CN102532248A - 制备胡芦巴皂苷b的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备胡芦巴皂苷B的方法，属于中药领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种制备胡芦巴皂苷B的方法。本发明方法为：胡芦巴总皂苷提取物的水溶液，过聚酰胺柱、碱性氧化铝柱、中性氧化铝柱或硅胶柱，用水洗脱柱子，收集合并洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品一。

Description

制备胡芦巴皂苷B的方法

技术领域

本发明涉及制备胡芦巴皂苷B的方法，属于中药领域。

背景技术

胡芦巴为豆科植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的种子，为中国药典2000年版收载品种。中医主要用于治疗肾虚腰酸、阳痿、寒疝偏坠、胃寒痛以及寒湿脚气肿痛乏力等。近年来国内外均有报道用原生药粉治疗糖尿病收到较好疗效。如中国医学论坛报道：每日服25g胡芦巴，共服21天，可明显降低病人的尿糖及血糖含量。且正常人服100g葡萄糖后，再服100g胡芦巴，可有效地防止血糖升高。国外文献报道：将10例非胰岛素依赖型糖尿病患者随机分为两组，治疗组每天在食物中混入25克胡芦巴粉。15天后两组进行交叉互换。在每次研究过程结束时(即第十五天)，进行静脉葡萄糖耐量试验。结果表明：食物中有胡芦巴粉者能提高代谢清除率，从而显著降低血糖水平，并缩短其半衰期，提高红细胞胰岛素受体数。由此可见，胡芦巴在临床上的疗效是肯定的。

专利申请号为03144071.1的“胡芦巴总皂苷提取物生产工艺”，该专利申请公开了“一种从植物胡芦巴中提取的胡芦巴提取物及其生产方法和在制备治疗糖尿病中对血糖和血脂有调节作用药品中的应用”，所获的总皂苷提取物皂苷部份为已知的甲基原薯蓣皂苷、甲基原翠雀皂苷等共五个皂苷的混合物，但是该申请中对于提取物的总皂苷的重量百分比是如何定义的，未作说明。如果没有用对照品，此重量百分比是没有任何意义。因此，制备对照品对于胡芦巴总皂苷提取物的生产工艺控制具有重要意义。胡芦巴皂苷B为总皂苷中的主要成分(含量为8％以上)之一，结构式如(I)所示，如果能够分离纯化得到高纯度的胡芦巴皂苷B，则可以作为胡芦巴总皂苷的对照品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备胡芦巴皂苷B的方法。

本发明制备胡芦巴皂苷B的方法包括如下步骤：

a、胡芦巴总皂苷提取物的水溶液，过聚酰胺柱、碱性氧化铝柱、中性氧化铝柱或硅胶柱，用水洗脱柱子(优选洗脱至洗脱液振摇无泡沫或取1份洗脱液加入0.8～1.2倍体积的高氯酸不显红色为止，一般情况下，取1ml洗脱液加入1ml高氯酸进行判断即可)，收集合并洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品一。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法的a步骤中的胡芦巴总皂苷提取物的水溶液优选过聚酰胺柱或碱性氧化铝柱。

其中，本发明方法的a步骤中，胡芦巴总皂苷提取物的水溶液，优选先过碱性氧化铝柱，所收集合并的洗脱液再过聚酰胺柱，收集流出液，流出液再进行浓缩、干燥操作。这样可以除去更多的酸性杂质，特别是那些能被氧化铝吸附而不被聚酰胺吸附的杂质，如色素、黄酮等。

其中，本发明方法的a步骤中，胡芦巴总皂苷提取物的水溶液中的胡芦巴总皂苷提取物浓度只要能够使其中的胡芦巴皂苷B能够完全被吸附即可，但是，如果浓度过低，则吸附时间过长，影响生产效率；如果浓度过高，需要多吸附几次，同样会影响生产效率，因此，为了提高生产效率，本发明方法的a步骤中所述的胡芦巴总皂苷提取物的水溶液中的胡芦巴总皂苷提取物浓度优选为70～130g/L。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法优选还采用下述b步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品一：

b、a步骤所得洗脱液过D101型大孔树脂柱，然后用水洗涤大孔树脂柱至洗涤液近澄明，再用75～85wt％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱醇液(优选收集洗脱醇液至洗脱醇液挥干后遇高氯酸不显色为止)，合并洗脱醇液，回收溶剂，得浸膏，所得浸膏为胡芦巴皂苷B粗品二。

其中，本发明方法的b步骤，洗脱的乙醇溶液浓度过高或过低都可能导致制备的胡芦巴皂苷B的纯度不高，用75～85wt％的乙醇溶液洗脱较为合适，优选采用80wt％的乙醇溶液洗脱。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法优选还采用下述c步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品二：

c、b步骤所得浸膏加水溶解，用正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，干燥，得到白色粉末，白色粉末即为胡芦巴皂苷B粗品三。

其中，本发明方法的c步骤中，采用正丁醇萃取时，其用量可以采用常规萃取剂的用量即可。如果只萃取一次，则可能不能完全将胡芦巴皂苷B萃取而出，从而影响胡芦巴皂苷B的收率，为了提高胡芦巴皂苷B的收率，本发明方法的c步骤中优选用正丁醇萃取4～6次，然后合并萃取液并回收正丁醇；其中，每次萃取的正丁醇与浸膏的水溶液体积比优选为0.7～1.3∶0.7～1.3。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法优选还采用下述d、e步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品三：

d、c步骤所得白色粉末用甲醇溶解，加入丙酮沉淀至基本无沉淀析出，过滤，所得沉淀干燥，沉淀再用甲醇溶解，然后用硅胶H或硅胶吸附，挥去溶剂后研细；

e、另取硅胶H，用体积比为23～27∶5～7∶0.5～0.9的氯仿-甲醇-水溶液湿法装柱，然后用不同比例的氯仿-甲醇-水溶液梯度洗脱，收集氯仿-甲醇-水体积比为23～27∶10～14∶1.5～2.5的部分，回收溶剂，干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品四。

其中，本发明方法的d步骤中优选用硅胶H吸附，这样可以提高吸附效果。

其中，为了提高胡芦巴皂苷B的纯度及收率，本发明方法e步骤中，装拄所用氯仿-甲醇-水溶液的体积比优选为25∶6∶0.7。

其中，为了提高胡芦巴皂苷B的纯度及收率，本发明方法e步骤中，洗脱所用氯仿-甲醇-水溶液的体积比优选为25∶12∶2。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法e步骤所得胡芦巴皂苷B粗品四还优选采用下述方法精制：胡芦巴皂苷B粗品4加水溶解，过葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20柱，然后用体积比1∶1的氯仿和甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

或胡芦巴皂苷B粗品四加水溶解，过C18反相硅胶柱，然后用体积比1∶1的水和甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

洗脱液经超滤或3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，干燥，得到胡芦巴皂苷B。

本发明方法的胡芦巴总皂苷提取物可以采用常规方法制备得到，也可以采用市售产品。优选采用申请号为200510020636.3，发明名称为“一种治疗糖尿病的药物组合物及其制备方法和用途”中的方法制备得到。

本发明方法可以制备得到纯度≥96wt％的胡芦巴皂苷B，其纯度较高，可以作为胡芦巴总皂苷的对照品使用，从而为胡芦巴总皂苷的质量控制提供了途径。另外，本发明方法制备的胡芦巴皂苷B也可以直接作为药品使用。本发明为高纯度胡芦巴皂苷B的制备提供了一种新的方法，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

本发明制备胡芦巴皂苷B的方法包括如下步骤：

a、胡芦巴总皂苷提取物的水溶液，过聚酰胺柱、碱性氧化铝柱、中性氧化铝柱或硅胶柱，用水洗脱柱子(优选洗脱至洗脱液振摇无泡沫或取1份洗脱液加入0.8～1.2倍体积的高氯酸不显红色为止，一般情况下，取1ml洗脱液加入1ml高氯酸进行判断即可)，收集合并洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品一。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法的a步骤中的胡芦巴总皂苷提取物的水溶液优选过聚酰胺柱或碱性氧化铝柱。

其中，本发明方法的a步骤中，胡芦巴总皂苷提取物的水溶液，优选先过碱性氧化铝柱，所收集合并的洗脱液再过聚酰胺柱，收集流出液，流出液再进行浓缩、干燥操作。这样可以除去更多的酸性杂质，特别是那些能被氧化铝吸附而不被聚酰胺吸附的杂质，如色素、黄酮等。

其中，本发明方法的a步骤中，胡芦巴总皂苷提取物的水溶液中的胡芦巴总皂苷提取物浓度只要能够使其中的胡芦巴皂苷B能够完全被吸附即可，但是，如果浓度过低，则吸附时间过长，影响生产效率；如果浓度过高，需要多吸附几次，同样会影响生产效率，因此，为了提高生产效率，本发明方法的a步骤中所述的胡芦巴总皂苷提取物的水溶液中的胡芦巴总皂苷提取物浓度优选为70～130g/L。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法优选还采用下述b步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品一：

b、a步骤所得洗脱液过D101型大孔树脂柱，然后用水洗涤大孔树脂柱至洗涤液近澄明，再用75～85wt％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱醇液(优选收集洗脱醇液至洗脱醇液挥干后遇高氯酸不显色为止)，合并洗脱醇液，回收溶剂，得浸膏，所得浸膏为胡芦巴皂苷B粗品二。

其中，本发明方法的b步骤，洗脱的乙醇溶液浓度过高或过低都可能导致制备的胡芦巴皂苷B的纯度不高，用75～85wt％的乙醇溶液洗脱较为合适，优选采用80wt％的乙醇溶液洗脱。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法优选还采用下述c步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品二：

c、b步骤所得浸膏加水溶解，用正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，干燥，得到白色粉末，白色粉末即为胡芦巴皂苷B粗品三。

其中，本发明方法的c步骤中，采用正丁醇萃取时，其用量可以采用常规萃取剂的用量即可。如果只萃取一次，则可能不能完全将胡芦巴皂苷B萃取而出，从而影响胡芦巴皂苷B的收率，为了提高胡芦巴皂苷B的收率，本发明方法的c步骤中优选用正丁醇萃取4～6次，然后合并萃取液并回收正丁醇；其中，每次萃取的正丁醇与浸膏的水溶液体积比优选为0.7～1.3∶0.7～1.3。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法优选还采用下述d、e步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品三：

d、c步骤所得白色粉末用甲醇溶解，加入丙酮沉淀至基本无沉淀析出，过滤，所得沉淀干燥，沉淀再用甲醇溶解，然后用硅胶H或硅胶吸附，挥去溶剂后研细；

e、另取硅胶H，用体积比为23～27∶5～7∶0.5～0.9的氯仿-甲醇-水溶液湿法装柱，然后用不同比例的氯仿-甲醇-水溶液梯度洗脱，收集氯仿-甲醇-水体积比为23～27∶10～14∶1.5～2.5的部分，回收溶剂，干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品四。

其中，本发明方法的d步骤中优选用硅胶H吸附，这样可以提高吸附效果。

其中，为了提高胡芦巴皂苷B的纯度及收率，本发明方法e步骤中，装拄所用氯仿-甲醇-水溶液的体积比优选为25∶6∶0.7。

其中，为了提高胡芦巴皂苷B的纯度及收率，本发明方法e步骤中，洗脱所用氯仿-甲醇-水溶液的体积比优选为25∶12∶2。

其中，为了使制备的胡芦巴皂苷B的纯度更高，本发明方法e步骤所得胡芦巴皂苷B粗品四还优选采用下述方法精制：胡芦巴皂苷B粗品4加水溶解，过葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20柱，然后用体积比1∶1的氯仿和甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

或胡芦巴皂苷B粗品四加水溶解，过C18反相硅胶柱，然后用体积比1∶1的水和甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

洗脱液经超滤或3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，干燥，得到胡芦巴皂苷B。

本发明方法的胡芦巴总皂苷提取物可以采用常规方法制备得到，也可以采用市售产品。优选采用申请号为200510020636.3，发明名称为“一种治疗糖尿病的药物组合物及其制备方法和用途”中的方法制备得到。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1-5所用仪器及材料为：

胡芦巴皂苷B的提取原料为中国药典2005版一部收载品种--豆科植物胡芦巴Trigonella foenum-graecum L.的干燥成熟种子，夏季果实成熟时采割植株，晒干，打下种子，除去杂质。原生药购自成都市五块石药材市场，经四川省中医药科学院生药室舒光明研究员鉴定为豆科植物胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)的种子。

薄层层析用0.6％羧甲基纤维素钠硅胶H板(80℃活化半小时)。展开剂：①氯仿-甲醇-水-醋酸-正丁醇(25∶12∶2∶2∶5)；显色剂：①10％H₂SO₄乙醇溶液，100℃加热3分钟显色。

实施例1采用本发明方法制备胡芦巴皂苷B

1、总皂苷的提取：取胡芦巴种子2kg，粉碎过20目筛，用相当于原生药重量5.5倍量的70％乙醇加热回流提取3次(首次2小时，其余均为1.5小时，首次乙醇用量为原生药量的2.5倍，其余为1.5倍)。合并提取液回收乙醇后得浸膏(比重1.2g/ml)，以浸膏量30倍(W/W)的水溶解浸膏，将此水溶液通过已处理好的GD-WLD型大孔吸附树脂柱(树脂用量∶原生药1∶1)，用水洗涤柱床，用1％NaOH溶液5000mL缓慢通过树脂柱，随后用大量水洗涤树脂柱至中性，放干柱内水溶液，用2倍树脂量的乙醇洗脱，回收洗脱液，水浴上挥尽乙醇(比重1.2以上)，得浸膏约240g。

2、分离与纯化：取120g胡芦巴总皂苷提取物浸膏，用1000ml温水(约40℃)溶解。另取层析用聚酰胺500g(100～200目)，用适量蒸馏水调匀后上柱(120×6cm)，平衡6小时后，将前述皂苷水溶液上于柱顶，通过此柱，并继续用水洗涤，直至洗脱液振摇无泡沫或取1ml加入1ml高氯酸不显红色为止。收集合并洗脱液，将其通过已预处理好的D₁₀₁型大孔树脂柱(60×6cm，装600g树脂，树脂用前分别用7％NaOH乙醇液和10％Hcl乙醇液浸泡过夜，尔后用清水洗涤至中性)，柱床用清水洗涤后用80％乙醇洗脱，收集洗脱醇液至洗脱液挥干后遇高氯酸不显色为止。合并洗脱液，回收溶剂，得浸膏，经60℃减压干燥，得黄白色纯总皂苷粉末约30g。

将此粉末用150mL蒸馏水溶解，置于分液漏斗中，用正丁醇振摇提取5次，每次用正丁醇100mL，振摇5分钟，收集正丁醇提取液，减压回收正丁醇至干。转至60℃烘箱中减压干燥，得黄白色皂苷粉末约25g(该样品在薄层层析上可见皂苷B以下大部分接近原点的皂苷被除去)。

将此粉末用适量甲醇溶解，加入丙酮沉淀三次，滤过，干燥，得白色纯皂苷粉末约20g。(该样品在薄层层析上可见色素和大部分皂苷B以上的皂苷被除去)。

取白色纯总皂苷10g，用20ml甲醇加热溶解，用20g硅胶H吸附，挥去溶剂后研细备用。另取硅胶H 800g，用氯仿-甲醇-水(25∶6∶0.7)湿法装柱(120×5.5cm)，平衡12小时后将前述吸样硅胶H上于柱顶，用不同比例的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析监控洗脱物(展开剂①，显色剂①)，收集氯仿-甲醇-水(25∶12∶2)部分，得到皂苷B粗品约3g。

取皂苷B粗品3g，用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇1∶1等度洗脱)纯化，溶液经3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，60℃减压干燥，得纯白色皂苷B 2.4g(用HPLC峰面积归一化法测定，纯度在96％以上)。

实施例2采用本发明方法制备胡芦巴皂苷B

1、总皂苷的提取：取胡芦巴种子2kg，粉碎过20目筛，用相当于原生药重量5.5倍量的70％乙醇加热回流提取3次(首次2小时，其余均为1.5小时，首次乙醇用量为原生药量的2.5倍，其余为1.5倍)。合并提取液回收乙醇后得浸膏(比重1.2g/ml)，以浸膏量30倍(W/W)的水溶解浸膏，将此水溶液通过已处理好的GD-WLD型大孔吸附树脂柱(树脂用量∶原生药1∶1)，用水洗涤柱床，放干柱内水溶液，用2倍树脂量的乙醇洗脱，回收洗脱液，水浴上挥尽乙醇(比重1.2以上)，得浸膏约240g。

2、分离与纯化：取120g胡芦巴总皂苷提取物浸膏，用1000ml温水(约40℃)溶解。另取碱性氧化铝(100～200目)，用适量蒸馏水调匀后上柱(120×6cm)，平衡6小时后，将前述皂苷水溶液上于柱顶，通过此柱，并继续用水洗涤，直至洗脱液振摇无泡沫或取1ml加入1ml高氯酸不显红色为止。收集合并洗脱液，将其通过聚酰胺柱(60×6cm)，收集流出液，将其通过已预处理好的D₁₀₁型大孔树脂柱(60×6cm，装600g树脂，树脂用前分别用7％NaOH乙醇液和10％Hcl乙醇液浸泡过夜，尔后用清水洗涤至中性)，柱床用清水洗涤后用80％乙醇洗脱，收集洗脱液至其挥干后遇高氯酸不显色为止。合并洗脱液，回收溶剂，得浸膏，经60℃减压干燥，得黄白色纯总皂苷粉末约35g。

将此粉末用150mL蒸馏水溶解，置于分液漏斗中，用正丁醇振摇提取5次，每次用正丁醇100mL，振摇5分钟，收集正丁醇提取液，减压回收正丁醇至干。转至60℃烘箱中减压干燥，得黄白色皂苷粉末约25g(该样品在薄层层析上可见皂苷B以下大部分接近原点的皂苷被除去)。

将此粉末用适量甲醇溶解，加入丙酮沉淀三次，滤过，干燥，得白色纯皂苷粉末约20g。(该样品在薄层层析上可见色素和大部分皂苷B以上的皂苷被除去)。

取白色纯总皂苷10g，用20ml甲醇加热溶解，用20g硅胶H吸附，挥去溶剂后研细备用。另取硅胶H 800g，用氯仿-甲醇-水(25∶6∶0.7)湿法装柱(120×5.5cm)，平衡12小时后将前述吸样硅胶H上于柱顶，用不同比例的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析监控洗脱物(展开剂①，显色剂①)，收集氯仿-甲醇-水(25∶12∶2)部分，得到皂苷B粗品约3g。

取皂苷B粗品3g，用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇1∶1等度洗脱)纯化，溶液经3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，60℃减压干燥，得纯白色皂苷B 2.4g(用HPLC峰面积归一化法测定，纯度在96％以上)。

实施例3采用本发明方法制备胡芦巴皂苷B

1、取胡芦巴总皂苷提取物浸膏90g(市售产品)，用1000ml温水(约40℃)溶解。另取层析用聚酰胺500g(100～200目)，用适量蒸馏水调匀后上柱(120×6cm)，平衡6小时后，将前述皂苷水溶液上于柱顶，通过此柱，并继续用水洗涤，直至洗脱液振摇无泡沫或取1ml加入1ml高氯酸不显红色为止。收集合并洗脱液，将其通过已预处理好的D₁₀₁型大孔树脂柱(60×6cm，装600g树脂，树脂用前分别用7％NaOH乙醇液和10％Hcl乙醇液浸泡过夜，尔后用清水洗涤至中性)，柱床用清水洗涤后用80％乙醇洗脱，收集洗脱醇液至洗脱液挥干后遇高氯酸不显色为止。合并洗脱液，回收溶剂，得浸膏，经60℃减压干燥，得黄白色纯总皂苷粉末约12g。

将此粉末用适量甲醇溶解，加入丙酮沉淀三次，滤过，干燥，得白色纯皂苷粉末约9g。(该样品在薄层层析上可见色素和大部分皂苷B以上的皂苷被除去)。取此粉末，用15ml甲醇加热溶解，用18g硅胶H吸附，挥去溶剂后研细备用。另取硅胶H 800g，用氯仿-甲醇-水(25∶6∶0.7)湿法装柱(120×5.5cm)，平衡12小时后将前述吸样硅胶H上于柱顶，用不同比例的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析监控洗脱物(展开剂①，显色剂①)，收集氯仿-甲醇-水(25∶12∶2)部分，得到皂苷B粗品约3.5g。

取此皂苷B粗品，用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇1∶1等度洗脱)纯化，溶液经3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，60℃减压干燥，得纯白色皂苷B 2.6g(用HPLC峰面积归一化法测定，纯度在97％以上)。

实施例4采用本发明方法制备胡芦巴皂苷B

1、分离与纯化：取胡芦巴总皂苷提取物浸膏90g(市售产品)，用1000ml温水(约40℃)溶解。另取碱性氧化铝(100～200目)，用适量蒸馏水调匀后上柱(120×6cm)，平衡6小时后，将前述皂苷水溶液上于柱顶，通过此柱，并继续用水洗涤，直至洗脱液振摇无泡沫或取1ml加入1ml高氯酸不显红色为止。收集合并洗脱液，将其通过聚酰胺柱(60×6cm)，收集流出液，将其通过已预处理好的D₁₀₁型大孔树脂柱(60×6cm，装600g树脂，树脂用前分别用7％NaOH乙醇液和10％Hcl乙醇液浸泡过夜，尔后用清水洗涤至中性)，柱床用清水洗涤后用80％乙醇洗脱，收集洗脱醇液至洗脱液挥干后遇高氯酸不显色为止。合并洗脱液，回收溶剂，得浸膏，经60℃减压干燥，得黄白色纯总皂苷粉末约12g。

将此粉末用80mL蒸馏水溶解，置于分液漏斗中，用正丁醇振摇提取5次，每次用正丁醇100mL，振摇5分钟，收集正丁醇提取液，减压回收正丁醇至干。转至60℃烘箱中减压干燥，得黄白色皂苷粉末约10g(该样品在薄层层析上可见皂苷B以下大部分接近原点的皂苷被除去)。

将此粉末用适量甲醇溶解，加入丙酮沉淀三次，滤过，干燥，得白色纯皂苷粉末约8.5g。(该样品在薄层层析上可见色素和大部分皂苷B以上的皂苷被除去)。

取此粉末，用15ml甲醇加热溶解，用18g硅胶H吸附，挥去溶剂后研细备用。另取硅胶H 800g，用氯仿-甲醇-水(25∶6∶0.7)湿法装柱(120×5.5cm)，平衡12小时后将前述吸样硅胶H上于柱顶，用不同比例的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析监控洗脱物(展开剂①，显色剂①)，收集氯仿-甲醇-水(25∶12∶2)部分，得到皂苷B粗品约3.3g。

取此皂苷B粗品，用葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇1∶1等度洗脱)纯化，溶液经3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，60℃减压干燥，得纯白色皂苷B 2.5g(用HPLC峰面积归一化法测定，纯度在97％以上)。

实施例5采用本发明方法制备胡芦巴皂苷B

1、分离与纯化：取胡芦巴总皂苷提取物浸膏90g(采用申请号为200510020636.3的方法制备得到)，用1000ml温水(约40℃)溶解。另取碱性氧化铝(100～200目)，用适量蒸馏水调匀后上柱(120×6cm)，平衡6小时后，将前述皂苷水溶液上于柱顶，通过此柱，并继续用水洗涤，直至洗脱液振摇无泡沫或取1ml加入1ml高氯酸不显红色为止。收集合并洗脱液，将其通过聚酰胺柱(60×6cm)，收集流出液，将其通过已预处理好的D₁₀₁型大孔树脂柱(60×6cm，装600g树脂，树脂用前分别用7％NaOH乙醇液和10％Hcl乙醇液浸泡过夜，尔后用清水洗涤至中性)，柱床用清水洗涤后用80％乙醇洗脱，收集洗脱醇液至洗脱液挥干后遇高氯酸不显色为止。合并洗脱液，回收溶剂，得浸膏，经60℃减压干燥，得黄白色纯总皂苷粉末约12g。

将此粉末用80mL蒸馏水溶解，置于分液漏斗中，用正丁醇振摇提取5次，每次用正丁醇100mL，振摇5分钟，收集正丁醇提取液，减压回收正丁醇至干。转至60℃烘箱中减压干燥，得黄白色皂苷粉末约10g(该样品在薄层层析上可见皂苷B以下大部分接近原点的皂苷被除去)。

将此粉末用适量甲醇溶解，加入丙酮沉淀三次，滤过，干燥，得白色纯皂苷粉末约8.5g。(该样品在薄层层析上可见色素和大部分皂苷B以上的皂苷被除去)。

取此粉末，用15ml甲醇加热溶解，用18g硅胶H吸附，挥去溶剂后研细备用。另取硅胶H 800g，用氯仿-甲醇-水(25∶6∶0.7)湿法装柱(120×5.5cm)，平衡12小时后将前述吸样硅胶H上于柱顶，用不同比例的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，用薄层层析监控洗脱物(展开剂①，显色剂①)，收集氯仿-甲醇-水(25∶12∶2)部分，得到皂苷B粗品约3.3g。

取此皂苷B粗品，用C₁₈反相硅胶(甲醇∶水1∶1等度洗脱)纯化，溶液经3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，60℃减压干燥，得纯白色皂苷B 2.5g(用HPLC峰面积归一化法测定，纯度在98％以上)。

本发明实施例1-5制备的纯白色皂苷采用下述方法鉴别是否为胡芦巴皂苷B。

鉴别方法：

1、取本品约0.5mg置于10ml量瓶中，加高氯酸至刻度，摇匀，用高氯酸作空白，在30分钟内按分光光度法(中国药典2005版一部附录VB)在200～600nm范围内扫描测定，在410±1nm波长处有最大吸收。

2、红外光谱：取本品适量，按红外分光光度法(中国药典2005版一部附录VB)溴化钾压片测定，其波数应为(cm^-1)3433(br.缔合羟基)，2935、2906、2844(S，CH₃.CH₂)，1647(苷元双键)，1456、1379、1259、1043(br.缔合羟基)，912、837、812。

经上述方法鉴别，本发明实施例1-5制备的纯白色皂苷均为胡芦巴皂苷B。

含量测定方法

胡芦巴皂苷B化学结构中有一双键，在203nm处有吸收，可以用高效液相色谱法测定，用峰面积归一化法确定纯度，本发明实施例1-5制备的胡芦巴皂苷B按下述方法测定纯度。

1、仪器及试剂

高效液相色谱仪：美国Agilent 1100系列，四元泵，Agilent微量进样器，DAD检测器，Agilent1100系列HPLC 3D Chemstation software工作站，CQX25-06超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)，Sartorius电子天平BP 211D型(美国，十万分之一)，Kromasil NH₂柱(4.6mm×250mm，5nm，瑞典)。胡芦巴皂苷B四川省中医药科学院(四川省中医药科学院制备)，乙腈(色谱纯，美国TEDIA)，磷酸(AR，成都化学试剂厂)，重蒸馏水(四川省中医药科学院制备)。

2、色谱条件采用乙腈：2‰磷酸-水系统(75.5∶24.5)，检测波长203nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样浓度为0.7～0.9mg/ml。

Claims (14)

1.制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于包括如下步骤：

a、胡芦巴总皂苷提取物的水溶液过聚酰胺柱、碱性氧化铝柱、中性氧化铝柱或硅胶柱，用水洗脱柱子，收集合并洗脱液，洗脱液浓缩、干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品一。

2.根据权利要求1所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：a步骤中的胡芦巴总皂苷提取物的水溶液过聚酰胺柱或碱性氧化铝柱。

3.根据权利要求1或2所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：a步骤中，胡芦巴总皂苷提取物的水溶液，先过碱性氧化铝柱，所收集合并的洗脱液再过聚酰胺柱，收集流出液，流出液再进行浓缩、干燥操作。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：a步骤中所述的胡芦巴总皂苷提取物的水溶液中的胡芦巴总皂苷提取物浓度为70～130g/L。

5.根据权利要求1～4任一项所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：a步骤中用水洗脱柱子至洗脱液振摇无泡沫或取1份洗脱液加入0.8～1.2倍体积的高氯酸不显红色为止。

6.根据权利要求1～5任一项所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于还采用下述b步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品一：

b、a步骤所得洗脱液过D101型大孔树脂柱，然后用水洗涤大孔树脂柱至洗涤液近澄明，再用75～85wt％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱醇液，合并洗脱醇液，回收溶剂，得浸膏，所得浸膏为胡芦巴皂苷B粗品二。

7.根据权利要求6所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：b步骤中采用80wt％的乙醇溶液洗脱。

8.根据权利要求6或7所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：b步骤中，收集洗脱醇液至洗脱醇液挥干后遇高氯酸不显色为止。

9.根据权利要求6～8任一项所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于还采用下述c步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品二：

c、b步骤所得浸膏加水溶解，用正丁醇萃取，萃取液回收正丁醇，干燥，得到白色粉末，白色粉末即为胡芦巴皂苷B粗品三。

10.根据权利要求9所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：c步骤中用正丁醇萃取4～6次，然后合并萃取液并回收正丁醇；其中，每次萃取的正丁醇与浸膏的水溶液体积比为0.7～1.3∶0.7～1.3。

11.根据权利要求9或10所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于还采用下述d、e步骤纯化胡芦巴皂苷B粗品三：

d、c步骤所得白色粉末用甲醇溶解，加入丙酮沉淀至基本无沉淀析出，过滤，所得沉淀干燥，沉淀再用甲醇溶解，然后用硅胶H或硅胶吸附，挥去溶剂后研细；

e、另取硅胶H，用体积比为23～27∶5～7∶0.5～0.9的氯仿-甲醇-水溶液湿法装柱，然后用不同比例的氯仿-甲醇-水溶液梯度洗脱，收集氯仿-甲醇-水体积比为23～27∶10～14∶1.5～2.5的部分，回收溶剂，干燥，得到胡芦巴皂苷B粗品四。

12.根据权利要求11所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：d步骤中用硅胶H吸附。

13.根据权利要求11或12所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：e步骤中，装拄所用氯仿-甲醇-水溶液的体积比为25∶6∶0.7，洗脱所用氯仿-甲醇-水溶液的体积比为25∶12∶2。

14.根据权利要求11～13任一项所述的制备胡芦巴皂苷B的方法，其特征在于：e步骤所得胡芦巴皂苷B粗品四还采用下述方法精制：胡芦巴皂苷B粗品四加水溶解，过葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20柱，然后用体积比1∶1的氯仿和甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

或胡芦巴皂苷B粗品四加水溶解，过C18反相硅胶柱，然后用体积比1∶1的水和甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；

洗脱液经超滤或3号砂芯漏斗滤过，收集滤液，干燥，得到胡芦巴皂苷B。