CN102526755A

CN102526755A - 一种还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药及制备方法

Info

Publication number: CN102526755A
Application number: CN2012100038601A
Authority: CN
Inventors: 余家会; 吴庆娥; 张许柱; 杜芳; 曾君萍; 黄进
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明公开了一种还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药，该纳米胶束前药的化学结构如下：

Description

一种还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药及制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术、纳米医药及新材料领域，具体地说是一种还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药，并提供了制备和纳米尺度自组装该前药的方法及其潜在用途。

背景技术

喜树碱（CPT）对治疗多种恶性肿瘤具有显著疗效，其通过作用于DNA拓扑异构酶 I（DNA topoisomerase I）来抑制DNA复制、转录和有丝分裂。其闭合的内酯环形式也即E环是抑制肿瘤的有效成份，但在生理pH下，E环20位羟基能与邻位的酯羰基形成分子内氢键，使E环易于水解并开环形成羧酸盐形式而导致其活性大大降低，且其水溶性很差，这阻碍了喜树碱在临床上的应用。

目前，已有三类聚合物喜树碱类衍生物用于临床试验。两种HPMA-CPT共聚物类药、普鲁替康和以PEG为载体的喜树碱前药（Caiolfa, V. R., Zamai, M., Fiorino, A., et al..）。这些例子将喜树碱键合到聚合物上，提高了喜树碱的水溶性并且降低了其毒副作用，但仅由酶降解氨基酸控制喜树碱的释放达不到稳定释药的功能。

据大量文献报道，二硫键（-S-S-）是一类还原敏感化学键，在人体谷胱甘肽的还原作用下可发生断裂。同时研究发现，人体细胞外谷胱甘肽浓度很低，约2-20微摩尔/升，不足以使二硫键断裂。而细胞内谷胱甘肽浓度可达10毫摩尔/升，特别是癌细胞内谷胱甘肽浓度甚至高达40毫摩尔/升，足以使二硫键断裂。

引入二硫键的以PEG为载体的喜树碱纳米药物，在人体内可以实现细胞内定点释药、对病变组织具有被动靶向，提高水溶性，降低药物毒副作用，具有较高的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗肺癌、前列腺癌等广谱抗癌前药及制备方法，即针对喜树碱药物的不足，充分模拟人体内环境的特点，结合纳米生物医药的最新研究成果，利用喜树碱接枝共聚物高分子发生纳米尺度分子自组装的原理，合成粒径在100 nm左右、粒径分布范围窄、在血液中能长效循环、对癌变组织靶向性的、药物释放速率可控的高分子纳米胶束前药，以提高喜树碱的水溶性，同时最大限度减低其毒副作用，提高疗效和生物利用度，以其克服目前治疗肺癌、前列腺癌、乳腺癌等临床应用受到制约的屏障。

本发明所涉及的喜树碱纳米胶束前药的化学结构如下所示：

Figure 2012100038601100002DEST_PATH_IMAGE002

其中： mPEG分子量为1900，a为21-24的实数；X和Y分别为0.1-0.9的实数，喜树碱载药率在50-90%。

本发明涉及的喜树碱纳米胶束前药的制备方法，包括以下步骤：

第一步、合成聚乙二醇单甲醚(mPEG)活化酯：将氯甲酸对硝基苯酯(NPC)溶于二氯甲烷，并逐滴滴入溶有mPEG的二氯甲烷溶液中，室温下反应24h，在乙醚中重沉淀得mPEG- NPC；其中：乙二醇单甲醚与氯甲酸对硝基苯酯的摩尔比为1:3～1:6；

所述的重沉淀是指：将浓缩后的反应溶液逐滴滴入高速搅拌的乙醚中，过滤，将所得沉淀溶于二氯甲烷，重复上述操作3次得产物；

第二步、合成mPEG胱胺衍生物：取胱胺二盐酸盐溶于二甲亚砜（DMSO）中，加入三乙胺除盐后，逐滴滴入第一步产物mPEG-NPC的DMSO溶液中，反应24h后，经透析冻干得产物 mPEG-SS-NH₂；其中：第一步产物与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:5～1:9；

所述的透析冻干是指：用透析袋将过滤后的反应液置于去离子水中透析72 h后冷冻干燥。

第三步、合成聚天冬酰亚胺(PSI)：首先将L-天冬氨酸溶于环丁砜中并加入磷酸，然后在氮气保护下用油水分离器除水，再依次进行加热回流处理和纯化处理，得聚天冬酰亚胺固体；

所述的加热回流处理是指：加热至60℃ 环境下回流反应24小时。

所述的纯化处理是指：室温环境下自然冷却后用水泵进行抽滤，将滤液再以甲醇或无水乙醚进行沉淀，最后将沉淀物在真空环境下进行干燥。

第四步、mPEG-SS-NH₂部分开环PSI（两者摩尔比为1:2～1:5）：将第三步中制备获得的聚天冬酰亚胺固体溶于二甲基甲酰胺中并置于氮气保护环境下；将第二步中制备获得的mPEG-SS-NH₂溶于二甲基甲酰胺中并将其逐步滴入聚天冬酰亚胺的二甲基甲酰胺溶液中，然后依次进行加热回流、透析和冻干处理得mPEG-SS-NH-g-PSI；

第五步、6-氨基己酸（aminocaproic acid）全部开环PSI（两者摩尔比为1:2～1:5）：将aminocaproic acid和第四步制得的mPEG-SS-NH-g-PSI 溶解于三乙胺和水的混合溶剂中室温反应一天，然后进行透析、冻干处理得mPEG-SS-NH-g-PHAsp；

第六步、接上药物CPT：将CPT和mPEG-SS-NH-g-PHAsp 溶解于DMF溶液中，加入4-二甲氨基吡啶（DMAP）、双（2-氧代-3-恶唑烷基）次磷酰氯（BOP-Cl）和N、N-2-异丙基乙胺（DIEA）；室温反应4h，然后升温到40-50℃继续反应24h，然后乙醚处理，过Sephadex LH-20凝胶柱，乙醚沉淀、真空干燥得所述喜树碱纳米胶束前药mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT；其中：CPT 与mPEG-SS-NH-g-PHAsp的摩尔比为1:2～1:5；CPT 与双（2-氧代-3-恶唑烷基）次磷酰氯的摩尔比为1:2～1:5；CPT与N、N-2-异丙基乙胺的摩尔比为1:1～1:3；CPT与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2～1:5。

将本发明的mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT溶于去离子水中，自组装成纳米胶束前药，纳米胶束前药的临界胶束浓度测得为3×10^-3mg/mL；透射电镜观测其形貌为球形；动态光散射测得其粒径100nm，且分散较窄；用HPLC测定了纳米胶束前药的释放，动态光散射考查了胶束的降解过程；通过观察小鼠成纤维细胞株（L929）的存活率研究了其细胞毒性，相比CPT，其毒性明显降低且能达到较好的效果。）

本发明相比现有技术其优点在于：（1）引入亲水单元mPEG和疏水单元PSI对小分子药物CPT进行改性，使其在人体循环中能自组装成纳米胶束，并赋予其被动靶向特性；（2）侧基中二硫键在人体细胞内谷胱甘肽的还原作用下发生降解，影响了CPT和聚合物链接的酯键的水解，达到控制释放、降低毒副作用的效果。

附图说明

图1为本发明喜树碱纳米胶束前药的化学结构及自组装模型图；

图2为本发明mPEG-SS-NH₂的¹H NMR谱图；

图3为本发明mPEG-SS-NH-g-PSI的¹H NMR谱图；

图4为本发明mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT的¹H NMR谱图；

图5为本发明喜树碱纳米胶束前药的粒径及粒径分布图；

图6为本发明喜树碱纳米胶束前药的稳定性示意图；

图7为本发明还原降解过程中喜树碱纳米胶束前药粒径随时间变化曲线图；

图8为本发明喜树碱纳米胶束前药的释药性能示意图；

图9为本发明喜树碱纳米胶束前药的体外毒性示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

制备所述喜树碱纳米胶束前药

第一步、mPEG-NPC的合成

1.1）取mPEG (Mw= 1900, 7.6 g, 4 mmol)，氯甲酸对硝基苯酯(NPC, 3.21 g, 16 mmol)（两者摩尔比1:4）前者溶解于70 mL二氯甲烷（DCM）中，后者溶解于20 mL DCM中；

1.2）mPEG的DCM溶液中加入1.62 mL (20 mmol)吡啶，冰浴氮气保护下，将p-NPC溶液逐滴滴入mPEG的溶液中，滴完后室温搅拌反应24 h；

1.3）浓缩反应液并在乙醚中重沉淀3次，再真空干燥得mPEG-NPC。

第二步、mPEG-SS-NH₂的合成

2.1）取胱胺二盐酸盐(2.89 g, 12.88 mmol)和三乙胺(4.85 g, 48 mmol)共同溶于60 mL二甲亚砜（DMSO）中，并向其逐渐滴入第一步产物mPEG-NPC (3.8 g, 1.84 mmol)（其与胱胺二盐酸盐摩尔比1:7）的DMSO溶液，持续搅拌反应24小时；

2.2）冰乙醚重沉淀真空干燥得mPEG-SS-NH₂，其¹H NMR如图2。

第三步、合成PSI

称取25 g （0.188 mol）L-天冬氨酸，溶于65 mL环丁砜中，加入0.6 mL磷酸，氮气保护，使用油水分离器除水，加热回流24 h。冷却至室温，过滤，所得溶液滴加到500 mL 冰冷水中，过滤收集沉淀，用蒸馏水、甲醇反复洗涤至滤液呈中性，真空干燥，得产品PSI，产率为90 % 。

第四步、合成mPEG-SS-NH-g-PSI

4.1）取第三步制得的PSI (73.72 mg, 0.76 mmol)溶于25 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，通氮气保护；

4.2）取第二步制得的mPEG-SS-NH₂(0.41 g, 0.19 mmol)（与PSI摩尔比例1:4）的30 mL DMF溶液，冰浴下逐滴滴入PSI溶液中，滴加完毕后升至室温反应12 h，再升至60 ℃，反应24 h；

4.3）冷却至室温，用截留分子量3500的透析袋透析混合液3 d，冻干得产品mPEG-SS-NH-g-PSI，其¹H NMR如图3。

第五步、合成mPEG-SS-NH-g-PHAsp

5.1）取6-氨基己酸 (3.258 g, 24.8mmol) 和mPEG–SS–NH–g–PSI (0.6032 g, 6.21mmol)（与前者摩尔比1:4）溶于100 mL 水和20 mL三乙胺的混合溶剂中，室温反应24 h至溶液澄清透明；

5.2）旋出大部分水和三乙胺，冷却至室温，用截留分子量3500的透析袋透析混合液4 d，冻干得产品mPEG-SS-NH-g-PHAsp。

第六步、合成mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT

6.1）将157 mg CPT ( 0.45 mmol), 342 mg mPEG-SS-NH-g-PHAsp (1.5 mmol)(CPT与其摩尔比为1:3.3) 溶解在150 mL DMF中，加入344 mg BOP-Cl ( 1.35 mmol)(CPT与其摩尔比为1:3), 87 mg DIEA (0.675 mmol)(CPT与其摩尔比为1:1.5)和198 mg DMAP ( 1.62 mmol)(CPT与其摩尔比为1:3.6)，室温下反应4 h，然后温度控制在40-50℃继续反应24 h；

6.2）过滤，浓缩滤液至5 mL，滴加至100 mL无水乙醚中，过滤，然后过Sephadex LH-20 凝胶柱，过完柱子，乙醚重沉淀，真空干燥得黄色粉末mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT，产率80%，其¹H NMR如图4。

实施例2

组装所述喜树碱纳米胶束前药

称取真空干燥后的mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT 20 mg溶于10 mL的去离子水中，超声振荡后即形成两亲性纳米胶束（图1），动态光散射测得粒径为100 nm（图5），属纳米级别。

实施例3

测定所述喜树碱纳米胶束前药的稳定性

将CPT纳米胶束10 mg 加入到100 mL PBS (0.01 mol/L, pH 7.4)中，37 ℃恒温振荡，隔一段时间取出0.5 mL用UV检测，计算A₃₅₅/A₃₆₈的比值，用来测定CPT共聚物中CPT的稳定性（图6）。

实施例4

所述喜树碱纳米胶束前药的降解

于上述胶束中加入足量二硫苏糖醇(DTT)对胶束进行还原降解，每隔一段时间取样1mL，通过DLS测其粒径的变化。如图7所示，随着时间的增加，胶束粒径逐渐增大且分散变宽，且由单峰变为双峰，表明在DTT的还原作用下，二硫键断裂，胶束发生降解而团聚使粒径增大。

实施例5

所述喜树碱纳米胶束前药的释放

将mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT (400 μg/mL)的PBS溶液装入透析袋中，再将透析袋置于40 mL PBS (pH= 7.4, NaCl= 0.15 g/L)的离心管中，于37 ℃中恒温振荡，每隔一定时间取出0.5 mL透析液并补充0.5 mL的PBS，用HPLC测定喜树碱的累计释放浓度，计算其时间累积释放量。如图8所示，本发明喜树碱纳米胶束前药有着明显的缓释效果，表明该胶束对肿瘤细胞有一定的缓释功能。

实施例6

所述喜树碱纳米胶束前药体内毒性的测定

采用MTT比色法。在37 ℃，5 % CO₂的环境下体外培养小鼠成纤维细胞(L929)，并种在96孔板上，加入一系列浓度的CPT，mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT和mPEG-SS-NH-g-PSI样品，用酶标仪测定96孔板上各孔细胞液的吸光度（OD），细胞存活率按照以下公式算得：

细胞存活率=（OD_样品/OD_控制）× 100 %

OD_样品：为加入各浓度样品细胞液的吸光度；

OD_控制：为空白培养液的吸光度。

每个样品设置6组平行样，细胞存活率结果如图9所示，说明喜树碱纳米胶束前药对细胞的毒性有着明显的降低。

上述实施例仅用于说明本发明，但不局限于此，应该理解不脱离本发明的精神范围内还有多种变通和替换方案。

Claims

1.一种还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药，其化学结构式如下：

喜树碱接枝于聚天冬酰亚胺主链上，其中X和Y 分别为0.1-0.9的实数；a为21-24的实数。

2.根据权利要求1所述的还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药，其特征在于：胶束的粒径能够控制在100 nm，喜树碱的载药率为50-90%。

3.一种权利要求1所述还原降解释药可控的喜树碱纳米胶束前药的制备方法，包括以下步骤：

a）将乙二醇单甲醚与氯甲酸对硝基苯酯反应得mPEG-NPC；其中：乙二醇单甲醚与氯甲酸对硝基苯酯的摩尔比为1:3～1:6；

b）将步骤a）产物与胱胺二盐酸盐反应得mPEG-SS-NH₂；其中：步骤a）产物与胱胺二盐酸盐的摩尔比为1:5～1:9；

c）用步骤b）产物和6-氨基己酸分别开环聚天冬酰亚胺，得mPEG-SS-NH-g-PHAsp；其中：步骤b）产物与聚天冬酰亚胺的摩尔比为1:2～1:5；6-氨基己酸与聚天冬酰亚胺的摩尔比为1:2～1:5；

d）取CPT和mPEG-SS-NH-g-PHAsp一定条件下反应得所述喜树碱纳米胶束前药mPEG-SS-NH-g-PHAsp-CPT；

其中：步骤d）的一定条件下反应是：

将CPT 、mPEG-SS-NH-g-PHAsp 溶解在 DMF溶液中，加入双（2-氧代-3-恶唑烷基）次磷酰氯、N、N-2-异丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶室温下反应4 h，然后温度控制在40-50℃继续反应24 h，然后过凝胶柱、乙醚重沉淀得所述产物；其中：CPT 与mPEG-SS-NH-g-PHAsp的摩尔比为1:2～1:5；CPT 与双（2-氧代-3-恶唑烷基）次磷酰氯的摩尔比为1:2～1:5；CPT与N、N-2-异丙基乙胺的摩尔比为1:1～1:3；CPT与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2～1:5。