实施例
1、基因芯片及其制造方法
本实施例的基因芯片,所述基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针,所述探针为SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列,其中固相载体为载玻片。
所述基因芯片的制备方法,包括如下步骤:
(1)将玻片用双蒸水洗净,在碱液中浸泡过夜,取出后用双蒸水清晰3遍,再于体积分数为1%的HCl中浸泡30分钟,清洗后置于玻片缸中待用。将清洁后的玻片经过4-氨丁基三乙氧基硅烷溶液氨基化处理,再经苯异硫氰酸酯溶液进行异硫氰基化处理,用氮气吹干后,放于4℃避光保存;
(2)芯片Zip探针(SEQ ID NO.1-54所示的核苷酸序列)是随机组合的长度为24bp的寡核苷酸片段,将这些寡核苷酸序列利用NCBI网站上的BLAST功能与目的基因组序列进行同源性比较,选择其中同源性程度最低的一组作为Zip探针序列。位点特异性探针长度不等,需保证其Tm值基本保持一致,以确保后续反应的均一性;
(3)将合成好的Zip探针溶解于点样液中,将探针溶液转移到对应的96孔板内,使用GMS417点样仪,运行相应程序将探针点到活化好的固相载体上,置于37℃,90%湿度的恒温恒湿箱中过夜,使探针与玻片充分交联。固定好的固相载体在氨水中封闭反应的活性基团,可以储存于4℃以备下步杂交实验用。
2、基因芯片的使用方法
使用前述的基因芯片进行6-丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶缺乏症的检测,包括如下步骤:
(1)突变检测位点的选择,需要进行检测的18个突变位点及探针核心序列如表1。
表1
突变形式中的“del”表示缺失突变,如248-250del表示SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列中第248至250位3个碱基缺失;“>”表示置换突变,如234A>6表示SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列中第234位碱基由A突变为G。
即,SEQ ID NO.1-3所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第234个碱基是否发生突变,由A→G;
SEQ ID NO.4-6所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第245个碱基是否发生突变,由G→A;
SEQ ID NO.7-9所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第288个碱基是否发生突变,由T→A;
SEQ ID NO.10-12所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第318个碱基是否发生突变,由T→C;
SEQ ID NO.13-15所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第338个碱基是否发生突变,由C→T;
SEQ ID NO.16-18所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第339个碱基是否发生突变,由C→T;
SEQ ID NO.19-21所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第351个碱基是否发生突变,由A→G;
SEQ ID NO.22-24所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第356个碱基是否发生突变,由C→A;
SEQ ID NO.25-27所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第365个碱基是否发生突变,由G→A;
SEQ ID NO.28-30所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第396个碱基是否发生突变,由C→T;
SEQ ID NO.31-33所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第458个碱基是否发生突变,由C→T;
SEQ ID NO.34-36所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第472个碱基是否发生突变,由A→C;
SEQ ID NO.37-39所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第509个碱基是否发生突变,由G→C;
SEQ ID NO.40-42所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第116个碱基是否发生突变,由C→T;
SEQ ID NO.43-45所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.55所示的核苷酸序列第248至250个碱基是否发生突变,第248至250这三个碱基缺失。
SEQ ID NO.46-48所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列第1769个碱基是否发生突变,由A→G;
SEQ ID NO.49-51所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列第1个碱基是否发生突变,由G→A;
SEQ ID NO.52-54所示的核苷酸对应检测SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列第2477个碱基是否发生突变,由A→G。
(2)样品准备
获取血液样本,准备全血样品,用苯酚-氯仿法(参照《分子克隆实验指南》第三版)抽提全血中的基因组DNA。
(3)样品血液的预处理
分别以各样本的基因组DNA为模板,进行多重PCR。上述18个突变位点分布于6个外显子和3个内含子上,其中内含子3和内含子4上的两个位点因为离外显子较近,可以同外显子一起扩增得到,因此设计6对引物进行扩增。因为外显子1所扩增片段GC含量很高(>75%),其扩增体系中需添加DMSO,因此要单独扩增,引物不变;其余5个片段在一个反应管内进行扩增。
外显子1反应成分(25μl体系):20ng基因组DNA,10mM Tris-HCl,50mM KCl,3.0mM MgCl2,200μM dNTP,0.6μM引物,2.5U Taq DNA聚合酶,0.125μlDMSO;
五重PCR反应成分(25μl体系):20ng基因组DNA,10mM Tris-HCl,50mM KCl,3.0mMMgCl2,200μM dNTP,0.6μM各引物,2.5U Taq DNA聚合酶。外显子1的扩增反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,每次循环下降0.5℃,72℃延伸1min,循环10次,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,循环30次,72℃延伸10min;五重PCR反应条件为:94℃变性30s,60℃退火30s,每次循环下降0.5℃,72℃延伸1min,循环10次,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,循环25次。反应完成后在反应混合液中加入1μl蛋白酶K,70℃反应10min,随后94℃20min灭活蛋白酶K;多重PCR反应的引物如表2所示。
表2
即,SEQ ID NO.59-60所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核苷酸序列第116个碱基的DNA片段;
SEQ ID NO.61-62所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核苷酸序列第234个碱基的DNA片段;
SEQ ID NO.63-64所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核苷酸序列第245个碱基、第248至250个碱基和含有SEQ ID NO.57所示的核苷酸序列第1个碱基的DNA片段;
SEQ ID NO.65-66所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核苷酸序列第288个碱基和第318个碱基的DNA片段;
SEQ ID NO.67-68所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.55所示核苷酸序列第338个碱基、第339个碱基、第351个碱基、第356个碱基、第365个碱基、第396个碱基、第458个碱基、第472个碱基、第509个碱基和含有SEQ ID NO.58所示的核苷酸序列第2479个碱基的DNA片段;
SEQ ID NO.69-70所示的核苷酸对应扩增用于芯片检测的含有SEQ ID NO.56所示的核苷酸序列第1777个碱基的DNA片段。
(4)将前述步骤获得DNA片段与探针进行连接
蛋白酶K消化后的扩增产物,立刻进行LDR反应。在反应液中依次加入10×Taq ligasebuffer 2μl,探针混合液1μl,各探针浓度均为1μM,Taq DNA ligase 0.25μl,补水至总体积20μl;反应条件为94℃变性30s,65℃退火4min,循环40次。
(5)杂交
向20μl LDR反应液中加入15μl双蒸水和35μl 2×杂交液,混匀后于95℃加热变性5min,迅速放于冰上冷却,离心待用。将杂交框粘贴于基因芯片上的点样区域,吸取65μl杂交液添加到杂交框中,封闭好置于65℃杂交箱中杂交1小时。
杂交结束后,去掉杂交框,将芯片分别放于0.3×SSC/0.1%SDS和0.06×SSC中各洗脱1min,离心甩干。
上述溶液配置方法如下所述:预配置20×SSC溶液:在800ml水中溶解175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠,加入数滴10mol/l NaOH溶液调节pH值至7.0,加水定容至1L,分装后高压灭菌。
0.3×SSC:将20×SSC与水按1∶66.7体积比稀释。
0.06×SSC:将20×SSC与水按1∶333.3体积比稀释。
0.1%SDS:1克SDS溶解在1000ml水中。
(6)扫描与分析
杂交后的基因芯片用激光共聚焦微阵列扫描仪进行扫描,得到的图像用软件进行分析。最终获得各个样本点的荧光信号强度值和背景值,扣除背景值影响后得到该点的AMSI值(absolute median signal intensities)。根据同一位点野生型和突变型探针点的绝对强度比值,确定基因型。实验结果表明,检测特异性高,稳定性好,经前期试验该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子,多次试验重复性高;时间短,样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成。
综上所述,本发明的基因芯片操作步骤简单,只需要进行一次多重PCR反应和连接酶反应,杂交扫描即可;检测特异性高,稳定性好,该芯片可正确区分各个位点的纯合子和杂合子,多次试验重复性高;时间短,从样本抽提到得到扫描结果可在一天内完成;采用通用芯片技术,固相载体也可通用于其他芯片,有效降低了成本,适用于临床患者基因突变检测、产前诊断和正常人杂合子携带者检测。