CN102539371B - 一种基于溶剂萃取耦合ftir快速分析磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法：(1)将含200～5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S_5；(2)另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S_4；(3)对S_4和S_5进行差谱分析，根据磷脂标准曲线获得油脂A中磷脂的浓度；本发明方法操作简单，可连续操作，测定准确性好，精度高，灵敏，环境友好，操作安全，适于各种食用油的微量磷脂分析。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种磷脂的测量方法，特别涉及一种基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法。
(二)背景技术
磷脂，作为膳食成分之一，对人体有许多生理功能，如调节脂肪代谢，转运必需脂肪酸，预防动脉硬化、高血压、血栓、及溃疡等疾病。磷脂主要来源于植物油脂，如大豆毛油中磷脂含量约为0.5-2％。但从加工工艺上来讲，植物油中磷脂的存在是不利的，会增加脱酸环节中性油的损失及脱色白土的用量，而且还容易引起加氢催化剂的中毒。精炼油中磷脂过高容易氧化影响产品色泽，此外其烟点低，烹调时易分解发烟。色拉油中磷脂含量应低于200ppm，一般在12.5-150ppm之间。
磷脂分析的方法较多。AOAC官方方法999.14对于膳食中磷脂的测定是基于样品碱法消化后，酶水解释放胆碱，然后比色测定胆碱的原理。该法的缺点是并非所有磷脂单体都含胆碱基团。总磷脂的测定是首先采用湿法酸消化，然后对磷元素采用Barlett arseno-molybdate法。问题是非磷脂磷会带来较大的误差。此外上述方法均准确度不高，而且操作繁琐、费时。采用色谱法(如HPLC)可对磷脂单体进行准确定量，但成本昂贵，检测限亦不高，而且复杂的样品富集前处理同样不可或缺。
Nzai等尝试了FT IR技术分析大豆油中的磷脂含量，发现相对于传统的湿法磷分析技术及TLC耦合密度扫描技术具有快速、简单、稳定的优点，但其背景如何扣除不清楚，方法的准确性和精确性均不高。Szydtowska-Czerniak在Nzai研究基础上引入偏最小平方和回归(partialleast squares regression)模型定量对菜油中磷脂定量，准确度有所改善，但依然存在诸多问题如干扰物甘油三酯的浓度过高超出比尔定律范围、分离度不高，分析准确度低。为克服上述问题，Kuligowski等采用在线凝胶过滤色谱分离/ATR-FTIR色谱检测技术同时检测膳食成分中磷脂和大豆油含量，并采用一阶导数图谱增加峰拆分，取得了较好的效果。但由于衰减全反射色谱分辨率不高，该方法对磷脂的检测限仅为2mg/mL(2000ppm)。
此外，也有许多研究人员探讨采用FT-NIR技术分析人脑磷脂质组成、监测大豆油精炼过程中副产物和磷脂等。然而，要建立精确的定量模型，往往需要较大的样本容量，成本较高，而且也不适用于低磷脂含量的样品(＜1000ppm)。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，该方法适合较低浓度磷脂含量(200ppm-5000ppm)样品的快速、自动化分析方法。
由于磷脂红外分析时最大误差来源于结构类似物甘油三酯的干扰，本发明采用溶剂萃取样品中的磷脂，其大部分中性甘油三酯等干扰物留在萃余相中，然后采用FTIR透射光谱分析萃取样品中磷脂含量。
本发明采用的技术方案是：
一种基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，所述方法为：(1)将含200～5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S_5；所述有机溶剂A为乙腈、DMSO、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合；(2)另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S_4；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；(3)对S_4和S_5进行差谱分析，得到差谱S_6的二阶导数图谱S_7，读取二阶导数图谱S_7在4000～400cm-1范围各特征峰的吸收强度，根据磷脂标准曲线获得油脂A中磷脂的浓度。
所述有机溶剂A、有机溶剂B为相同有机溶剂，均为乙腈和甲醇以体积比1∶0.25～9的混合液。
所述有机溶剂A、有机溶剂B均为乙腈与甲醇以体积比的1∶1.5混合液。
步骤(1)所述油脂A与有机溶剂A体积比为1∶0.5～12。
步骤(2)所述的硅胶柱处理为：200g经105℃活化2h的硅胶G(200～300目，青岛海洋化工有限公司)填充于3mm×400mm玻璃层析柱中，加入50～100g油脂B，真空吸附，收集流出液，得到的油脂B的脱胶油。
步骤(3)所述二阶导数图谱S_7在特征峰1739cm-1，1241cm-1，1172cm-1，1090cm-1，1020cm-1，968cm-1进行差谱分析，优选1241cm-1。
进一步，所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，所述方法按以下步骤进行：(1)将含200～5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1，波谱范围4000～400cm-1条件下记录波谱，记为S_5；所述有机溶剂A为乙腈与甲醇以体积比的1∶1.5混合液；(2)另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱脱磷脂处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1，波谱范围4000～400cm-1条件下记录波谱，记为S_4；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；(3)对S_4、S_5在特征峰1241cm-1处进行差谱分析，即S_5-S_4得到差谱S_6，对差谱S_6进行二阶求导并放大-10000倍，得到差谱的二阶导数图谱S_7，读取二阶导数图谱S_7在特征峰1241cm-1处的吸收强度；以含20～5000ppm的磷脂有机溶剂C溶液作为标准品，以有机溶剂C为参照，在上述相同条件下测试波谱，并绘制标准曲线，根据标准曲线获得磷脂浓度；所述有机溶剂C与有机溶剂A相同。
所述标准曲线的绘制方法为：①将有机溶剂C采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1、波谱范围4000～400cm-1条件下记录有机溶剂C的原始波谱，记为S_0；②分别取磷脂添加至有机溶剂C中，制得浓度范围在20～5000ppm的磷脂标准溶液，采用25μm CaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1、波谱范围4000～400cm-1条件下记录不同磷脂浓度标准溶液的波谱，分别记为波谱S_std_1～S_std_n，n为大于1的自然整数；③对波谱S_0和系列波谱S_std_1～S_std_n在特征峰处进行差谱分析，得到不同磷脂浓度下标准溶液的系列差谱D_1～D_n，n为大于1的自然整数，对系列差谱D_1～D_9进行二阶求导并放大-10000倍，得到系列差谱D_1～D_9的系列二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_n，n为大于1的自然整数，读取系列二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_n中不同磷脂浓度标准溶液的各特征峰的吸收强度，以最大吸收峰强度为横坐标、标准磷脂含量为纵坐标，绘制标准曲线。
所述磷脂特征峰为1739cm-1，1241cm-1，1172cm-1，1090cm-1，1020cm-1，968cm-1，优选1241cm-1。
本发明所述脱胶油为脱除磷脂后的油脂。
由于磷脂红外分析时最大误差来源于结构类似物甘油三酯的干扰，本发明采用溶剂萃取样品中的磷脂，其大部分中性甘油三酯等干扰物留在萃余相中，然后采用FTIR透射光谱分析萃取样品中磷脂含量。
本发明所述有机溶剂A、有机溶剂B、有机溶剂C均为有机溶剂，为便于区分不同步骤所取原料及获得结果的不同而命名。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明方法操作简单，可连续操作，测定准确性好，精度高，灵敏，环境友好，操作安全，适于各种食用油的微量磷脂分析。
(四)附图说明
图1为溶剂萃取耦合FTIR分析大豆油中磷脂的红外图谱(实施例2)，其中1为乙腈溶剂原始图谱，2为甲醇溶剂原始图谱，3为体积比1∶1的乙腈甲醇混合液的原始图谱，4为大豆油脱胶油的乙腈甲醇萃取液图谱；5为大豆油样品(PC浓度530ppm)的乙腈甲醇萃取液图谱；6是差谱S_6普通；7是差谱S_6的二阶导数图谱S_7。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1.标准曲线的准备
(1)分别取Sigma光谱级乙腈、甲醇，以体积比1∶1制备乙腈甲醇混合液作为溶剂，采用25μm CaF2样品池，扫描次数32，分辨率0.5cm-1，波谱范围4000～400cm-1记录原始波谱S_0；(2)分别取步骤(1)所述溶剂适量，添加磷脂酰胆碱(PC)标品(Sigma公司，美国)配制得到20，50，100，200，500，1000，1500，2000，5000ppm的磷脂标准溶液，利用红外波谱分析仪(Tensor27，美国布鲁克光谱仪器公司)，采用25μm CaF2样品池，扫描次数32，分辨率0.5cm-1，波谱范围4000～400cm-1记录系列标准样溶液的波谱，分别记为S_std_1、S_std_2、S_std_3、S_std_4、S_std_5、S_std_6、S_std_7、S_std_8、S_std_9，然后分别做波谱减法运算即S_std-S_0得到系列差谱D_1～D_9，接着对系列差谱D_1～D_9进行二阶求导(5，5差分法)，并放大-10000倍，得到系列差谱D_1～D_9的二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_9，根据谱图，分别测量系列二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_9在968，1090，1172，1241，1739cm-1处的吸收强度(不同吸收峰的基团归属见表1)，以系列二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_9在968，1090，1172，1241，1739cm-1处的吸收强度为横坐标、磷脂(PL)含量为纵坐标，得到相关标准曲线如表1：
表1基于不同吸收波段定量的标准曲线
表1数据表明，基于上述5个波段定量的标准曲线线性关系均非常好，R2在0.9994-1.0之间。尤其基于羰基吸收(γC＝O)的标准曲线线性关系最好，标准差最小为103，其次为1241cm-1波段，其相应标准差为163.6，其他三个基团的标准曲线标准差均大于300.考虑到油脂中磷脂的干扰物甘油三酯含有更多的C＝O，而P-O-C为磷脂特有的吸收峰，因此选择1241cm-1波段定量。
实施例2溶剂萃取耦合FTIR分析食用油样品中磷脂含量的方法
(1)油脂的脱磷脂处理
取200g经105℃活化2h的硅胶G(200-300目，青岛海洋化工有限公司)填充于3mm×400mm玻璃层析柱中，制备硅胶层析柱；分别取50-100g精炼大豆油(金龙鱼)和卡诺拉油(金龙鱼)，分别加入上述硅胶层析柱中，真空吸附，收集流出液，分别得到精炼大豆油脱胶油和卡诺拉油脱胶油。
(2)溶剂萃取耦合FTIR分析食用油样品中磷脂含量的方法
(a)准确移取10mL(9.20g)精炼大豆油样品，置于30mL具塞玻璃管中，添加20mL乙腈/甲醇1∶1(体积比)混合液(15.80g)，密封，剧烈混合萃取1min，静置30～60min或4000rpm离心10min，取上相(溶剂层)0.2ml，利用红外光谱分析仪(Tensor27，美国布鲁克光谱仪器公司)进行分析，采用25μm CaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1，4000～400cm-1条件下记录红外光谱，记为S_5；(b)准确称取步骤(1)所述的硅胶柱处理得到精炼大豆油脱胶油，将脱胶油用与步骤(a)相同量及方法的乙腈/甲醇液混合液萃取，取上相(溶剂层)0.2ml，相同条件下测量上相的光谱，记为S_4；(c)对上述S_4与S_5作减法，即S_5-S_4，得到差谱S_6，然后对差谱S_6进行二阶求导(5，5差分法)，并放大-10000倍，得到差谱S_6的二阶导数图谱S_7，测量二阶导数图谱S_7在1241cm-1最大吸收峰的吸收强度，带入实施例1获得的标准曲线得出萃取后溶剂中磷脂含量，再结合稀释倍数即可换算出原始样品中的磷脂含量(此处有机溶剂与油脂体积比为2∶1，而换算时以质量计较为准确，因此萃取物水分含量需乘以萃取用乙腈的质量再除以样品油脂的质量：样品磷脂的浓度＝根据标准曲线获得的磷脂浓度×萃取溶剂的质量/样品的质量)，卡诺拉油中磷脂含量的测量方法与精炼大豆油相同，分别得出上述精炼大豆油和卡诺拉油中磷脂含量分别为532ppm和468ppm。
实施例3不同有机溶剂萃取分析大豆油磷脂含量的比较
适宜的有机溶剂，首先应对磷脂有充分的溶解能力，以保障磷脂的完全萃取，同时对甘油三酯等干扰物溶解度尽量低，以减少波谱干扰。据此，在有机溶剂/油脂体积比为3∶1条件下，分别比较了光谱纯的极性溶剂DMSO、甲醇、乙醇、乙腈的萃取效果，其他操作同实施例1，结果见表2。
准确移取10mL实施例2所述精炼大豆油脱胶油作为样品，置于30mL具塞玻璃管中，添加20mL不同的有机溶剂(见表2)，密封，剧烈混合萃取1min，4000rpm离心10min，取上相(溶剂层)0.2ml，添加不同含量的磷脂(见表2)，利用红外光谱分析仪(Tensor27，美国布鲁克光谱仪器公司)进行分析，采用25μm CaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1，4000～400cm-1条件下记录红外光谱，分别记为S_5；(b)准确称取所述的硅胶柱处理得到精炼大豆油脱胶油，将脱胶油用与步骤(a)相同量及方法的有机溶剂萃取，取上相(溶剂层)0.2ml，相同条件下测量上相的光谱，记为S_4；(c)对上述S_4与S_5作减法，即S_5-S_4，得到差谱S_6，然后对差谱S_6进行二阶求导(5，5差分法)，并放大-10000倍，得到差谱S_6的二阶导数图谱S_7，测量二阶导数图谱S_7在1241cm-1最大吸收峰的吸收强度，带入实施例1获得的标准曲线得出萃取后精炼大豆油中磷脂含量，再结合稀释倍数即可换算出原始样品中的磷脂含量，结果见表2。
表2不同溶剂的萃取效果
由表2中的数据不难判断，单一溶剂中甲醇的萃取能力最佳，分析结果与标准值较为接近，其次为DMF，而DMSO和乙腈萃取效果最差的。这是由于甲醇对磷脂的高溶解能力决定的，但由于甲醇对甘油三酯等干扰物质已有一定的溶解能力，因此结果准确度粗稍受影响。试验中乙腈/甲醇的混合溶液做萃取剂，准确度最高。这可能是加入乙腈后改善了萃取的选择性的结果。
实施例4不同萃取比例对分析准确度的影响
以有机溶剂/油脂不同体积比萃取分析磷脂含量为5002ppm的大豆油，有机溶剂为乙腈/甲醇(1∶1，v/v)，其他操作同实施例3，结果见表3。
表3有机溶剂、油脂萃取比例对磷脂分析的影响
注：萃取溶剂为乙腈/甲醇(1∶1，v/v)，混合溶液每个样品分析重复5次，结果以平均值表示.SD为多次测量结果的标准差，RSDa为准确度的相对标准差，RSDr为精密度的相对标准差
在有机溶剂萃取能力充分的前提下，萃取比例通常不会影响分析的准确性。对分析的大豆油(磷脂含量5002ppm)，萃取比例对分析结果影响较大，有机溶剂/大豆油体积比从0.5∶1提高到2∶1，分析的准确性和精确性均明显提高，随萃取比例进一步增加，结果的误差逐渐增大，因此确定有机溶剂与油脂的体积以2∶1为宜。
实施例5乙腈/甲醇比例对分析准确度的影响
溶剂选择时发现，甲醇对磷脂的溶解度高，因此萃取能力强；乙腈的极性较强，对磷脂有一定溶解能力，而对磷脂的主要干扰物甘油三酯不溶或微溶，表现出良好的选择性。因此，二者以适当比例混合对选择性萃取磷脂至关重要。以乙腈/甲醇不同体积比的混合液为有机溶剂用于萃取，萃取溶剂、油脂体积比为2∶1，其他操作同实施例3，结果见表4。
表4萃取溶剂中乙腈/甲醇比例对磷脂分析的影响
RSDa，准确度的相对标准偏差；RSDr，精密度的相对标准偏差。
上表4中得数据表明，不论乙腈、甲醇比例如何，对与高PL含量样品(10079ppm)FTIR法的准确度和精密度基本在可接受的范围内(相对标准差＜5％)。对于低磷脂(PL)含量的样品(246ppm)，混合溶剂中不论甲醇、还是乙腈比例偏大，分析的结果均不佳，最佳比例为乙腈/甲醇4∶6，此时分析准确度和精密度的相对标准偏差分别为4.02％，3.61％，完全在可接受的范围之内。
实施例6FTIR法分析菜籽油磷脂含量的准确性及精确性的研究
以菜籽油(金龙鱼)为原料，经硅胶柱处理后获得脱胶油，添加不同磷脂配制成不同浓度的样品，萃取溶剂为乙腈、甲醇混合溶液(体积比为1∶1.5)，萃取溶剂、菜籽油体积比为2∶1，其他操作同实施例3，磷脂标准值及测定值的比较见表5。
表5FTIR定量分析菜籽油磷脂含量的准确度和精密度
注：每个样品重复分析5次，结果以平均值±标准差表示
显而易见，样品磷脂浓度在528-3005ppm范围内，FTIR方法表现出优良的准确度和精密度，其相对标准偏差基本小于5％。对表5中不同油脂磷脂添加值与FTIR预测值相关，得到如下关系式：预测值(ppm)＝1.04841*添加值，R2＝0.99994，体现了该方法优良的准确性及精密度。
Claims (7)
1.一种基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述方法为：（1）将含200～5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S-5；所述有机溶剂A为乙腈、DMSO、甲醇、乙醇中的一种或一种以上的混合；（2）另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S-4；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；（3）对S-4和S-5进行差谱分析，得到差谱S-6的二阶导数图谱S-7，读取二阶导数图谱S-7在4000～400cm-1范围各特征峰的吸收强度，根据磷脂标准曲线获得油脂A中磷脂的浓度；所述标准曲线的绘制方法为：①将有机溶剂C采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1、波谱范围4000～400cm-1条件下记录有机溶剂C的原始波谱，记为S-0；②分别取磷脂添加至有机溶剂C中，制得浓度范围在20～5000ppm的磷脂标准溶液，采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1、波谱范围4000～400cm-1条件下记录不同磷脂浓度标准溶液的波谱，分别记为波谱S-std-1～S-std-n，n为大于1的自然整数；③对波谱S-0和系列波谱S-std-1～S-std-n在特征峰处进行差谱分析，得到不同磷脂浓度下标准溶液的系列差谱D_1～D_n，n为大于1的自然整数，对系列差谱D_1～D_n进行二阶求导并放大-10000倍，得到系列差谱D_1～D_n的系列二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_n，n为大于1的自然整数，读取系列二阶导数图谱S_2nd_1～S_2nd_n中不同磷脂浓度标准溶液的各特征峰的吸收强度，以最大吸收峰强度为横坐标、标准磷脂含量为纵坐标，绘制标准曲线；所述有机溶剂C与有机溶剂A相同。
2.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述有机溶剂A、有机溶剂B均为乙腈和甲醇以体积比1:0.25～9的混合液。
3.如权利要求2所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述有机溶剂A、有机溶剂B均为乙腈与甲醇以体积比1:1.5的混合液。
4.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于步骤（1）所述油脂A与有机溶剂A体积比为1:0.5～12。
5.权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于步骤（2）所述的硅胶柱处理为：将油脂B置于硅胶层析柱中，真空吸附，收集流出液，得到油脂B的脱胶油。
6.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于步骤（3）所述差谱分析是在特征峰1241cm-1处进行差谱分析。
7.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行：（1）将含200～5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1，波谱范围4000～400cm-1条件下记录波谱，记为S-5；所述有机溶剂A为乙腈与甲醇以体积比1:1.5的混合液；（2）另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱脱磷脂处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，采用25μmCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0.5cm-1，波谱范围4000～400cm-1条件下记录波谱，记为S-4；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；（3）对S-4、S-5在特征峰1241cm-1处进行差谱分析，即S-5-S-4得到差谱S-6，对差谱S-6进行二阶求导并放大-10000倍，得到差谱S-6的二阶导数图谱S-7，读取二阶导数图谱S-7在特征峰1241cm-1处的吸收强度；以含20～5000ppm的磷脂有机溶剂C溶液作为标准品，以有机溶剂C为参照，在上述相同条件下测试波谱，并绘制标准曲线，根据标准曲线获得油脂A中磷脂浓度；所述有机溶剂C与有机溶剂A相同。
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