CN102552233B

CN102552233B - 3,4-二羟基苯甲酸甲酯在制备防治神经退行性疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN102552233B
Application number: CN201110441526.XA
Authority: CN
Inventors: 罗焕敏; 章正
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-12-26
Also published as: CN102552233A

Abstract

本发明公开了3,4-二羟基苯甲酸甲酯在制备防治神经退行性疾病药物中的应用。本发明发现了MDB或其衍生物兼有维持神经元（或神经细胞）存活和促进突起生长的双重作用，可用于开发神经营养因子拟似剂治疗神经退行性疾病（AD、PD等）及其他相关疾病；也可用于细胞及基因移植治疗神经退行性疾病（AD、PD等）及其他相关疾病。本发明确定了MDB的新的药理活性，其药效机制的阐明为开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。

Description

3,4-二羟基苯甲酸甲酯在制备防治神经退行性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及3,4-二羟基苯甲酸甲酯或其衍生物在制备防治神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术

神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）、帕金森综合症（PD）、亨廷顿病（HD）、肌萎缩性侧索硬化症（ALS）等，都与神经元或突触的丢失有关。AD病理研究发现，AD病人脑内存在神经再生现象，只是作用太弱，不足以弥补神经元丢失。广义的神经再生包括两个方面：一是神经元胞体的再生，即由神经干细胞分裂补充丢失的神经元，这种现象称之为神经生成或神经发生（neurogenesis）。通过激活大脑内源性的干细胞或外源性干细胞移植来补充已死亡或受损的神经元，可以达到治疗AD的目的。二是神经突起的再生，即受损的神经元重新生长出突起或已受损的神经突起再伸长，与其它神经元重新建立连接，恢复神经网络，即通常所说的神经再生（nerve regeneration），也有人称之为神经恢复（neurorestoration）。

随着人口老龄化，神经退行性疾病发病显著增加，已成为严重威胁人类健康的疾病。该类疾病病因复杂，致病机制不很明确，目前尚未找到有效的治疗方法。正常老年人神经元的萎缩以及神经退行性疾病中神经元的退行性变、死亡都与神经营养的减少和缺乏有关。在AD患者大脑局部应用神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），可减轻患者痴呆症状。但由于NGF、bFGF等是蛋白质生物大分子，生物利用度低及难以透过血脑屏障等药动学特性，制约了其临床应用。目前用于治疗AD的药物主要有胆碱酯酶抑制剂（ChEI）、钙离子拮抗剂、抗氧化剂、抗炎药物、他汀类降血脂药物及脑代谢激活剂等。现有的治疗AD药物大多是针对该病的某些症状进行治疗，缺乏对已知病因的干预。故寻找具有神经营养作用的脂溶性小分子药物在神经退行性疾病治疗方面具有潜在的应用前景。

3, 4-二羟基苯甲酸甲酯（MDB）是一酚酸类衍生物，存在于多种天然植物中，如马兰、东亚唐松草、白花蛇舌草等。MDB化学结构式如下：

目前文献报道其具有抗氧化活性，但未见其促进神经元生长方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供3, 4-二羟基苯甲酸甲酯（methyl 3,4-dihydroxybenzoate, MDB）的新用途。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

3, 4-二羟基苯甲酸甲酯（methyl 3,4-dihydroxybenzoate, MDB）或MDB的衍生物在制备防治神经退行性疾病或其他相关疾病的药物中的用途。经过研究发现，3, 4-二羟基苯甲酸甲酯的衍生物也具有防治神经退行性疾病或其他相关疾病的作用，可用于制备防治这些疾病的药物。

所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、肌萎缩性侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）、不同类型脊髓小脑共济失调（spinal cerebellar ataxias）、Pick病（Pick’s disease）、亨廷顿氏病（Huntington's disease，HD）、脑缺血（cerebral ischemia，CI）、脑损伤（brain injury，BI）、癫痫（epilepsy）等。

在制备防治神经退行性疾病或其他相关疾病的药物时，可以根据实际需要，将有效量的3, 4-二羟基苯甲酸甲酯和药学上可接受的载体制备成各种剂型，如片剂、胶囊剂、乳膏剂、口服液、喷雾剂、针剂或粉针剂等。

本发明通过药效学实验证明，3,4-二羟基苯甲酸甲酯能明显增强神经元或神经细胞的活性，促进神经元突起生长，促进神经元MAP2 及BDNF mRNA表达，使神经网络更发达，与神经营养因子的作用类似，具有潜在的治疗神经退行性疾病及其他相关疾病的作用。

本发明的原理是： 3,4-二羟基苯甲酸甲酯是小分子化合物容易透过血脑屏障到达脑部发挥作用。该小分子化合物可以模拟神经营养素的功能激活Trk受体或其他受体，或者促进神经元自身分泌神经营养素来达到促进神经元存活和突起生长的作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明采用体外培养大鼠皮质神经元，建立缺营养细胞模型，采用无血清培养神经元，避免了由于血清的成分复杂，不同批次的血清性质差异对研究结果造成的影响，保证神经元的纯度，培养条件稳定。

（2）本发明发现了一种重要小分子化合物3,4-二羟基苯甲酸甲酯的新用途，即3,4-二羟基苯甲酸甲酯兼有维持神经元存活和促进突起生长的双重作用，可以在成人神经细胞的存活、突起生长、神经网络构建以及神经系统的可塑性等方面发挥关键性的作用。

（3）本发明发现3,4-二羟基苯甲酸甲酯与神经营养因子的作用类似，可预防突触的丢失、突起的损伤，具备治疗神经退行性变的潜力。

（4）3,4-二羟基苯甲酸甲酯可以针对病因发挥作用，目前神经退行性疾病及其他相关疾病的治疗药物效果不理想，其主要原因为没有针对发病的根本原因发挥作用。

附图说明

图1是实施例1新生大鼠皮质神经元的形态学观察及鉴定图。图中A为培养3天的神经元；B为MAP2免疫荧光染色；C为NSE染色。

图2是实施例1中3,4-二羟基苯甲酸甲酯对原代皮质神经元平均突起长度测定结果图，与溶剂对照组相比 *p<0.05; **p<0.01。

图3是实施例1中原代皮质神经元MAP2免疫荧光染色结果图。图中A为溶剂（DMSO）对照组；B为阳性药对照（BDNF）组；C-E分别为3,4-二羟基苯甲酸甲酯2μM、4μM、8μM剂量组。

图4是实施例2 MTT测定结果；3,4-二羟基苯甲酸甲酯对原代皮质神经元活性的影响。与溶剂对照组相比 *p<0.05; **p<0.01。

图5是实施例3原代皮质神经元MAP2 mRNA半定量RT-PCR结果（n=3）。与溶剂对照组相比 *p<0.05; **p<0.01。

图6是实施例4 Real-time PCR检测中的引物溶解曲线及扩增曲线。(A)BDNF引物溶解曲线；(B)GAPDH溶解曲线；(C)BDNF和GAPDH的扩增曲线。

图7是实施例4 BDNF mRNA表达量检测结果，与溶剂对照组相比 *p<0.05; **p<0.01。

图8是实施例5 MDB对原代皮质神经元Akt磷酸化的影响检测结果。

图9是实施例6 3,4-二羟基苯甲酸以酯对原代皮质神经元活性的影响。与溶剂对照组相比*p<0.05; **p<0.01。

图10是实施例7 衍生物对原代皮质神经元活性的影响的比较。与溶剂对照组相比 **p<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步详细阐述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中乙醇浓度均为体积百分浓度。

实施例1 3,4-二羟基苯甲酸甲酯促进大鼠皮层神经元突起生长

1. 大鼠皮质神经元的原代培养

取所需数量的新生鼠，于75%乙醇中浸泡20秒。剪开皮肤和颅骨，将取出的大脑置于D-Hanks缓冲液中，分离脑膜及海马，保留皮质。将皮质移入一装有约2ml D-Hanks 缓冲液的青霉素小瓶中，用眼科剪将其剪碎，向小瓶中加入1mL 0.25%蛋白酶，放入培养箱消化10分钟。用含10% FBS的DMEM/F12以终止消化。用400目的滤网过滤，收集滤液转移至15ml离心管中，1000 r/min离心5分钟。去上清，加入2 mL 接种液（含0.4% B-27的DMEM/F12），用移液器轻柔吹打30次左右，使其成细胞悬液。取50μL细胞悬液和50μL 0.4%胎盼蓝1:1混匀，滴加到细胞计数板计数。按需要的数量接种，置于细胞培养箱中培养（37℃，5%CO₂，恒湿）。接种5小时后，待细胞贴壁，吸去培养基，加入新的含0.4% B27的DMEM/F12，并按比例加入受试化合物，使其至工作浓度。继续培养72小时，进行下一步实验。

神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色鉴定

用24孔板培养神经元，3天后将培养基弃去，用PBS漂洗2次，每次1分钟。用4%多聚甲醛溶液室温固定30分钟。PBS漂洗3次，每次2分钟。用30% H₂O₂和甲醇按1∶50的量混合，室温浸泡细胞20分钟，灭活内源性过氧化物酶。PBS漂洗3次，每次2分钟。加入山羊血清封闭液，室温封闭20分钟。除去封闭液，加入一抗（NSE），放入湿盒，置于4℃冰箱过夜。吸去一抗，用PBS漂洗3次，每次2分钟。滴加二抗（IgG），室温20分钟。PBS漂洗3次，每次2分钟。滴加SABC试剂，室温20分钟。PBS漂洗3次，每次4分钟。DAB显色（取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀）室温显色，镜下控制反应时间。待完全显色后，用PBS漂洗3次，每次4分钟。加入500μL PBS覆盖后，镜下观察结果并拍照，见图1C。

微管相关蛋白2（MAP2）免疫荧光细胞染色

弃去培养基，用PBS洗一遍。用4%多聚甲醛溶液室温固定神经元20分钟。PBS洗细胞两次。用0.1% TritonX-100室温渗透处理细胞10分钟（24孔板每孔加入500 μL）。用0.1% BSA室温封闭30分钟。用封闭液稀释一抗至工作浓度，置于湿盒内，4℃冰箱孵育过夜。除去一抗，用PBS洗3次（5～10分钟/次）。Cy3标记的二抗临用前用PBS稀释至工作浓度，湿盒内室温孵育二抗30分钟。除去二抗，用PBS洗细胞3次（5～10分钟/次），加入500μL PBS覆盖后镜下观察并拍照，见图1B。

新生大鼠皮质神经元采用无血清（DMEM/F12+0.4% B27）培养，以减少胶质细胞的影响。培养5小时后，已贴壁的细胞折光性好，胞体较大的细胞占胞体较小细胞数的1/3，分布较均匀。培养72小时后，细胞胞体增大较快且长突起的细胞数增加，胞体饱满，突起逐渐伸长，见图1A。采用MAP2及NSE对神经元进行鉴定，可见大鼠皮质神经元的纯度较高，可用于后续实验。

二羟基苯甲酸甲酯促进大鼠皮层神经元突起生长

将神经元按35000 cells/cm²的密度接种于24孔板中，5小时后换液时分为溶剂对照组（DMSO），阳性药对照组（BDNF）以及受试药物（MDB）的各剂量组（2μM、4μM、8μM和16μM），每组4个复孔。培养72小时后于倒置显微镜下（×400）每孔随机选取15个视野拍照，用软件Image-pro plus 6.0处理照片，突起长度大于两倍细胞直径的细胞将被记录。同时也进行MAP2免疫荧光检测，以便于更直观的观察。原代皮质神经元平均突起长度测定结果见图2，MAP2免疫荧光染色结果见图3。

大鼠皮质神经元经BDNF及受试药处理72小时后，进行MAP2免疫荧光染色及细胞突起长度的测量。由免疫荧光的结果可以看出，溶剂对照组的神经元突起数目少，长度短。BDNF组和受试药物低（2μM）、中（4μM）、高（8μM）剂量组的神经元突起数量多且较溶剂组更长，有网状形成。用图像分析软件测量突起长度，经SPSS软件统计后得出，与溶剂对照组相比，阳性药对照组与受试药各组均有显著性差异，且受试药各组呈剂量依赖关系。表明3,4-二羟基苯甲酸甲酯能促进皮质神经元突起的生长。

实施例2 3,4-二羟基苯甲酸甲酯对大鼠皮质神经元活性的影响

将神经元以1.2×10⁵ cells/cm²的密度接种于96孔板中，5小时后换液时分为溶剂对照组（DMSO），阳性药对照组（BDNF）以及受试药（MDB）各剂量组（2μM、4μM、8μM和16μM），每组6个复孔。继续培养72小时后吸去培养基，每孔加入100μL DMEM/F12+ 10μL MTT，继续培养4小时。吸去培养基，加入150μL DMSO，振荡10分钟，于酶标仪上570nm波长检测。结果（见图4）表明，用阳性对照药（BDNF）及不同浓度的3,4-二羟基苯甲酸甲酯加入培养基，培养72小时后，经MTT法检测，与溶剂对照组相比，BDNF（20ng/ml）组和受试药物（2μM～16μM）均能提高细胞的活性，促进神经元的存活，差异有统计学意义。

实施例3 3,4-二羟基苯甲酸甲酯对大鼠皮层神经元MAP2 mRNA表达的影响

（1）引物的设计与合成　

根据Genebank的序列，用Primer 5.0软件设计目的基因及内参基因引物，由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成（表1）。

（2）细胞总RNA的提取　

将神经元以1.2×10⁵ cells/cm²的密度接种于6孔板中，5小时后换液时分为溶剂对照组（DMSO），阳性药对照组（BDNF 20ng/ml）以及受试药（MDB）各剂量组（2μM、4μM、8μM）。每组一个孔，实验重复三次。神经元培养至第3天，收集每组培养的细胞，加1 mL Trizol RNA提取试剂裂解，200μL氯仿抽提，高速离心（12000 g/min，10min），上清加等体积异丙醇离心沉淀，用体积百分比浓度为75%的乙醇洗涤，室温晾干沉淀，加DEPC水溶液溶解RNA。

（3）cDNA合成及PCR扩增参照试剂盒说明书进行。

MAP2是微管相关蛋白（MAPs）的主要成分，在神经元的胞体、轴突、树突中均有表达。通过对MAP2 mRNA表达量的定性检测，结果显示与溶剂对照组相比，BDNF组及受试药物低、中、高剂量组均能使MAP2 mRNA表达量增加，差异有统计学意义，且与形态学研究结果一致（图5）。

实施例4 3,4-二羟基苯甲酸甲酯对大鼠皮质神经元BDNF mRNA表达的影响

将神经元以1.2×10⁵ cells/cm²的密度接种于6孔板中，5小时后换液时分为溶剂对照组（DMSO），受试药（MDB）各剂量组（2μM、4μM、8μM）。每组一个孔，实验重复三次。BDNF和GAPDH引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，见表1。

本实验Real-time PCR检测采用SYBR

Green法。SYBR

Green I 是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，荧光强度大大增加。这一特性使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR

Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。由于神经营养因子在神经元中表达水平较低，用Real-time PCR定量分析，结果准确可靠。

图6中A和B分别为BDNF和GAPDH引物的溶解曲线，可见峰形窄而尖，说明引物特性良好。C为BDNF和GAPDH的扩增曲线，可见明显的指数扩增期和平台期，说明本实验的反应条件可靠，扩增效率较好。

与溶剂对照组相比，低（2 μM）、中（4 μM）、高（8μM）三个剂量的受试药物中，中、高剂量均能促进新生大鼠皮质神经元BDNF mRNA的表达，具有统计学意义，亦即3,4-二羟基苯甲酸甲酯能促进神经元BDNF mRNA的表达，见图7。

表1 大鼠MAP2和GAPDH的引物序列

实施例5 MDB促进神经元突起的可能通路

将神经元以1.2×10⁵ cells/cm²的密度接种于6孔板中，5小时后换液时分为4个组，第1组加入DMSO，作为溶剂对照；第2组加入PI3K抑制剂（LY294002），浓度为10μM；第3组加入受试药物（MDB），浓度为8μM；第4组加入LY294002和MDB，浓度分别为8μM和10μM。继续培养72小时后吸去培养基，加入细胞裂解液提取总蛋白，用western blot检测各组Akt磷酸化水平。结果显示，单独加入PI3K抑制剂（LY294002），Akt磷酸化明显受到抑制，较溶剂对照明显下降，说明抑制剂在该浓度有效。单独加入受试药物（MDB），磷酸化水平显著升高，且高于溶剂对照组。同时加入抑制剂（LY294002）和受试药物（MDB），磷酸化水平与单独加抑制剂接近。因此，可以认为MDB促进神经元突起生长可能通过PI3K通路。

实施例6 3,4-二羟基苯甲酸乙酯对大鼠皮质神经元活性的影响。

将神经元以1.2×10⁵ cells/cm²的密度接种于96孔板中，5小时后换液时分为溶剂对照组（DMSO），受试药各剂量组（2μM、4μM、8μM），每组6个复孔。继续培养72小时后吸去培养基，每孔加入100 μL DMEM/F12+ 10μL MTT，继续培养4小时。吸去培养基，加入150μL DMSO，振荡10分钟，于酶标仪上570nm波长检测。结果（见图9）表明，不同浓度的3,4-二羟基苯甲酸乙酯加入培养基，培养72小时后，经MTT法检测，与溶剂对照组相比，受试药物4μM，8μM组均能提高细胞的活性，促进神经元的存活，差异有统计学意义。

实施例7 3,4-二羟基苯甲酸甲酯及衍生物对大鼠皮质神经元活性的影响对比。

经过实验室对小分子化合物的筛选，确定了3,4-二羟基苯甲酸，以及其甲酯和乙酯（即3,4-二羟基苯甲酸甲酯和3,4-二羟基苯甲酸乙酯）对于神经元作用的最佳浓度分别为64μM、8μM、4μM。按照实施例6中的实验方法，考察三个化合物在其最佳浓度下对大鼠皮质神经元存活的影响。结果（见图10）表明，在其最佳作用浓度下，3,4-二羟基苯甲酸甲酯的效果相对更好。

尽管本发明是以3,4-二羟基苯甲酸甲酯类似神经营养因子的作用在治疗神经退行性疾病及其他相关疾病中的应用为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，3,4-二羟基苯甲酸甲酯的衍生物、混合物和/或其它种类的细胞以及实施例的其它变形，对于本领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围和精神。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 3,4-二羟基苯甲酸甲酯在制备防治神经退行性疾病药物中的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtacctgga ggtggtaacg taa 23

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<211> 20

<212> DNA

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acctgcttgg cgactgtgtg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agcctcctct gctctttctg 20

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atgggattac acttggtctc g 21

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<212> DNA

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<400> 5

ggcaagttca acggcaca 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccacagcttt ccagaggg 18

Claims

1.3,4-二羟基苯甲酸甲酯在制备促进神经元突起生长的药物中的应用。