CN102517301A - 转录激活因子ie1 - Google Patents

Abstract

本发明涉及转录激活因子IE1，如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；其可用于在家蚕中制备重组外源蛋白的应用；本发明还涉及含有转录激活因子IE1的重组载体，pBac[3xp3-Red,Pser1IE1sv40]，转录激活因子IE1基因能显著提高重组外源蛋白表达水平达。

Description

转录激活因子IE1

技术领域

本发明涉及生物基因工程，特别涉及家蚕的转基因领域。

背景技术

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取和生产已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物（昆虫）之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白（fibroin）和覆被在其外层的丝胶蛋白（sericin）构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75%，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25%，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1）、丝胶2(Sericin2）和丝胶3(Sericin3）三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

2000年，田村等人利用pBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及P25基因等的启动子调控元件被鉴定和克隆，这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。近年来，国内外利用pBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al. 2010)、猫干扰素（Kurihara et al. 2007)、蜘蛛丝牵引蛋白（Zhu et al. 2010)、人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al. 2003)、增强型红色荧光蛋白(Tomita et al. 2003)，丝素轻链融合的羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al. 2006)、成纤维细胞生长因子(Hino et al. 2006)、增强型绿色荧光蛋白(Shimizu et al. 2007)、部分胶原蛋白肽段（Yanagisawa et al. 2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al. 2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白（Ogawa et al. 2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al. (2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al. 2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachi et al. 2010)以及可溶性GM-Csf受体α(Urano et al. 2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：在丝素中生产的外源蛋白虽具有较高的含量，但重组蛋白极难纯化且易破坏其生物活性；在丝胶中生产的外源蛋白虽较容易纯化，但利用现有丝胶表达系统获得的重组蛋白含量极低而难以实现规模化生产。因此，针对外源蛋白表达合成的各个关键环节，改造并建立新的高效、稳定的表达系统，并通过转基因技术实现外源蛋白的高效生产，是解决上述瓶颈的根本出路。也是今后家蚕生物反应器开发的核心所在。

外源基因在真核细胞、组织中的表达受到转录水平、转录后调控（包括mRNA的转运和稳定性调控）、翻译效率、翻译后调控以及蛋白分泌等一系列调控，这些调控是由启动子调控区、外源基因ORF中的顺式作用元件与宿主体内的反式调控因子协同完成，该过程极其精密和复杂。另一方面，基于pBac转座子介导的家蚕转基因是由pBac携带外源基因以随机方式插入整合至家蚕基因组中，这种随机插入往往会使外源基因受到基因组插入位点位置效应的影响，使得外源基因的表达量降低。因此，我们需要对外源基因的表达系统进行改造，从转基因的转录水平、翻译效率以及转基因mRNA的稳定性三个方面进行系统性的优化，以实现外源基因的高效和稳定表达，建立高效稳定的家蚕转基因表达系统，以期利用该系统规模化生产具有高附加值的重组外源蛋白，打破家蚕只能作为传统产业的壁垒，为家蚕新型生物产业的开发提供可靠技术体系保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转录激活因子及其制备方法和应用， 其可以提高外源基因的表达水平。

上述目的是通过如下技术路线实现的：

上述目的的实现是通过如下技术手段获得的：1）从家蚕杆状病毒BmNPV株系（重庆株）中克隆获得的IE1转录激活因子(transcription activator) IE1基因，并构建一个能特异在家蚕中部丝腺细胞表达IE 1基因的转基因表达载体；2）从家蚕杆状病毒BmNPV株系（重庆株）中克隆获得的增强子hr3，将hr3用于优化丝胶1基础转基因表达载体； 3）利用在家蚕中部丝腺细胞中表达IE 1基因的转基因表达载体和用hr3增强子优化后的转基因家蚕丝胶1表达载体分别制备转基因家蚕，将表达IE 1的转基因家蚕与hr3优化的转基因家蚕进行杂交，从杂交后代的茧壳中评价IE 1协同Hr3提高表达外源重组蛋白RFP表达量的效果。 

具体技术方案为：

转录激活因子IE1，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

转录激活因子IE1的制备方法，具体为：以家蚕BmNPV基因组作为模板，设计特异性上游引物F: 5'CGCggatccATGACGCAAATTAATTTTAA3'和下游引物为R:5' ATTTgcggccgcTTAATTAAATTCAA3'，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，得转录激活因子IE1。

所述的转录激活因子IE1在家蚕中制备重组外源蛋白的应用。

本发明的目的之二在于提供过一种重组载体及其制备方法，其含有转录激活因子IE1，为转基因家蚕大规模生产重组外源蛋白提供了新的思路。

具体技术方案为：

含有转录激活因子IE1的重组载体。

所述重组载体含有转录激活因子IE1和终止子SV40，所述转录激活因子IE1下游的NotI酶切位点与终止子SV40上游的NotI酶切位点连接。

所述重组载体为pBac[3xp3-Red, Pser1 IE 1sv40]，所述重组载体以pBac[3xp3Redaf] (Aichun Zhao. et al 2010)转基因家蚕表达载体为骨架，依次连接以眼神经组织特异启动子3xp3及其驱动的红色荧光蛋白基因Red，如SEQ ID NO:5为核苷酸序列的丝胶I基因启动子，IE1作为目的基因和sv40转录终止子。

所述的重组载体的制备方法，具体包括以下步骤：

A 中间载体psl1180[Pser1 IE 1sv40]的构建

将如SEQ ID NO:5所示的启动子Pser1、如SEQ ID NO:1所示的转录激活因子IE1以及转录中止信号sv40依次连接至psl1180[afMCSaf]载体上，形成psl1180[Pser1 IE 1sv40]；所述启动子Pser1的上游酶切位点为SalI，下游酶切位点为BamHI，所述转录激活因子IE1的上游酶切位点为BamHI，下游酶切位点为NotI，所述转录中止信号sv40的上游酶切位点为NotI，下游酶切位点为HindIII；

B 重组载体的构建

     将步骤A所得的psl1180[Pser1 IE 1sv40]用AscI酶切后，同经AscI酶切的转基因骨架载体pBac[3xp3-Redaf]的连接，得重组载体pBac[3xp3-Red, Pser1 IE 1sv40]。

本发明的有益效果在于：本发明是关于利用具有提高基因表达量的调控元件对转基因表达载体进行系统的优化改造，构建高效稳定的转基因表达系统，提高外源基因在转基因家蚕中的表达水平。转基因在真核生物体内基因的表达受到转录、翻译、以及翻译后修饰等一系列复杂的调控；同时，作为一种外在性的基因表达产物，为了减少因外源基因的表达而造成对宿主自身的不良影响，宿主自身会抑制外源基因的表达，导致重组蛋白在转基因家蚕中的表达水平很低，严重制约了其实用化开发。本发明针对上述问题对表达系统进行了系统的改造，具有以下优点：①本发明利用从家蚕NPV病毒（重庆株系）中分离得到的hr3增强子元件用于提高转基因丝胶1表达系统的效率，证实hr3能提高重组外源蛋白RFP在转基因家蚕中部丝腺的蛋白表达水平达7倍。②本发明制备了能在家蚕中部丝腺细胞特异表达从家蚕NPV病毒（重庆株系）中分离得到IE 1基因的转基因家蚕，将其与hr3增强子优化的转基因家蚕杂交后，发现IE1能使重组RFP的表达水平进一步提高2.1倍。③本发明利用IE1和hr3构建了丝胶1双元杂交转基因表达系统，与之前的丝胶1基础表达系统相比，优化后的表达的系统其表达外源重组蛋白的能力累计提高达到14.7倍，该双元系统可用于其他重组外源蛋白在转基因家蚕丝腺中的高量表达，为实现我国转基因家蚕生物反应器的实用化奠定坚实的基础。

 

附图说明

图1为非分泌型丝胶I(sericin1)的启动子Pser1的序列示意图，其中，黑色字体带灰色背景的序列（-528~+1）为丝胶1基因启动子调控区，黑色字体的序列为丝胶I(sericin1)基因的    5‘UTR，TSS表示转录起始位点，Initiation codon表示翻译起始位点。

图2为分泌型丝胶I(sericin1)的启动子Pser1sp的序列示意图，其中，黑色字体带灰色背景序列（-528~+1）为丝胶1基因启动子调控区，黑色大写字体的序列为丝胶I(sericin1)基因的完整5‘UTR，黑色小写字体的序列为丝胶I(sericin1)基因的信号肽，促使重组蛋白分泌表达。TSS为转录起始位点，signal peptide为信号肽起始密码，Initiation codon of Red为红色荧光蛋白的起始密码子。

图3为pBac[3xp3-EGFP, Pser1spRedsv40]基础丝胶1表达载体结构示意图。

图4为pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedsv40]转基因表达载体结构示意图。

图5为pBac[3xp3-Red, Pser1 IE 1sv40] 转基因表达载体结构示意图。

图6为丝胶1启动子Pser1sp的驱动下，红色荧光蛋白基因在hSRSV转基因家蚕的5龄第6天中部丝腺特异表达照片，标尺为0.5cm。

图7为hSRSV转基因家蚕的5龄第6天的中部丝腺进行冷冻切片并荧光观察照片，标尺为1.0mm。

图8为hSRSV与S IE 1杂交后代中IE 1基因表达的RT-PCR图，M为DNA标准Marker，1为hSRSV+S IE 1双阳性转基因个体5龄6天丝腺cDNA模板，2为hSRSV转基因个体5龄6天丝腺cDNA模板。

图9为SRSV以及hSRSV中表达的重组RFP蛋白SDS-Page检测图。

图10为SRSV以及hSRSV中表达的重组RFP蛋白Western blotting检测图。

图11为hSRSV以及hSRSV与S IE 1杂交后代重组RFP蛋白的Western blotting检测图。

 

具体实施方式

实施例1转录激活因子IE1

家蚕杆状病毒（BmNPV）转录激活因子IE1基因的克隆：从感染杆状病毒的重庆本地家蚕大造品系中分离、纯化获得BmNPV基因组（重庆株，CQ strain）作为模板，根据NCBI已经公布家蚕杆状病毒T3株系（BmNPV T3 strain）GenBank登陆号GI:438817的IE1基因序列设计一条上游引物含有一个BamH I位点F: 5' CGCggatccATGACGCAAATTAATTTTAA  3'和一条下游引物含有一个Not I酶切位点R: 5' ATTTgcggccgcTTAATTAAATTCAA  3'，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，将回收获得的重庆本地株系的杆状病毒IE1基因连接到测序载体上进行测序鉴定，含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2 增强子Hr3

家蚕杆状病毒（BmNPV）同源重复性序列Hr3的克隆：从感染杆状病毒的重庆本地家蚕大造品系中分离、纯化获得BmNPV基因组（重庆株，CQ strain）作为模板，根据NCBI已经公布家蚕杆状病毒T3株系（BmNPV T3 strain）GenBank登陆号：L24902的hr3同源重复序列设计一条上游引物含有一个Nco I位点F: 5'CATGccatggAAAAAGAAGCCGTGCCCA  3'，和一条下游引物含有一个Nco I位点R: 5'CATGccatggCAGCGTCGTGAAAAGAGG 3'，利用PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，54℃退火30秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，将回收获得的重庆本地株系的杆状病毒同源重复序列（hr3）连接到测序载体上进行测序鉴定，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

实施例3含hr3增强子和IE1的双元杂交转基因丝胶1表达载体的构建

以品种大造基因组为模板，根据家蚕9倍基因组数据库设计丝胶I基因（sericin1）启动子区域特异引物：Pser1-F: 5’CAAAgtcgacGAAAACAGCACACACACTAC 3’，Pser1-R: 5’AAAAggatccAGACCCGATGATAAGACG 3’，Pser1signal peptide-R:  5’AAAAggatccTGTATCTCGATTGCCGGGGTGGTGACCGAAGGCTTTTACGCTgagcgcagccaacgcaatc’ 3，通过PCR扩增获得两条丝胶I(sericin1)的启动子，其中一条不含信号肽进行胞内表达，命名为Pser1（图1），其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，一条含信号肽进行分泌表达，命名为Pser1sp（图2），其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，并克隆到T载体进行测序鉴定。

本发明所使用的转基因骨架载体pBac[3xp3EGFPaf] (Carsten Horn. et al 2000)以及pBac[3xp3Redaf] (Aichun Zhao. et al 2010)是基于鳞翅目昆虫细胞系的杆状病毒的转座子pBac的转基因载体。转基因表达载体的构建过程为：以pSLfa1180fa载体(Carsten Horn. et al 2000)中间载体，将中部丝腺特异表达的丝胶1基因启动子Pser1sp（上游为SalI，下游为BamHI）、红色荧光蛋白基因Red（上游为BamHI，下游为NotI）以及转录中止信号sv40（上游为NotI，下游为HindIII）依次连接至psl1180[afMCSaf]载体上，形成psl1180[Pser1spRedsv40]；在此基础之上，将增强子hr3通过NcoI连接至Pser1sp上游，形成psl1180[hr3Pser1spRedsv40]；随后利用AscI分别将psl1180[Pser1spRedsv40]，psl1180[hr3Pser1spRedsv40]载体中的表达框切下，连接至经同样酶切后的转基因骨架载体pBac[3xp3-EGFPaf]之上，形成pBac[3xp3-EGFP, Pser1spRedsv40]基础丝胶1表达载体（图3），和含增强子hr3的pBac[3xp3-EGFP, hr3Pser1spRedsv40]转基因表达载体（图4）。另外，将启动子Pser1（上游为SalI，下游为BamHI）、实施例2制备的转录激活因子IE 1（上游为BamHI，下游为NotI）以及转录中止信号sv40（上游为NotI，下游为HindIII）依次连接至pSLfa1180fa载体(Carsten Horn. et al 2000)上，形成psl1180[Pser1 IE 1sv40]，随后利用AscI将psl1180[Pser1 IE 1sv40]中的表达框切下，连接至经同样酶切后的转基因骨架载体pBac[3xp3-Redaf]之上，形成pBac[3xp3-Red, Pser1 IE 1sv40]（图5），该转基因表达载体以眼、神经特异启动子3xp3驱动的红色荧光蛋白基因Red作为筛选。

实施例4 转基因家蚕

1 转基因家蚕的制备

本发明利用pHA4PIG(马三垣 等.,2009)作为辅助质粒产生转座酶，利用QIAGEN Plasimd Mini Kit（Qiagen）质粒抽提试剂盒分别提取pBac[3xp3EGFP, Pser1spRedsv40]，pBac[3xp3EGFP, hr3Pser1spRedsv40]，以及pBac[3xp3Red, Pser1 IE 1sv40]质粒分别与pHA4PIG质粒按1∶1摩尔比混合后，参照（家蚕滞育品种的转基因方法，申请号 200910103397.6)中所述的方法进行显微注射。主要步骤为：将混合后的质粒注射已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5 h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35%的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于 25℃，相对湿度85%的环境中孵化，孵化的幼虫(G0代)采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵（第7天）在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10, 日本)下检测，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发绿色荧光和红色荧光的转基因阳性蛾圈，分别命名为SRSV，hSRSV和S IE 1，显微注射与转基因筛选的统计数据（表1）。

2 转基因家蚕的荧光检测

本发明利用hSRSV转基因家蚕的5龄第3天的丝腺为材料，在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10, 日本)下检测红色荧光蛋白表达，结果显示：本发明克隆获得的丝胶1启动子Pser1-sp的驱动下，红色荧光蛋白基因能在家蚕的中部丝腺特异表达（图6）。随后，对hSRSV转基因家蚕的5龄第6天的中部丝腺进行冷冻切片并荧光观察，结果显示：本发明克隆获得的丝胶1启动子Pser1-sp能使红色荧光蛋白表达并分泌至丝胶层中（图7）

3 S IE 1转基因家蚕中IE 1基因的转录检测

以S IE 1转基因家蚕与正常野生型家蚕的五龄第七天的中部丝腺为材料按照Omega RNA抽提试剂盒的标准步骤提取总RNA，并反转录制备cDNA，以IE 1基因的特异引物：F: 5' CGCggatccATGACGCAAATTAATTTTAA  3'，R: 5' ATTTgcggccgcTTAATTAAATTCAA  3'，进行RT-PCR，扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共25个循环，最后72 ℃延伸10 min，以检测S IE 1转基因家蚕中IE 1基因的转录表达，结果显示：与对照相比，S IE 1转基因家蚕中IE 1基因有较高的转录表达（图8）。

4 转录激活因子IE1增强重组RFP表达水平的分子检测

将SRSV，hSRSV和S IE 1的G1代转基因家蚕分别进行饲养，制种时SRSV，hSRSV与正常大造进行回交制种，SIE1与hSRSV转基因家蚕进行杂交制种，在G2代蛹期通过荧光观察筛选具有SRSV，hSRSV和hSRSV+SIE1基因型的家蚕，并从中随机选取10个茧壳，将其剪碎，溶于含20mM Tris-cl，pH 7.9，8M urea的缓冲液中至终浓度为50mg茧壳/ml，之后放入80℃热水浴中处理15min，再12000×g，4℃离心15min收集上清溶液。收集的上清溶液按蛋白浓度BCA标准法进行蛋白浓度测定与定量。将获得的蛋白样品与5×上样缓冲液混合，按照20μg/孔的上样量进行电泳，将蛋白质转移到FDVF膜上，置于含5%脱脂奶粉的TBST中，于4℃过夜封闭，次日，先用TBST洗涤1次，再将膜放入含兔抗RFP（购自Biovision公司）稀释比例1：10000的TBST中，室温摇床孵育1.5h，用TBST洗涤5次，再将膜放入含Hrp标记的羊抗兔二抗（购自碧云天公司），稀释比例 1：20000的TBST中，室温摇床孵育1小时，TBST洗涤5后用ECL-Advance发光检测试剂(购自Amersham公司)盒进行显色。结果显示：SRSV，hSRSV转因家蚕茧壳的蛋白泳道与对照相比在红色荧光蛋白（RFP）分子量大小一致的附近处出现一条明显的差异条带（图9），利用红色荧光蛋白特异抗体进行western blot实验证实差异条带即为重组的红色荧光蛋白，结果说明重组红色荧光蛋白在丝腺成功地表达并能分泌至茧壳中（图10），利用BandScan5.0软件以及Quantity One软件进行密度计算显示hSRSV泳道中重组红色荧光蛋白的含量占茧壳溶出总蛋白量的21.2%，与SRSV泳道中的重组红色荧光蛋白含量3.2%相比提高了约7倍（图9，10）。在此基础上，密度计算显示hSRSV转基因与SIE1转基因杂交之后的茧壳中重组红色荧光蛋白的表达量进一步提高约2.1倍（图11），以上结果说明从重庆株系BmNPV病毒基因组中获得的hr3结合IE1之后，能提高外源基因在转基因家蚕中的表达量，累计达14.7倍。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  西南大学

<120>  转录激活因子IE1

<160>  5

<210>  1

<211>  1755

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  转录激活因子IE1

<400>  1

 

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tttgaattta attaa                                                     1755

 

<210>  2

<211>  584

<212>  PRT

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  转录激活因子IE1

<400>  2

 

Met Thr Gln Ile Asn Phe Asn Ala Ser Tyr Thr Ser Ala Pro Thr

         1                5                  10                  15

         Pro Ser Arg Ala Ser Phe Asp Asn Gly Tyr Ser Glu Phe Cys Asp

                         20                  25                  30

        Lys Gln Gln Pro Asn Asp Tyr Leu Asn Tyr Tyr Asn Asn Pro Thr

                         35                  40                  45

        Pro Asp Gly Ala Asp Thr Val Val Ser Asp Ser Glu Thr Ala Ala

  50                  55                  60

        Ala Ser Asn Phe Leu Ala Ser Val Asn Ser Leu Thr Asp Asp Asn

65                  70                  75

        Asp Ile Met Glu Cys Leu Leu Lys Thr Thr Asp Asn Leu Gly Glu

  80                  85                  90

        Ala Val Ser Ser Ala Tyr Tyr Ser Glu Ser Leu Glu Leu Pro Val

95                 100                 105

        Ala Glu Gln Pro Ser Pro Ser Ser Ala Tyr Asn Ala Glu Ser Phe

 110                 115                 120

        Glu His Pro Val Gly Val Asn Gln Pro Ser Ala Thr Gly Thr Lys

125                 130                 135

        Arg Lys Leu Asp Glu Tyr Leu Asp Asp Ser Gln Ser Val Val Gly

                        140                 145                 150

        Gln Phe Asn Lys Asn Lys Leu Lys Pro Lys Tyr Lys Lys Ser Thr

155                 160                 165

        Ile Gln Ser Cys Ala Thr Leu Glu Gln Thr Ile Asn His Asn Thr

  170                 175                 180

        Asn Ile Cys Thr Val Ala Ser Thr Gln Glu Ile Thr His Tyr Phe

185                 190                 195

        Thr Asn Asp Phe Ala Pro Tyr Leu Met Arg Phe Asp Asp Asn Asp

200                 205                 210

        Tyr Asn Ser Asn Arg Phe Ser Asp His Met Ser Glu Thr Gly Tyr

215                 220                 225

        Tyr Met Phe Val Val Lys Lys Ser Glu Val Lys Ser Phe Glu Ile

230                 235                 240

        Ile Phe Ala Lys Tyr Val Ser Asn Val Val Tyr Glu Tyr Thr Asn

245                 250                 255

        Asn Tyr Tyr Met Val Asp Asn Arg Val Phe Val Val Thr Phe Asp

260                 265                 270

        Lys Ile Arg Phe Met Ile Ser Tyr Asn Leu Val Lys Glu Thr Gly

275                 280                 285

        Ile Glu Ile Pro His Ser Gln Asp Val Cys Asn Asp Glu Thr Ala

290                 295                 300

        Ala Gln Asn Cys Lys Lys Cys His Phe Val Asp Val His His Thr

305                 310                 315

        Phe Lys Ala Ala Leu Thr Ser Tyr Phe Asn Leu Asp Met Tyr Tyr

320                 325                 330

        Ala Gln Thr Thr Phe Val Thr Leu Leu Gln Ser Leu Gly Glu Arg

335                 340                 345

        Lys Cys Gly Phe Leu Leu Ser Lys Leu Tyr Glu Met Tyr Gln Asp

350                 355                 360

        Lys Asn Leu Phe Thr Leu Pro Ile Met Leu Ser Arg Lys Glu Ser

365                 370                 375

        Asn Glu Ile Glu Thr Ala Ser Asn Asn Phe Phe Val Ser Pro Tyr

380                 385                 390

        Val Ser Gln Ile Leu Lys Tyr Ser Glu Ser Val Lys Phe Pro Asp

395                 400                 405

        Asn Pro Pro Asn Lys Tyr Val Val Asp Asn Leu Asn Leu Ile Val

410                 415                 420

        Asn Lys Lys Ser Thr Leu Thr Tyr Lys Tyr Ser Ser Val Ala Asn

425                 430                 435

        Leu Leu Phe Asn Asn Tyr Lys Tyr His Asp Asn Ile Ala Ser Asn

440                 445                 450

        Asn Asn Ala Glu Asn Leu Lys Lys Val Lys Lys Glu Asp Gly Ser

455                 460                 465

        Met His Ile Val Glu Gln Tyr Leu Thr Gln Asn Val Asp Asn Val

470                 475                 480

        Lys Gly His Asn Phe Ile Val Leu Ser Phe Lys Asn Glu Glu Arg

485                 490                 495

        Leu Thr Ile Ala Lys Lys Asn Glu Glu Phe Tyr Trp Ile Ser Gly

500                 505                 510

        Glu Ile Lys Asp Val Asp Ala Ser Gln Val Ile Gln Lys Tyr Asn

515                 520                 525

        Arg Phe Lys His His Met Phe Val Ile Ser Lys Val Asn Arg Arg

530                 535                 540

        Glu Ser Thr Thr Leu His Asn Asn Leu Leu Lys Leu Leu Ala Leu

545                 550                 555

        Ile Leu Gln Gly Leu Val Pro Leu Ser Asp Ala Ile Thr Phe Ala

560                 565                 570

        Glu Gln Lys Leu Asn Cys Lys Tyr Lys Lys Phe Glu Phe Asn

575                 580             584

 

 

<210>  3

<211>  1002

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  增强子Hr3

<400>  3

                                          

cgcgcggatc ttccagagat tcatgccatg gaaaaagaag ccgtgcccag tcacgtgtac      60

gccaacctga acacgcaatc caacgacggc gtcaaataca atcgttggtt gcacgctaaa     120

aatgaccaat acatggcgtg tcctgaagaa ttgtacgata acaacgaatt taaatgtaac     180

gtagaatcgg ataaattata ttatttggat aatttacaag aagattccat tgtataaaca     240

ttttatgtcg aaaacaaatg acatcagctt atgattcata cttaatcgtg cgttacaagt     300

agaattctac tcgtaaagcg agtttaattt ggaaaaacaa attagtcatt attaaacatg     360

ttaacaatcg tgtataaaat gacatcagtt taatgatgac atcatctctt gattatgttt     420

tacacgtaga attctactcg taaagccagt tcagttttga aaaacaaatg acatcatctc     480

ttgattatgt tttacaagta gaattctact cgtaaagccg gttcagtttt gaaaaacaaa     540

tgacatcatc tcttgactgt gttttacacg tagaattcta ctcgcaaagc aagtttagtt     600

ttgaaaaaca aatgacatca ttcagttttg aaaaacaaat gacatcatct cttgattgtg     660

ttttacacgt agaattctgc tcgtaaagcg agtttggttt tgaaaaacaa atgacatcat     720

ttcttaaatt cggttttgaa aaacgaatga catcatcttt tgattgtgtt ttacacgtag     780

aattctactc gtaaagcgag tttggttttg aaaaacaaat gacatcatct cttgattatg     840

ttttacacgt agaattctac tcgtaaagcg agttagtttt aaaaaacaaa tgacatcatc     900

ttagaggtag acccgtcttg gcgacgggtc tgctcatacg tcgttttgta tttgtcattg     960

cctcttttca cgacgctgcc atggcatgaa tcgtcgaacg gc                       1002

 

<210>  4

<211>  678

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  丝胶Ⅰ基因的启动子Pser1sp

<400>  4

gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta      60

ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg     120

tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat aaaagtataa     180

aatacaatca taatagtgta cgaacttaca attccaatta attatagtcg aatttcgact     240

actgcgggac ctctagtatt aataattctc tttaaaaaaa aacagagcat caaatactgc     300

acaaatgtca agcgggtctc aacgagccat gaataaatta gaaatcaatt aataacataa     360

aataggcaaa caaaataaaa ccatttacat agagaacgtt tgttgaacaa aaacaataac     420

ttgtatacat tgtttgcaca aatgtttgaa gcgaaaattt attactctct acgtaagctt     480

gatcaaactt cgttttcgta taaaacgcgt tggcccaacc actttggcat agtcgtctta     540

tcatcgggtc tctaaggatc aagcgatcca aagaccgcca acatgcgttt cgttctgtgc     600

tgcactttga ttgcgttggc tgcgctcagc gtaaaagcct tcggtcacca ccccggcaat     660

cgagatacag gatccatg                                                            678

 

 

 

<210>  5

<211>  553

<212>  DNA

<213>  家蚕（Bombyx Batryticatus）

<220> 

<223>  丝胶Ⅰ基因的启动子Pser1

<400>  5

gaaaacagca cacacactac ataccatgta tttgacgcac acacgcatgt atactattta      60

ttgtcaaact tttgttcttg acgtctgtgt tcaaactgag aatagattaa atattgtttg     120

tctttattaa tattttttaa tagtgtagtc ttggcgaaat ttgtgattat aaaagtataa     180

aatacaatca taatagtgta cgaacttaca attccaatta attatagtcg aatttcgact     240

actgcgggac ctctagtatt aataattctc tttaaaaaaa aacagagcat caaatactgc     300

acaaatgtca agcgggtctc aacgagccat gaataaatta gaaatcaatt aataacataa     360

aataggcaaa caaaataaaa ccatttacat agagaacgtt tgttgaacaa aaacaataac     420

ttgtatacat tgtttgcaca aatgtttgaa gcgaaaattt attactctct acgtaagctt     480

gatcaaactt cgttttcgta taaaacgcgt tggcccaacc actttggcat agtcgtctta     540

tcatcgggtc atg                                                                  553

 

 

Claims (8)

1.转录激活因子IE1，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.转录激活因子IE1的制备方法，其特征在于：以家蚕BmNPV基因组作为模板，设计特异性上游引物F: 5'CGCggatccATGACGCAAATTAATTTTAA3'和下游引物为R:5' ATTTgcggccgcTTAATTAAATTCAA3'，利用PCR扩增，得转录激活因子IE1。

3.根据权利要求2所述的转录激活因子IE1的制备方法，其特征在于：扩增条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72 ℃延伸90秒，共30个循环, 最后72 ℃延伸10 min。

4.含有权利要求1所述转录激活因子IE1的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体含有转录激活因子IE1和终止子SV40，所述转录激活因子IE1下游的NotI酶切位点与终止子SV40上游的NotI酶切位点连接。

6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pBac[3xp3-Red,Pser1IE1sv40]，所述重组载体以pBac[3xp3Redaf]转基因家蚕表达载体为骨架，依次连接以眼神经组织特异启动子3xp3及其驱动的红色荧光蛋白基因Red，如SEQ ID NO:5为核苷酸序列的丝胶I基因启动子，IE1作为目的基因和sv40转录终止子。

7.权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

A 中间载体psl1180[Pser1IE1sv40]的构建

将如SEQ ID NO:5所示的启动子Pser1、如SEQ ID NO:1所示的转录激活因子IE1以及转录中止信号sv40依次连接至pSLfa1180fa载体载体上，形成psl1180[Pser1IE1sv40]；所述启动子Pser1的上游酶切位点为SalI，下游酶切位点为BamHI，所述转录激活因子IE1的上游酶切位点为BamHI，下游酶切位点为NotI，所述转录中止信号sv40的上游酶切位点为NotI，下游酶切位点为HindIII；

 B 重组载体的构建

将步骤A所得的psl1180[Pser1IE1sv40]用AscI酶切后，同经AscI酶切的转基因骨架载体pBac[3xp3-Redaf]的连接，得重组载体pBac[3xp3-Red,Pser1IE1sv40]。

8.权利要求1所述的转录激活因子IE1在家蚕中制备重组外源蛋白的应用。

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