CN114099488A - 没食子酸或其衍生物在诱导神经干细胞分化和增殖中的应用 - Google Patents

没食子酸或其衍生物在诱导神经干细胞分化和增殖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了没食子酸或其衍生物在诱导神经干细胞分化和增殖中的应用，其中，发明人通过研究发现，没食子酸或其衍生物能够很好的诱导神经干细胞分化和增殖，而且发现了其调节钙信号相关通路进而调节NSC增殖的作用机制，从而可以实现体外诱导大脑中原有的NSC转分化为新生神经元，为治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病上提供了一种切实可行的临床治疗方案，具有极好的应用前景。

Description

没食子酸或其衍生物在诱导神经干细胞分化和增殖中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，特别涉及没食子酸或其衍生物在诱导神经干细胞分化和增殖中的 应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种起病隐匿、呈进行性发展的神经退行性 疾病，患者最主要的表现为记忆障碍、认知功能下降、语言和行为能力衰退，严重者甚至生 活不能自理。AD损害的部位主要是与认知和记忆功能相关的脑区，其中颞叶内侧中的海马 部位病变最明显。主要病理学特征表现为：细胞外可见β淀粉样蛋白(amyloid betaprotein， Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaque，SP)、细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维 缠结(neurofibrillary tangle，NFT)以及大量神经元丢失等。但关于其实际的发病原因，目前 尚未有确切的机制能够阐明。相关技术中，所有针对AD的临床治疗只能延缓病情进展，而 不能彻底治愈疾病。常见的AD治疗药物均存在较大的副作用，如：服用乙酰胆碱酯酶抑制 剂存在一过性的胃肠道反应，而且约有三分之一的患者不具有乙酰胆碱酯酶抑制剂耐受性。 因此，开发一种耐受性好，治疗效果显著的AD治疗药物对于控制AD病情，提供患者生活 质量具有极为重要的意义。
神经干细胞(neural stem cell，NSC)是一类具有分化潜能、自我更新能力、静止能力等 特性的细胞。根据分化潜能和产生子细胞种类的不同，神经干细胞可以分为神经管上皮细胞、 放射状胶质神经元、神经母细胞和神经前体细胞；根据所处部位不同，神经干细胞又可分为 中枢神经干细胞和神经嵴干细胞。曾有研究将鼠源性神经干细胞移植到转基因AD小鼠体内， 发现外源性神经干细胞介导BDNF生成，并改善模型小鼠的空间学习和记忆障碍。
基于目前全球多个抗AD药物研发宣告失败，寻找新的AD治疗途径迫在眉睫，而获得 一类能够具有诱导NSC分化和增殖作用的小分子化合物，并探索出其诱导增殖作用的机制， 将为小分子化合物结构改造和AD治疗候选药物开发提供一定的思路和实验依据。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出没食子酸 或其衍生物在诱导神经干细胞分化和增殖中的应用。发明人发现，没食子酸或其衍生物能够 很好的诱导神经干细胞分化和增殖，从而诱导大脑中原有的NSC转分化为新生神经元，从而 在治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病上具有极好的应用前景，可以作为一种切 实可行的临床治疗方案。
本发明的第一个方面，提供没食子酸或其衍生物在制备神经干细胞诱导分化试剂中的应 用。
NSC是一种存在于神经系统中，能进行自我更新，并具有分化为神经元、星形胶质细胞 和少突胶质细胞潜能的细胞群。NSC具有对称分裂和不对称分裂两种分裂方式，不同的NSC 类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。在脑内，NSC主要分布于室管膜、脑室下区、 纹状体、海马齿状回、嗅球等部位。在本发明中使用DMEM/F12+20ng/mL EGF+10ng/mLbFGF+2％不含维生素A的B27作为NSC培养基，选取新生SD大鼠海马原代NSC培养作 为试验对象，能够充分显示出没食子酸或其衍生物对于神经干细胞诱导分化和诱导增殖效果， 其试验结果在本领域中具有较好的认可度和代表性。
在本发明实施例中，发明人通过未成熟神经元标志物Tuj1和星形胶质细胞标志物GFAP 检测等手段，均有效验证了没食子酸或其衍生物可诱导NSC分化为未成熟的神经元和星形胶 质细胞。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述没食子酸或其衍生物包括： 没食子酸及其酯化物、醚化物、烷基取代物、药用盐、酰胺化物中的至少一种。
在本发明实施例中，发明人主要验证了GA和MG两种以GA为母核的结构相似化合物的药效学结果。结果表明，GA诱导NSC分化为神经元的效果优于MG，其虽然在诱导分化 能力上略逊于阳性药物MDHB，但其具有MDHB不具有的促增殖作用。而且，根据本发明 实施例中使用的其他的结构差异性相对较大的其他化合物，可以发现，当化合物的立体构型 发生改变时，例如酚羟基位于苯环上不同位置、酚羟基被替换为其他基团，化合物的药理活 性会产生明显差异，其原因可能是因为这些基团能够与NSC上不同的作用靶点相结合从而各 自产生不同表型。此外，药物的活性与油水分配系数(log P)、疏水性也有着密切的关系。如表1所示，以儿茶酚为母核，可以发现9个化合物的log P值差异明显。GA结构中较多的酚 羟基，分子极性大，因此其跨细胞膜进入细胞内部的能力相对较弱，极有可能是结合于细胞膜上而非细胞内部的受体发挥药理作用。对于GA而言，其结构更复杂的衍生物，如取代基为芳香杂环的分子，可能会因为引入芳香环导致整个分子的电负性增强，疏水性会进一步增 加，随之药物跨膜量也可以增加，甚至可能在一定范围内使生物利用度得到提高。因此，后 续若以GA为基础进行结构改造，可在保留3,4-二羟基的基础上适当增加吡啶、噻唑、噁唑 一类的杂环，或是引入一些极性较小的烷基。此外，还可以通过制成前药、改变剂型等方式 来提高GA的生物利用度。
在本发明的一些优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物为没食子酸和没食子酸甲酯 中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物的给药剂量为20～40μM。
本发明的第二个方面，提供没食子酸或其衍生物在制备神经干细胞诱导增殖试剂中的应 用。
相关技术中，仍主要以内源性小分子作为促进干细胞增殖的主要研究方向，如表皮生长 因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和粒细胞集落刺 激因子(G-CSF)等，但对于小分子化合物来说研究尚且薄弱。在本发明实施例中，发明人利用Nestin检测、Ki67检测(Ki67常被用于标记除静止期和G1初期以外的细胞周期)和PH3蛋白检测(PH3用于标记处于G2晚期和M期的增殖细胞)验证了GA具有可以持续诱导NSC 增殖的作用，而作为阳性对照的MDHB并不具有此作用，从而发现了GA或其衍生物可能具 有的新的医药用途。
一般情况下，如果细胞周期被抑制则会驱使细胞进入到分化阶段，因此，干细胞增殖和 分化属于两个相反的作用方向。在正常发育过程中，处于分化状态的细胞比例往往大于处于 增殖状态的比例。但在本发明中，通过使用GA或其衍生物，改变了固有的分化和增殖的比 例，GA使得增殖作用同样显著。因此，在AD患者大脑中，使用GA或其衍生物可以使其脑 内神经干细胞既分化产生神经元来修复受损的神经网络，又能打破增殖数量有限的限制，将 对于AD病情的改善和治疗提供了一种更为理想的治疗策略。
为了明确GA主要通过哪个受体和哪一条下游通路发挥促增殖作用，在本发明实施例中， 发明人采用了转录组测序技术(RNA sequencing，RNA-seq)的方法进行探究，通过将GA处 理组与溶剂对照组(DMSO)的基因进行比较，筛选出GA处理组相对于溶剂对照组表达量 有显著差异的基因，将这些基因按照表达差异的大小排序，然后应用超几何检验，将这些差 异基因通过KEGG富集分析方法找到在基因中显著性富集的通路，确定基因参与的最主要信 号转导途径。结果显示，GA可能通过调节钙信号相关通路进而调节NSC增殖，其在细胞膜 上的结合靶点为血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)受体。
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)受体属于受体酪氨酸激酶 (RTK)中的一种。PDGF受体分为α和β两个亚单元，可以结合形成αα、αβ、ββ三种二聚 体形式，在调控细胞增殖、分化、生长、发育过程中扮演着重要角色。PDGF受体介导了下游多条信号通路的调控，如PI3K/Akt通路、MAPK激酶信号级联、JAK/STAT通路等。当外 界信号分子与PDGF受体细胞外结构域结合后，两个单体受体分子在膜上形成二聚体，使尾 部酪氨酸残基磷酸化，导致形成信号复合物作用于下游一条或多条信号转导途径，最终协同 引起细胞的综合性应答。发明人通过实施例发现了GA对PI3K/Akt通路关键节点蛋白总Akt 和磷酸化Akt蛋白表达水平影响不大，但其在MAPK/ERK通路中则可以激活节点蛋白ERK1/2 的磷酸化(但ERK1/2总量不受影响)，因此，可以说明GA是通过激活MAPK/ERK通路中 的ERK1/2蛋白磷酸化活性来促进神经干细胞增殖的。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述没食子酸或其衍生物包括： 没食子酸及其酯化物、醚化物、烷基取代物、药用盐、酰胺化物中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物为没食子酸和没食子酸甲酯 中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物的给药剂量为20～40μM。
本发明的第三个方面，提供没食子酸或其衍生物在制备神经退行性疾病治疗药物中的应 用。
神经元受损后大量死亡是AD和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神经退行性疾病 的主要表现。神经元的缺失使得神经网络正常运作被打破，如果可以刺激神经元再生重新修 复神经网络，或许可以改善下降的运动和记忆功能。而利用小分子化合物诱导大脑中原有的 NSC转分化为新生神经元，既能改善神经退行性疾病症状，也避免了干细胞移植法带来的致 瘤性和排异反应，是一种很有临床应用前景的治疗方法。发明人以MDHB为阳性对照，发现 没食子酸或其衍生物也具有诱导NSC分化成为神经元的作用。经没食子酸或其衍生物处理后 的具神经元形态细胞比例显著高于溶剂对照组(DMSO)，且细胞活性好，毒性低。处理后的 细胞均胞体立体感强，有明显的突起，突起的立体感也较强，MG组细胞突起较粗，GA组细 胞突起形态呈多样性，有的突起较粗，有的较为细长，而突起最为细短的一类细胞胞体立体 感最强，在效果上甚至优于阳性对照MDHB(各组细胞数目：GA组>MDHB组>MG组)。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述没食子酸或其衍生物包括： 没食子酸及其酯化物、醚化物、烷基取代物、药用盐、酰胺化物中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物为没食子酸和没食子酸甲酯 中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物的给药剂量为20～40μM。
本发明的第四个方面，提供没食子酸或其衍生物在制备ERK1/2蛋白磷酸化激活试剂中 的应用。
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述没食子酸或其衍生物包括： 没食子酸及其酯化物、醚化物、烷基取代物、药用盐、酰胺化物中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物为没食子酸和没食子酸甲酯 中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物的给药剂量为20～40μM。
本发明的第五个方面，提供一种神经退行性疾病治疗药物，该治疗药物中含有没食子酸 或其衍生物。
外源性干细胞对衰竭的神经回路进行再生和修复也是一种合理的治疗策略。移植入AD 患者大脑的神经干细胞通过迁移、定植并分化为神经元和神经胶质细胞，可分泌大量神经保 护因子，增加神经突触和神经纤维密度，抑制炎症因子的分泌，修复受损的部分神经环路。 因此，基于没食子酸或其衍生物实现的体外神经干细胞诱导分化及增殖将对于神经退行性疾 病的治疗具有极为重要的意义。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述没食子酸或其衍生物包括： 没食子酸及其酯化物、醚化物、烷基取代物、药用盐、酰胺化物中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述没食子酸或其衍生物为没食子酸和没食子酸甲酯 中的至少一种。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述神经退行性疾病包括帕金 森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，所述神经退行性疾病为帕金森病和阿尔茨海默病。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述治疗药物的剂型包括注射 剂、溶液剂、片剂、丸剂和散剂中的至少一种。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他剂型以达到特定的使用效 果。
本发明的有益效果是：
1.本发明发现了没食子酸或其衍生物能够诱导神经干细胞分化，且兼具诱导神经干细胞 增殖的作用，具有显著的神经营养活性。而且，还发现了GA是通过激活PDGF受体下游 MAPK/ERK通路关键蛋白ERK1/2磷酸化发挥促增殖作用。从而对于GA或其衍生物的进一步开发和利用提供了有效的理论支持和科学依据。
2.基于本发明中的没食子酸或其衍生物的诱导神经干细胞分化和促增殖作用，其可以极 好的用于治疗神经退行性疾病，如帕金森病和阿尔茨海默病。通过没食子酸或其衍生物实现
附图说明
图1为本发明实施例中培养的神经干细胞组成的原代神经球的Nestin和DAPI荧光染色 图。
图2为本发明实施例中培养的体外神经球的形态图(A)及其中的Nestin和DAPI百分 比柱形图(B)。
图3为本发明实施例中化合物cpd1～9分别在0、1、5、10、20和40μM剂量下对神经干细胞活性影响的折线图，其中，与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，n＝3。
图4为本发明实施例中不同浓度化合物cpd 1(PCA)、cpd 3(GA)、cpd 7(MV)、cpd 8(MG)和cpd 9(MDHB)对神经干细胞分化的分化率的影响。
图5为本发明实施例中经MG、GA和MDHB处理的神经干细胞分化细胞的形态图像。
图6为本发明实施例中25和30μM剂量的MG、GA和MDHB分别处理神经干细胞分 化的分化率的影响，其中，与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，***P＜0.0001；与MDHB组相比，#P＜0.05，#P＜0.01，#P＜0.001；n＝3。
图7为本发明实施例中用神经元标记物Tuji1和星形胶质细胞标记物GFAP对MG、GA和MDHB诱导的神经干细胞分化的细胞进行免疫染色的细胞图像，同时，以DAPI进行细胞 核染色作为参照。
图8为本发明实施例中MG、GA和MDHB对神经干细胞分化的统计图，其中，A为 MG、GA和MDHB诱导的神经干细胞分化神经元的统计图；B为MG、GA和MDHB诱导 的神经干细胞分化星形胶质细胞的统计图；C为MG、GA和MDHB分别诱导的细胞总数的 统计图，与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，**P＜0.0001，n＝3。
图9为本发明实施例中使用神经干细胞标记Nestin(A)和细胞增殖相关标记Ki67(B) 对MG、GA和MDHB诱导的神经干细胞增殖的细胞进行免疫染色的细胞图像，同时，以DAPI进行细胞核染色作为参照。
图10为本发明实施例中MG、GA和MDHB诱导的神经干细胞增殖的统计图，其中，A 为Nestin阳性百分比统计图；B为Ki67阳性百分比统计图；与对照组比较，*P＜0.05，**P ＜0.01，***P＜0.001，***P＜0.0001，n＝3。
图11为本发明实施例中MG、GA和MDHB处理后的细胞中的蛋白质电泳图。
图12为本发明实施例中MG、GA和MDHB处理后的神经干细胞中，以GAPDH为内参 的PH3相对表达量统计图，其中，与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。
图13为本发明实施例中对GA诱导的神经干细胞增殖的转录组学分析结果，其中，A为 所有差异表达基因的统计结果；B为钙信号途径中所有差异基因的测序分析结果。
图14为本发明实施例中对GA诱导的神经干细胞增殖KEGG途径关联性前20名的富集 通路。
图15为本发明实施例中western blot验证经GA处理的细胞中存在Akt蛋白的电泳图。
图16为本发明实施例中western blot验证经GA处理的细胞中存在ERK1/2蛋白的电泳图。
图17为本发明实施例中以GAPDH为内参的Akt蛋白定量对比图，其中，与DMSO对 照组相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。
图18为本发明实施例中以GAPDH为内参的ERK1/2蛋白定量对比图，其中，与DMSO对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝3。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了 解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
试验材料
下述实施例中所使用的试验大鼠均为SPF级Sprague-Dawley(SD)新生大鼠，购自广东 省医学实验动物中心。
原代神经干细胞的培养
具体步骤如下：
(1)取9只出生时间小于24h的新生SD大鼠，麻醉后对其头部进行消毒。剪下新生SD大鼠头颅，剪开头部皮肤及骨骼，取出全脑，放入预冷的D-Hank’s缓冲液(购自Genview)中。
(2)于体视镜下分离海马区，剥除海马区表面脑膜及血管膜，将其转移至3mL西林瓶 中，加入3mL D-Hank’s缓冲液，并加入等体积0.25％(v/v)Trypsin(溶于EDTA中)，轻轻吹打混匀，放入细胞培养箱，37℃、5％CO2条件下消化8min。
(3)加入含10％FBS和1％双抗(青霉素/链霉素，P/S)的DMEM/F12培养基终止消化，用巴氏管轻轻吹打混匀，于70μm滤网中过滤，转移滤液至15mL离心管中，1500r/min离 心5min。
(4)弃去上清，加入1mL神经干细胞完全培养基(由2mL B27(无维生素A)、1mL 2μg/mL的EGF溶液、1mL1μg/mL的bFGF溶液、1mL双抗混合后，加入DMEM/F12培养 基定容至100mL得到)吹打混匀，使之成单细胞悬液。
(5)取10μL步骤(4)制备得到的单细胞悬液，用神经干细胞完全培养基稀释，接种于6孔板中(1×105cells/孔)，于细胞培养箱中培养5天，备用。
为了确保试验的准确性，对培养得到神经干细胞进行鉴定，具体步骤如下：
取24孔板细胞爬片，清洗灭菌后每孔加入200μL 0.0125g/mL的D-多聚赖氨酸(PDL) 铺板过夜。除去PDL，每孔加入预冷的1×PBS清洗3次(每次2min)。取上述实施例培养完 成的神经干细胞，分为两组，一组以20个/mL的密度接种于细胞爬片中，另一组使用干细胞 消化酶消化15～20min后，用含有1mL 1％的FBS和1％的P/SDMEM/F12培养基重悬，以1×105 cells/mL的密度接种于细胞爬片中。两组均在培养箱中培养2h。培养结束后，弃去培养基， 用预冷的1×PBS洗去残留培养基(清洗3次，每次约5min)。然后每孔加入250μL预冷的4％多聚甲醛，固定细胞15min，弃去4％多聚甲醛，用预冷的1×PBS洗去残留多聚甲醛(清洗3次，每次约5min)。然后在每孔中加入150μL预冷的SuperBlock(PBS)封闭液，封闭1h， 弃去封闭液，每孔加入100μL用SuperBlock(PBS)封闭液配制的神经干细胞特异性标志物Nestin抗体(小鼠单抗，一抗，巢蛋白nestin是中间纤维的一种，是神经干细胞、胰腺干细胞的标志物)，于4℃环境下慢摇孵育过夜。除去一抗，用预冷的0.3％磷酸盐吐温缓冲液(PBST) 洗涤细胞3次，每次约5min。然后每孔加入100μL二抗(Cy3-山羊抗鼠IgG)和4',6-二脒 基-2-苯基吲哚(DAPI)，室温下避光孵育2h。除去二抗，用预冷的0.3％PBST洗涤细胞3次，每次约5min。封片剂封片，在荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察、拍照。
结果如图1和图2所示。
可以发现，新生SD大鼠海马神经干细胞采用上述实施例中的体外悬浮培养方式进行培 养能够获得可用于实验的神经干细胞。在神经干细胞原代培养到第2天时，细胞开始聚集形 成较小的悬浮神经干细胞克隆球，继续培养到第3～4天时，球体逐渐变大。原代培养进行到 第5天时，收集得到的神经球用神经干细胞特异性标志物Nestin抗体和DAPI进行染色后， 经过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察以及统计学分析，发现原代神经干细胞的纯度达 到80％以上，可以进行后续实验。
没食子酸(GA)或其衍生物对神经干细胞的诱导分化和增殖作用
1.没食子酸或其衍生物对神经干细胞活性的影响：
为了测定没食子酸或其衍生物是否具有细胞毒性，发明人采用CCK8法测定GA或其衍 生物对神经干细胞活性的影响。
具体步骤如下：
取上述实施例中制备得到的SD大鼠第一代神经干细胞，加入干细胞消化酶(购自Stem cell公司)消化15～20min。然后用200μL枪头轻轻吹打50～70次。1500r/min离心5min。 弃去上清，向沉淀中加入含有1mL1％(v/v)的FBS、1％(v/v)双抗(青霉素/链霉素，P/S) 的DMEM/F12培养基，轻轻吹打50～70次，用血球计数板计数，调整细胞浓度至1.5×104cells/mL。然后加细胞液接种于96孔板(预先使用0.0125g/mL PDL铺板过夜)上，孵育2h 待细胞贴壁后，除去培养基，更换为Neural-basal培养基(购自Gibco公司)。将不同浓度(0、1、5、10、20、40μM)的GA或其衍生物(衍生物包括原儿茶酸(protocatechuic acid，PCA)、 香草酸(vanillic acid，VA)、2,3-二羟基苯甲酸甲酯(methyl 2,3-dihydroxybenzoate)、2,5-二 羟基苯甲酸甲酯(methyl 2,5-dihydroxybenzoate)、3,5-二羟基苯甲酸甲酯(methyl3,5-dihydroxybenzoate)、香草酸甲酯(methyl vanillate，MV)和没食子酸甲酯(methylgallate， MG))分别加入到培养基中，以观察其对神经干细胞的影响。阳性对照组为3,4-二羟基苯甲 酸甲酯(methyl 3,4-dihydroxybenzoate，MDHB)。分别于给药后1、2、3、4h用酶标仪测定 波长450nm下的吸光度值。培养6h后用CCK8试剂盒测定细胞活性，在450nm波长下检测吸光度。
其中，为了比较GA或其衍生物之间的差异性，发明人还进一步分析了与GA存在一定 差异的其他化合物的特性，其中，各化合物的油水分配系数(log P)如表1所示。
表1 GA或其衍生物以及其他存在结构差异的化合物的log P
化合物 log P
儿茶酚(catechol) 1.098
3,4-二羟基苯甲酸(3,4-dibydroxyberzoic acid) 0.796
香草酸 1.099
没食子酸 0.502
2,3-二羟基苯甲酸甲酯 0.884
2,5-二羟基苯甲酸甲酯 0.884
3,5-二羟基苯甲酸甲酯 0.884
香草酸甲酯 1.187
没食子酸甲酯 0.590
MDHB 0.884
吸光值检测结果如图3所示。
在图3中，cpd 1表示原儿茶酸(PCA)，cpd 2表示香草酸(VA)，cpd 3表示没食子酸(GA)， cpd 4表示2,3-二羟基苯甲酸甲酯，cpd 5表示2,5-二羟基苯甲酸甲酯，cpd 6表示3,5-二羟基 苯甲酸甲酯，cpd 7表示香草酸甲酯(MV)，cpd 8表示没食子酸甲酯(MG)，cpd 9为阳性对 照MDHB。结果显示，cpd 3、7和8可以增加神经干细胞活性，并且可能有促进细胞增殖作 用。cpd 9在低浓度时(1、5μM)时可提高神经干细胞活性，但在中高浓度(10、20、40μM)时细胞毒性较大。cpd 1、2、5和6对神经干细胞活性影响较小。cpd 4对神经干细胞毒性最大。因此，根据实验结果，选择神经干细胞毒性危害相对最小的前5位化合物进行后续实验，即cpd 1(PCA)、cpd 3(GA)、cpd 7(MV)、cpd 8(MG)和cpd 9(MDHB)。
2.没食子酸或其衍生物对神经干细胞的增殖作用：
采用细胞免疫荧光法鉴定没食子酸或其衍生物对神经干细胞的增殖作用。
具体步骤如下：
取上述实施例中培养5d的神经球，消化后按5～6×105个/孔的密度接种于预铺有PDL爬 片的24孔板中。种板2h待细胞贴壁后，将培养基更换为含有不同浓度cpd 1(PCA)、cpd 3 (GA)、cpd 7(MV)、cpd 8(MG)和cpd 9(MDHB)的Neural-basal培养基，放入细胞培 养箱培养。分别在给药后24、48、72h和5d后从细胞培养箱中取出培养板，在白光显微镜 下初步观察细胞形态。观察结束后，弃去培养基，用预冷的1×PBS洗去残留培养基(清洗3 次，每次约5min)。然后每孔加入250μL预冷的4％多聚甲醛，固定细胞15min，弃去4％ 多聚甲醛，用预冷的1×PBS洗去残留多聚甲醛(清洗3次，每次约5min)。然后在每孔中加 入150μL预冷的SuperBlock(PBS)封闭液，封闭1h，弃去封闭液，每孔加入100μL用 SuperBlock(PBS)封闭液配制的神经干细胞特异性标志物Nestin抗体(小鼠单抗，一抗)，于 4℃环境下慢摇孵育过夜。除去一抗，用预冷的0.3％PBST洗涤细胞3次，每次约5min。然 后每孔加入100μL二抗(Cy3-山羊抗鼠IgG)和DAPI，室温下避光孵育2h。除去二抗，用 预冷的0.3％PBST洗涤细胞3次，每次约5min。封片剂封片，在荧光显微镜和激光共聚焦 显微镜下观察、拍照。
结果如图4所示。
使用消化后贴壁培养2h的神经干细胞在含不同浓度的5种化合物的培养基中培养5天 后，通过白光显微镜初步观察，能够发现不同浓度、不同药物组的细胞形态存在明显区别。 通过ImageJ软件，统计每组细胞中具有神经元形态的细胞个数在总细胞个数中的百分比占比 情况(图4)，可以发现，Cpd 1、3、8和9处理组浓度越大，具神经元形态细胞百分比越高，cpd 7处理组细胞在10μM浓度时具神经元形态细胞百分比最高，在其他浓度时效果显著下降， 对剂量要求相对严苛，因此，不能作为有效的候选药物。在20μM浓度下，cpd 1、3和8处 理组具神经元形态细胞百分比显著高于溶剂对照组，在40μM浓度下，cpd 1、3、8和9处理组具神经元形态细胞百分比显著高于溶剂对照组，因此，可确定cpd 1、3、8和9的最佳给 药浓度范围为20～40μM。
选取神经元形态细胞百分比最高的前3种化合物(即MG(cpd 8)、GA(cpd 3)和MDHB(cpd 9))用于后续测试。以DMSO作为阴性对照，分别使用25、30μM浓度下的cpd 3、8 和9培养贴壁的神经干细胞至第5天，在白光显微镜下观察。
结果如图5和图6所示。
可以发现，在25μM浓度下，各给药组相对于溶剂对照组(DMSO)细胞胞体立体感存在明显的突起，突起的立体感也较强。MG组细胞数量相对较少，突起较粗。GA组细胞呈现 多种不同的形态，或突起较粗，或突起较为细长，或突起细短，胞体立体感十分明显(这类 细胞数量占整体较多)，但也存在没有突起的情况。MDHB组细胞相较另两个给药组更接近 神经元形态，胞体立体感强，有明显的轴突和树突，但这类细胞数量少于GA组，多于MG。 在30μM浓度下，各给药组相对于溶剂对照组细胞数量减少，可见死细胞，细胞碎片增多， MG组只有少数有明显突起的细胞，GA组各种形态的细胞均明显减少，但仍有少数胞体立体 感强、突起细短的细胞，MDHB阳性组细胞数量相对另两个给药组多，胞体立体感减弱，突 起变短，但仍可见明显的轴突和树突。通过ImageJ软件，统计每组细胞中具有神经元形态的 细胞个数占总细胞个数的百分比(图6)，可以发现，在25μM浓度下，各给药组神经元形态 的细胞比例均显著高于溶剂对照组。而在在30μM浓度下，GA和MDHB组神经元形态细胞 比例均显著高于溶剂对照组，因此，可确定25μM浓度为该3个给药组的相对最佳给药浓度。
在确定最佳给药浓度后，对3个给药组(MG(cpd 8)、GA(cpd 3)和MDHB(cpd 9)) 处理后的细胞进行Tuj1和GFAP检测。
2.1未成熟神经元标志物Tuj1和星形胶质细胞标志物GFAP检测：
发明人将25μM剂量的MG、GA和MDHB分别作用于神经干细胞5d后，通过细胞免 疫荧光技术(参考上述实施例)，使用未成熟神经元标志物Tuj1(Tuj1即βIII微管蛋白，是 一种被认为参与了神经元类型特异化的微管蛋白，出现在神经元发育早期)和星形胶质细胞 标志物GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在， 是公认的星形胶质细胞的特异性标志物)对细胞进行鉴定。
结果如图7和8所示。
在激光共聚焦显微镜下观察，可见溶剂对照组(DMSO)细胞GFAP表达较多，MG、 GA和MDHB组细胞表达Tuj1较多(图7)。通过ImageJ软件，分别统计每组细胞中表达Tuj1 和GFAP细胞个数占总细胞个数的百分比(P＜0.0001)，以及各组总细胞数目(P＜0.0001)， 可知MG、GA和MDHB促进神经干细胞分化成为神经元，溶剂对照组神经干细胞主要分化 成为星形胶质细胞，各处理组中神经元和星形胶质细胞的比例相当，但GA组细胞总数显著 多于其他化合物处理组(图8)，提示GA对于其衍生物以及现有技术中的阳性药物而言，更 具诱导神经干细胞增殖的作用。
2.2 Nestin和Ki67检测：
发明人将25μM剂量的MG、GA和MDHB分别作用于神经干细胞5d后，通过细胞免 疫荧光技术(参考上述实施例)，使用Nestin和Ki67对细胞进行鉴定。
结果如图9和10所示。
如图9和图10所示，在激光共聚焦显微镜下观察，可见在24h、48h、72h和5d四个时间点下，GA组表达Ki67和nestin的细胞个数较多，MG和MDHB组表达Ki67和nestin的 细胞个数较少。因此，可以说明，GA对于其衍生物以及现有技术中的阳性药物而言，更具 诱导神经干细胞增殖的作用。
2.3 PH3蛋白检测：
细胞周期标记蛋白PH3存在于细胞G2晚期和M期，被广泛用于标记海马中增殖和分裂 的细胞。发明人为了进一步明确在给药时间延长后，GA或其衍生物是否具有诱导神经干细 胞增殖的作用，以DMSO、MG、GA和MDHB分别处理神经干细胞5d，然后检测神经干细 胞有丝分裂标记蛋白PH3的表达量(P<0.01)。
结果如图11和12所示。
结果显示，使用MG、GA和MDHB处理的神经干细胞，与溶剂对照组相比，GA组PH3 蛋白表达量上调，MG和MDHB组PH3表达量基本不变。因此，可以进一步说明GA对于其 衍生物以及现有技术中的阳性药物而言，更具诱导神经干细胞增殖的作用。
3.没食子酸或其衍生物对神经干细胞的增殖作用机理探究：
为了能够明晰没食子酸或其衍生物对神经干细胞的增殖作用，发明人进一步深度剖析 MG(cpd 8)和GA(cpd 3)对于神经干细胞的增殖机理。
具体试验方法如下：
3.1细胞总RNA的获得：
取上述实施例中培养5d的神经球，消化后按5～6×104cells/孔的密度接种于预铺有PDL 爬片的6孔板中。种板2h待细胞贴壁后，将培养基更换为含有不同浓度cpd 3(GA)和cpd 8(MG)的Neural-basal培养基，放入细胞培养箱培养，同时，以cpd 9(MDHB)作为阳性对照。分别在给药后24、48、72h和5d后从细胞培养箱中取出培养板。弃去培养基，用预 冷的1×PBS洗去残留培养基(约5min)。然后每3孔加入1mL 4℃预冷的Trizol，冰上静置 5min。用移液枪小心吹打混匀每一孔，并转移至EP管内，即得细胞总RNA，进行转录组测 序。
结果如图13和14所示。
基于上述实施例中发现，GA可以诱导神经干细胞分化为未成熟神经元并持续诱导增殖 的现象，本实施例则主要通过收集GA给药处理后的神经干细胞mRNA进行转录组测序分析， 发现共有849个基因表达显著上调，79个基因表达显著下调，通过分析，发明人认为GA可 能主要作用于钙信号通路中的位于神经干细胞膜上的血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)受体进而发挥促增殖作用。
3.2细胞蛋白的提取：
取上述实施例中培养5d的神经球，消化后按5～6×104cells/孔的密度接种于预铺有PDL 爬片的2孔板中。种板2h待细胞贴壁后，将培养基更换为含有不同浓度cpd 3(GA)和cpd 8(MG)的Neural-basal培养基，放入细胞培养箱培养，同时，以cpd 9(MDHB)作为阳性对照。分别在给药后24、48、72h和5d后从细胞培养箱中取出培养板。弃去培养基，用预 冷的1×PBS洗去残留培养基(3次，每次约5min)。然后向每孔中加入100μL蛋白裂解液(1％ 苯甲基磺酰氟(PMSF)+2％碘化丙啶(PI)+RIPA)，冰上孵育10min，用细胞刮棒刮下裂解 的蛋白，收集至1.5ml EP管中，置于冰上继续孵育20min，每隔5min涡旋混匀一次。在4℃、12000rpm/min条件下离心30min。抽取上清至新的1.5ml EP管中，即得细胞蛋白，-20℃保存备用。
为了进一步确定提取获得的细胞蛋白浓度，采用BCA法对其进行蛋白浓度测定，具体步 骤为：将蛋白标准品溶液用生理盐水按浓度梯度稀释。然后按A液(1％BCA二钠盐、2％无 水碳酸钠、0.16％酒石酸钠、0.4％氢氧化钠和0.95％碳酸氢钠混合，调pH值至11.25)：B液 (4％硫酸铜)＝50:1的比例配制所需体积的工作液，充分混匀。在96孔板中加入稀释的梯 度蛋白标准品溶液和待测蛋白样品，每孔10μL，每个样品3个复孔。然后向每孔加入200μL 工作液，37℃孵育30min后，酶标仪562nm波长下测量每孔的吸光度(OD值)。以蛋白标 准品溶液的OD值及其对应蛋白浓度绘制标准曲线，计算待测样品的蛋白浓度。取浓度测定 完毕的蛋白样品，用裂解液调整至每组样品浓度一致，加入1/4体积的5×loading buffer，混匀后，将样品混合液置于100℃金属浴中加热5min，冷却后-20℃保存备用。
对浓度校正完毕的细胞蛋白样品进行酶联免疫印迹试验(Western blot)。
结果如图15～18所示。
PDGF受体下游有多条信号转导通路，经上述实施例中的测序结果和理论进行分析，GA 可能通过下游PI3K/Akt和MAPK/ERK通路途径进行信号转导(图15和16)。因此，发明人 构建了本实施例进行验证。通过本实施例可以发现，与溶剂对照组相比，GA作用于神经干 细胞后，GA组细胞Akt蛋白磷酸化水平不变，总Akt蛋白表达量不变(图17)，而ERK1/2 蛋白磷酸化水平上调，总ERK1/2蛋白表达量不变(图18)，因此，可以说明GA是通过激活 MAPK/ERK通路中的关键节点ERK1/2蛋白磷酸化来引起促增殖效应。
综上所述，神经元受损后大量死亡是AD和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)等神经 退行性疾病的主要表现。神经元的缺失使得神经网络正常运作被打破，如果可以刺激神经元 再生重新修复神经网络，或许可以改善下降的运动和记忆功能。而上述实施例中已经充分说 明没食子酸或其衍生物可以诱导大脑中原有的NSC转分化为新生神经元，既能改善神经退行 性疾病症状，也避免了干细胞移植法带来的致瘤性和排异反应，是一种很有临床应用前景的 治疗方法，本发明实施例中的发现将极大程度的推动了神经退行性疾病治疗药物的开发与利 用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.没食子酸或其衍生物在制备神经干细胞诱导分化试剂中的应用。
2.没食子酸或其衍生物在制备神经干细胞诱导增殖试剂中的应用。
3.没食子酸或其衍生物在制备神经退行性疾病治疗药物中的应用。
4.没食子酸或其衍生物在制备ERK1/2蛋白磷酸化激活试剂中的应用。
5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述没食子酸或其衍生物包括：没食子酸及其酯化物、醚化物、烷基取代物、药用盐、酰胺化物中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述没食子酸或其衍生物为没食子酸和没食子酸甲酯中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述没食子酸或其衍生物的给药剂量为20～40μM。
8.一种神经退行性疾病治疗药物，其特征在于，所述治疗药物中含有没食子酸或其衍生物；其中，所述没食子酸或其衍生物优选为没食子酸和没食子酸甲酯中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的治疗药物，其特征在于，所述神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症中的至少一种；
其中，所述神经退行性疾病优选为阿尔茨海默病。
10.根据权利要求8所述的治疗药物，其特征在于，所述治疗药物的剂型包括注射剂、溶液剂、片剂、丸剂和散剂中的至少一种。
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