带。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

本发明球虫重组卡介苗疫苗的制备

本发明以球虫侵入相关基因ADF基因为例，进行穿梭表达载体和整合表达载体的构建。

一、穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备步骤：

参照ADF基因DNA序列及穿梭表达载体pMV261物理图谱设计两对特异性引物并引入酶切位点。

上游引物AD1： 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3；其中5`端含有PstI位点；

下游引物AD：5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3；5`端含有ClaI位点。

以cDNA为模板，用RT-PCR技术扩增ADF基因，将扩增产物连接至PMD18-T克隆载体后，进行PCR、酶切及测序鉴定，将凝胶回收的目的片段与用同种酶切的穿梭表达载体pMV261连接，同时连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，筛选重组质粒，用PstⅠ、ClaⅠ进行双酶切反应，重组质粒命名为PMV261-ADF，（如图1所示：将ADF目的基因与T载体进行连接，用PstⅠ、ClaⅠ进行双酶切反应，回收片段与同样进行酶切反应的穿梭载体PMV261进行连接，构建PMV261-ADF穿梭表达载体）。将BCG接种于MB7H9 ADC液体培养基中，37℃培养至对数生长期，取BCG菌液(600nm处OD值为0.5左右)，冰浴后，离心收集菌液，加入预冷甘油洗涤沉淀，重复洗涤两次，最后重悬1ml 10%甘油中，用于电转化。取60-80ulBCG感受态菌液加入0.1ug重组质粒PMV261-ADF置于电转杯中。电穿参数：电压2.5KV,电容25μF，电阻1000Ω。电穿孔转化后立即加入MB7H9 OADC培养基中，37℃培养48小时后涂布于含20ug/mlKan MB7H10 OADC培养基平板，约4w-6w后长出菌落。从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于MB7H9 OADC液体培养基（含Kan抗性）,37℃培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45℃水浴中诱导，离心收集菌体，菌体沉淀加入分枝杆菌裂解缓冲液以重悬沉淀，并加入终浓度为1%的SDS，溶菌酶至终浓度100μg/mL，37℃作用15min，超声波剪切DNA至溶液不再粘稠，最后加入等体积2×SDS-PAGE加样缓冲液，100℃煮沸10min后，，100℃5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析（如图3所示）及Western blotting 鉴定。重组卡介苗pMV261-ADF表达的重组蛋白在相对分子质量约17kD处可见特异性反应条带（如图5所示）。

二、整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备步骤：

参照ADF基因DNA序列及穿梭载体pMV361物理图谱设计两对引物并引入酶切位点。

上游引物AD2：5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3；其中5`端含有PvuⅡ位点；

下游引物AD：5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3；5`端含有ClaI位点。

以cDNA为模板，用RT-PCR技术扩增ADF基因，将扩增产物连接至PMD18-T克隆载体后，进行PCR、酶切及测序鉴定，将凝胶回收的目的片段与用同种酶切的穿梭表达载体Pmv361连接，同时连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞，筛选重组质粒，用PstⅠ、ClaⅠ进行双酶切反应，重组质粒命名为PMV361-ADF（如图2所示：将ADF目的基因与T载体进行连接，用PvuⅡ、ClaⅠ进行双酶切反应，回收片段与同样进行酶切反应的整合载体PMV361进行连接，构建PMV361-ADF整合表达载体）。取60-80ulBCG感受态菌液加入0.1ug重组质粒PMV261-ADF置于电转杯中。电穿参数：电压2.5KV,电容25μF，电阻1000Ω。电穿孔转化后立即加入MB7H9 OADC培养基中，37℃培养48小时后涂布于含20ug/mlKan MB7H10 OADC培养基平板，约4w-6w后长出菌落。从培养基平板上挑取BCG重组子，接种于MB7H9 OADC液体培养基（含Kan抗性）,37℃培养至对数生长期，PCR证实阳性克隆后，45℃水浴中诱导，离心收集菌体，菌体沉淀加入分枝杆菌裂解缓冲液以重悬沉淀，并加入终浓度为1%的SDS，溶菌酶至终浓度100μg/mL，37℃作用15min，超声波剪切DNA至溶液不再粘稠，最后加入等体积2×SDS-PAGE加样缓冲液，100℃煮沸10min后，，100℃5min。取12ul上述菌液SDS-PAGE分析（如图4所示）及Western blotting 鉴定。重组卡介苗pMV361-ADF表达的重组蛋白，在相对分子质量约17kD处可见特异性反应条带（如图6所示）。

实施例2

本发明球虫重组卡介苗疫苗的用途

一、穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的用途

实验动物为1日龄雏鸡，饲养于无球虫污染的铁笼中，自由采食，自由饮水。6日龄时，剔除弱雏和过大、过小鸡雏，将其余鸡只随机分为8组，每组20只。试验分pMV261-ADF免疫组， BCG免疫组和红白对照组。将重组卡介苗和BCG分别以10⁷CFU/只的剂量免疫雏鸡，并分别于1周和2周后进行加强免疫，采用滴鼻点眼、口服和颈部皮下注射三种免疫方式，三免后1周口服接种E.tenella孢子化卵囊1×104个/只进行攻虫试验。红白对照组接种PBS，红对照组最后攻虫，白对照组不攻虫。进行以下各项指标判定，包括保护率、相对增重率、OPG、ACI等；第三次免疫一周后取脾脏，分离脾淋巴细胞，流式细胞仪对CD4⁺、CD8⁺进行细胞水平免疫检测；每次免疫后采血，分离血清ELISA方法对体液免疫水平进行检测。

攻虫前对每组鸡逐只称重并标号记录，攻虫后一周对每组鸡再次逐只称重，观察攻虫后鸡的增重情况，计算相对增重；攻虫后每天检查粪便，并从第五天开始分别收集各组粪便，混匀后，每组各取2g，加入58mL饱和食盐水，取一滴置于改良的麦克马斯式计数板中，在低倍镜下记数球虫卵囊总数；于攻虫后第七天，每组取5只鸡剖杀，观察盲肠病变，按Johnson设计的病变记分法记分。计算ACI=相对增重率+存活率-病变值-卵囊记分。

结果显示各项指标均明显优于不免疫攻虫对照组，阴性对照组的ACI仅为104.31，而单独使用BCG能不同的提高抗球虫指数，其中BCG滴鼻点眼组ACI达到了147.74，发挥了BCG作为免疫增强剂的效果，效果尤为突出的是本发明所提供的穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF，免疫方式采用滴鼻点眼组，抗球虫指数ACI值均达到160以上，说明抗球虫效果非常有效。穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV261-ADF可对抗中等剂量球虫的攻击,试验组和对照组相比,攻虫后卵囊排出量显著减少,体重增长显著增加，盲肠病变计分数值较小,保护率达到72.85%以上。

将发明的新型活载体疫苗rBCG PMV261-ADF免疫雏鸡后，于第三次免疫后1周，每组随机各取10只鸡放血处死，取脾脏，加2mL Hank^，s液，用剪刀将脾脏剪成小块，在200目筛上研磨，用鸡脾淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用Hank^，s液稀释成细胞悬液（10⁶个/mL）。取100μL细胞悬液，加PE标记的抗CD4⁺和FITC标记的抗CD8⁺ 兔抗鸡单克隆抗体，用流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。结果表明免疫组及BCG组CD4 ⁺变量明显高于阴性对照组，其中rBCG PMV261-ADF滴鼻组和口服组鸡的CD4+ T淋巴细胞数升高较为明显，与对照组相比差异均极显著（P<0.01）。每次免疫前翅静脉采血，分离血清，用柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法对鸡血清中IgG变化情况进行检测。结果一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价，其中，rBCG PMV261-ADF滴鼻组血清抗体吸光度最高，与对照组相比差异极显著（P<0.01）。

二、整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的用途

实验动物为1日龄雏鸡，饲养于无球虫污染的铁笼中，自由采食，自由饮水。6日龄时，剔除弱雏和过大、过小鸡雏，将其余鸡只随机分为8组，每组20只。试验分pMV361-ADF免疫组，BCG免疫组和红白对照组。将重组卡介苗和BCG分别以10⁷CFU/只的剂量免疫雏鸡，并分别于1周和2周后进行加强免疫，采用滴鼻点眼、口服和颈部皮下注射三种免疫方式，三免后1周口服接种E.tenella孢子化卵囊1×104个/只进行攻虫试验。红白对照组接种PBS，红对照组最后攻虫，白对照组不攻虫。进行以下各项指标判定，包括保护率、相对增重率、OPG、ACI等；第三次免疫一周后取脾脏，分离脾淋巴细胞，流式细胞仪对CD4⁺、CD8⁺进行细胞水平免疫检测；每次免疫后采血，分离血清ELISA方法对体液免疫水平进行检测。

攻虫前对每组鸡逐只称重并标号记录，攻虫后一周对每组鸡再次逐只称重，观察攻虫后鸡的增重情况，计算相对增重；攻虫后每天检查粪便，并从第五天开始分别收集各组粪便，混匀后，每组各取2g，加入58mL饱和食盐水，取一滴置于改良的麦克马斯式计数板中，在低倍镜下记数球虫卵囊总数；于攻虫后第七天，每组取5只鸡剖杀，观察盲肠病变，按Johnson设计的病变记分法记分。计算ACI=相对增重率+存活率-病变值-卵囊记分。

使用重组卡介苗疫苗能不同程度的提高抗球虫指数，其中rBCG PMV361-ADF滴鼻点眼免疫组ACI值达到169.21，具有很好的抗球虫效果。整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗rBCG PMV361-ADF可对抗中等剂量球虫的攻击,试验组和对照组相比,攻虫后卵囊排出量显著减少,体重增长显著增加，盲肠病变计分数值较小,三种免疫途径保护率分别为86.71%、77.70%、75.34%。以滴鼻点眼免疫方式效果更为明显。

将发明的新型疫苗rBCG PMV361-ADF免疫雏鸡后，于第三次免疫后1周，每组随机各取10只鸡放血处死，取脾脏，加2mL Hank^，s液，用剪刀将脾脏剪成小块，在200目筛上研磨，用鸡脾淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用Hank^，s液稀释成细胞悬液（10⁶个/mL）。取100μL细胞悬液，加PE标记的抗CD4⁺和FITC标记的抗CD8⁺ 兔抗鸡单克隆抗体，用流式细胞仪检测CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞的数量，并用SPSS软件对所得数据进行统计学分析。结果表明免疫组及BCG组CD4⁺变量明显高于阴性对照组，其中rBCG PMV361-ADF免疫组与对照组相比差异极显著（P<0.01）。每次免疫前翅静脉采血，分离血清，用柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白作为包被抗原，通过间接ELISA方法对鸡血清中IgG变化情况进行检测。结果一免后各实验组与对照组相比IgG滴度变化不大，差异不显著。二免后IgG滴度逐渐上升，第三次免疫后，各实验组均显示一定的抗体效价，其中，rBCG PMV361-ADF滴鼻组血清抗体吸光度最高，于对照组相比差异极显著（P<0.01）。

SEQ ID NO.1

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）

<400> 1

atggcgagcg gaatgccagt caacgagtcc tgcgtgacta cgttcaacga actcaaactg 60

 cgtcactctt tcaaatggat catcttcaag attgaccacg atgagattgt ggtcgagaag 120

aagggcactg gtgacgcctc aactctcaca aaggaacttc cagctagtga ttgcagatac 180

gcagtgtacg atgaaggcca gaggatccac ttcatcttgt ggtccccgga ctgtgcccca 240

gtgaagccac gcatgattta ctcttcatcg aaggatgctt tggcgaagaa actggaggga 300

accgtggcga caaccctgga ggcccacgag ctcggcgacc taagcgtgct ccattag 357。

 

 

Claims (4)

1.一种鸡球虫ADF重组卡介苗，是通过以下方法制成的：首先获得鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊，提取RNA，反转录成cDNA，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，与PMD-18T载体连接进行克隆，测序鉴定正确后，酶切回收目的片段，再分别与用同种酶进行酶切反应的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体PMV261和整合表达载体PMV361相连，连接正确的重组质粒转化到BCG中，经抗性筛选和PCR鉴定，获得阳性鸡柔嫩艾美耳球虫重组卡介苗。

2. 权利要求1所述的鸡球虫ADF重组卡介苗，包括穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗和整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗。

3. 权利要求2所述穿梭表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：

将构建的柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2cDNA表达文库中筛选出ADF基因，根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物进行PCR，TA克隆；

测序鉴定正确的质粒进行酶切，回收目的片段，与同种酶切的pMV261穿梭表达载体进行连接，将连接产物转入DH5α感受态细胞中，提取质粒，将重组质粒ADF-261经电穿孔转化到卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，挑去菌落，筛选BCG重组子，PCR方法证实为阳性克隆后，45℃热诱导表达，对该表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定；

其中，

上游引物AD1： 5 AGCTGCAG ATG GCG AGC GGA ATG CCA GTC 3；

下游引物AD：5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3；。

4. 权利要求2所述整合表达载体球虫重组卡介苗疫苗的制备方法，包括以下步骤：

根据已克隆的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列的开放阅读框设计引物并引入酶切位点，进行PCR，TA克隆，对测序鉴定正确的质粒进行双酶切，回收目的片段，与同种酶切的pMV361整合表达载体进行连接，转入DH5α感受态细胞中，提取质粒，将重组质粒ADF-361经电穿孔法转化到卡介苗中，37℃培养至对数生长期后，挑去菌落，筛选BCG重组子，PCR方法证实为阳性克隆后，45℃热诱导表达，对该表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blotting 鉴定；

其中，

上游引物AD2：5 AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3；

下游引物AD：5 GAATCGAT CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3。

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