CN102516397B - 一种白细胞介素-17受体阻断剂及其在制备抗心肌纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白细胞介素-17(IL-17)受体阻断剂，其特征在于所述的阻断剂为一多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示的序列以及SEQ ID NO.2所示的序列通过柔性连接序列相连得到，连接顺序从氮端到碳端依次为SEQ ID NO.1所示的序列、连接序列以及SEQ ID NO.2所示的序列。本发明以特异性存在于IL-17受体的IL-17RA PLAD与IgG Fc段组成可溶性融合蛋白，二者以柔性连接蛋白Linker连接，不影响蛋白质二级结构，并且可针对Ig进行分离提纯。以此封闭IL-17RAPLAD，抑制受体寡聚化。具有特异性强、阻断效率高等优势。

Description

一种白细胞介素-17受体阻断剂及其在制备抗心肌纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种受体拮抗剂及其在制备药物中的应用，尤其涉及一种白介素-17(IL-17)受体拮抗剂及其在制备抗心肌纤维化药物中的应用。属于生物医学技术领域。

背景技术

全世界范围内最新的死亡原因分析中，心血管疾病位列前三，严重地威胁着人类的生命和健康。心力衰竭(heart failure，简称心衰)作为各种心脏疾患发展的最终阶段，正在成为本世纪最重要的心血管致死原因。流行病学资料显示，目前全球心衰患者的数量已高达2250万，且仍以每年200万的速度递增，5年存活率与恶性肿瘤相仿，已成为世界范围内的主要公共卫生问题。

以往研究的焦点主要集中于心肌细胞结构和功能异常的预防和逆转，但近年来人们逐渐认识到，心肌纤维化在心力衰竭的发生和发展中起有十分重要的作用，因而已成为心力衰竭治疗的一个新靶标。心肌纤维化(myocardial fibrosis)，又称为心肌重构，是由中～重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄引起心肌纤维持续性和(或)反复加重的心肌缺血缺氧所产生的结果，导致逐渐发展为心力衰竭的IHD，即慢性缺血性心脏病(chronic ischemic heart disease)。

IL-17是新近引起注意的炎症性细胞因子家族重要成员，其功能尚未完全阐明。IL-17由激活的Th17细胞产生。Th17细胞主要作用于成纤维细胞等间充质细胞，诱导细胞因子和MMPs等表达。IL-17是新近发现的新型辅助性T淋巴细胞(Th)-Th17的效应因子，已被证实参与多种疾病的发生、发展。如果能够从受体水平阻断IL-17R信号转导通路，必将显著降低炎症性细胞因子所导致的致死和致残率。然而，由于anti-IL-17R的抗体与IL-17结合力较弱，加之作用广泛、全身副作用较大，无法应用于临床等缺陷，限制了其作为IL-17信号拮抗剂的药物研发。国外的某些研究制成与IL-17R结合的肽段来阻断IL-17信号，缺陷在于这类肽段C末端不稳定，不利于肽段分子构象的维持，造成生物学不稳定。因此，临床上亟待一种与IL-17R特异性结合、副作用小的IL-17R阻断剂的出现。

本发明人探讨了Th17细胞的效应子IL-17，对于心肌纤维化的作用。结果显示：在体外培养的心肌成纤维细胞中，IL-17以剂量依赖性方式促进胶原和MMPs的产生，阻断IL-17受体，则显著减轻心衰和心肌纤维化。IL-17信号转导通过膜受体IL-17RA进行传导，IL-17RA结构示意图如图2所示，细胞因子受体发挥功能的前提是受体亚单位寡聚化(预装配)，这是受体激活共同通路(图1所示)，而配体组装前结构域(pre-ligand assembly domain，PLAD)是受体寡聚化的结构基础，PLAD的发现使选择性抑制细胞因子受体，阻断信号转导成为可能。

因此本发明人设想：如果封闭IL-17RA PLAD，抑制受体寡聚化，从源头上阻断IL-17信号转导，对抑制IL-17信号介导性心肌纤维化将是效率最高的。基于此，我们构建了表达IL-17RA PLAD可溶蛋白的病毒载体，以阻断IL-17信号介导性疾病。

本发明是以IL-17RA PLAD与IgG Fc段的可溶性融合蛋白封闭IL-17RA PLAD，抑制受体寡聚化。在“配体-受体-受体后信号通路”的源头上阻断受体信号，符合“生物体能量消耗最小化”原则。

发明内容

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种能够特异性阻断IL-17RA PLAD的融合蛋白。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术手段实现的：

既往研究表明，IL-17RA由2个FN[FN1(第69-183氨基酸残基)和FN2，即PLAD(第205-282氨基酸残基)]结构域通过一无结构性linker(第184-204氨基酸残基)结合。本发明的技术方案是在GenBank检索人IL-17RA、IgG Fc段mRNA序列(序列号为NM_014339和AJ_294731)确定扩增区域，其中IL-17RA FN1结构域为第69～183氨基酸残基；PLAD结构域为第205～282氨基酸残基；中间第184～204氨基酸为天然linker；利用引物设计软件设计IL-17RA FN2，IgG Fc引物，核酸和蛋白质序列分析软件EditSeq^TM对融合基因及Linker部位翻译后二级结构的生物学特性，如柔性、抗原性、亲水性及表位等预测分析，证明设计合理(图3所示)。当然，上述所得结论仅是理论上的推测，所选用软件也存在一定局限，最终结论应从下一步在体或离体实验中获得。

通过大量实验，本发明得到了一种白细胞介素-17受体阻断剂(命名为IL-17RAPLAD-Ig)，其特征在于所述的阻断剂为一多肽，所述多肽的氨基酸序列由SEQ IDNO.1所示的序列以及SEQ ID NO.2所示的序列通过柔性连接序列相连得到，连接顺序从氮端到碳端依次为SEQ ID NO.1所示的序列、连接序列以及SEQ ID NO.2所示的序列；或

由SEQ ID NO：1及/或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有同样功能的蛋白衍生物通过柔性连接序列相连得到，连接顺序从氮端到碳端依次为SEQ ID NO.1所示序列的蛋白衍生物、连接序列以及SEQ ID NO.2所示的序列的蛋白衍生物。

需要说明的是，蛋白质的功能是由氨基酸序列所决定的，但是并不是说一个或几个氨基酸的替换、缺失或插入都必将影响该蛋白质的功能，这一点是本领域技术人员所公知的。在本发明提供的氨基酸序列的基础上本领域技术人员可以通过保守方式替换所述序列的氨基酸而方便地获得本发明蛋白的多种衍生物。例如，可用其他疏水性氨基酸替换序列中的疏水性氨基酸，或用其他芳香族氨基酸替换序列中的芳香族氨基酸或用其他碱性氨基酸替换序列中的碱性氨基酸等，当然也可通过缺失或插入的方式删除或增加几个或多个氨基酸，只要该获得的蛋白仍具有与本发明所述的蛋白相同的功能则都应该包括在本发明所要求的保护范围之内。其中所述功能是指经过一个或几个氨基酸的替换、缺失或插入后得到的蛋白质其仍然具有与白细胞介素-17受体结合的能力或能够赋予该蛋白可溶性的能力，而不论这种结合能力或可溶性能力强弱大小发生怎样的变化，都应视为仍具有与本发明所述的蛋白相同的功能。

在本发明的一个具体实施例中，所述的连接序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一个具体实施例中，所述的白细胞介素-17受体阻断剂其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了编码以上所述的白细胞介素-17受体阻断剂的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种表达载体，其特征在于所述的载体含有以上所述的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施例中，所述的表达载体为病毒载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于含有以上所述的表达载体。

本发明还提供了所述的白细胞介素-17受体阻断剂在制备抗心肌纤维化药物中的应用。及

所述的核苷酸序列在在制备抗心肌纤维化药物中的应用。

根据IL-17RA结构域序列，图2所示，SEFIR结构域位于IL-17RA第379-536氨基酸，据此推算编码SEFIR结构域mRNA序列位于1137-1508碱基，设计引物以IL-17RA cDNA为模版进行Realtime RT-PCR，定量分析SEFIR结构域表达变化。

本发明以特异性存在于IL-17受体的IL-17RA PLAD与IgG Fc段组成可溶性融合蛋白，二者以柔性连接蛋白Linker连接，不影响蛋白质二级结构，并且可针对Ig进行分离提纯，以此封闭IL-17RA PLAD，抑制受体寡聚化。因此，本发明的融合蛋白具有特异性强、阻断效率高等优势。

附图说明

图1为IL-17RA信号传导途径示意图；

中间为预装配的IL-17RA，左箭头示：配体IL-17A与IL-17RA结合后诱导信号传递；右箭头示：可溶性IL-17R PLAD与受体亚单位结合，抑制寡聚化，阻断IL-17受体信号转导；

图2为IL-17RA结构域序列示意图；

图3为利用核酸和蛋白质序列分析软件EditSeqTM对IL-17RA PLAD-IgG的柔性、抗原性、亲水性及表位进行预测性分析；

图4为pLenO-DCE载体图谱；

图5为pUC57-PI载体酶切鉴定结果；

图6为病毒感染293T细胞48小时后荧光显微镜下观察结果；

图6A-6D对应的感染的病毒的量依次为10ul、1ul、0.1ul、0.01ul；

图7为流式细胞仪检测病毒的滴度结果；

图8为MOI为2的IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染的细胞组分别在明场及荧光下的显微镜照片；

图9为MOI为5的IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染的细胞组分别在明场及荧光下的显微镜照片；

图10为Western Blot结果；

1为293T空细胞组；

2为IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染293T细胞组一，MOI为2

3为IL-17RAPLAD-Ig慢病毒感染293T细胞组二，MOI为5

图11A为转化28小时后的大鼠不同组织中的IL-17RA PLAD-Ig mRNA的表达情况；

图11B为IL-17RA PLAD-Ig在大鼠不同组织部位的表达情况；

1：心脏，2肝脏，3：肾，4：脾，5：肺^*P＜0.05与GFP和对照组

图12为组织学分析结果；

图12A-C分别为对照组组织切片、IL-17RA PLAD-Ig组织切片、GFP组组织切片用苏木精和曙红(H&E)进行染色分析，40倍显微镜下，观察除冠状血管及血管外周组织外的受炎症影响的区域与分类排列区域的比值。图12D-E分别为对照组组织切片、IL-17RA PLAD-Ig组组织切片、GFP组组织切片用苦味酸天狼猩红(PSR)进行染色的结果。图12G为对在用苏木精和曙红(H&E)进行染色后观察的纤维化影响的区域统计；图12H为用苦味酸天狼猩红(PSR)进行染色后的测定的相对光密度值；

图13为MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2，I型和Ⅲ型胶原蛋白在左心室组织中的表达。图13A为MMP-2和MMP-9的western bloting分析结果；图13B为TIMP-1和TIMP-2的western bloting分析结果；图13C为I型和Ⅲ型胶原蛋白的western bloting分析结果；图13D为MMPs与TIMPs的表达比率；图13E为MMP、TIMP和胶原蛋白的表达结果；①MMP；②TIMP；③胶原蛋白；④β-肌动蛋白。以平均值±S.E.M表示.^*P＜0.05与其他两组；

图14为MMP-2，MMP-9的活性分析结果；

图15为mRNA的稳定性分析。在含有(+)或不含有(-)IL-17RA PLAD-Ig慢病毒的情况下，用TNF-α(20毫微克/毫升)和IL-17A(200毫微克/毫升)处理培养的CFs；加入放线菌素D(5μg/mL)进一步抑制RNA转录；与放线菌素D孵育0，6，12和18小时后提取总RNA，通过RT-PCR对MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2和胶原蛋白(I型和III型)mRNA的表达进行了量化。图15A和图15B是Ⅰ型和III型胶原蛋白的RT-PCR结果；图15C，图15D，图15E和图15F分别显示MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2的RT-PCR结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1IL-17RA PLAD-IgG慢病毒载体构建

慢病毒载体构建及包装由上海英为信生物科技有限公司协助完成。

1、实验试剂和耗材

1)载体：pLenO-DCE，载体图谱如图4所示

2)T4DNA ligase：NEB

3)限制性内切酶：NEB

4)凝胶回收试剂盒：Axygen

5)PCR(酶切)产物纯化试剂盒：Axygen

6)热敏磷酸酶：NEB

7)RNA提取试剂盒：Axygen

8)MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit：BBI

9)DL2,000DNA Marker：TaKaRa

10)电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司

11)恒温摇床：上海苏坤实业有限公司

12)电热恒温水浴锅：上海康路实验仪器有限公司

13)电泳仪：天能科学仪器

14)数码凝胶处理系统：天能科学仪器

2、实验步骤和方法

2.1、IL-17RA PLAD IgG(简称PI)融合蛋白基因序列的合成

在GenBank检索人IL-17RA、IgG Fc段mRNA序列(序列号为NM_014339和AJ_294731)确定合成区域，其中IL-17RA FN1结构域为第69～183氨基酸残基；PLAD结构域为第205～282氨基酸残基；中间第184～204氨基酸为天然linker；核酸和蛋白质序列分析软件EditSeqTM对融合基因及Linker部位翻译后二级结构的生物学特性，如柔性、抗原性、亲水性及表位等进行预测分析，以验证设计的合理性。

应用可溶性融合蛋白制作方法，设计IL-17RA PLAD与IgG Fc段连接4种方式：(a)IL-17RA PLAD-IgG、(b)IgG-IL-17RA PLAD和(c)IL-17RA PLAD-柔性Linker-IgG、(d)IgG-柔性Linker-IL-17RA PLAD。利用计算机蛋白质二级结构预测分析软件EditSeqTM，确定连接蛋白设计最佳方案。

通过上述预测分析，确定了如SEQ ID NO.5所示的序列，其中1-237位为IL-17RAPLAD的合成片段，238-306位为柔性连接，307-978位为IgG Fc片段，通过全基因合成的方法合成了两端带有酶切位点的含有SEQ ID NO.5所示序列的片段。上游引物选用BamH Ⅰ，下游引物选用Sal Ⅰ。全基因组由金斯特生物技术公司合成。

2.2pLenO-DCE-PI载体的构建

pLenO-DCE载体用BamH Ⅰ及Sal Ⅰ酶切后，按照凝胶回收试剂盒说明书操作，回收载体片段，将载体片段与合成的IL-17RA PLAD-IgG(PI)融合蛋白基因序列连接，酶切鉴定正确，用于接下来的构建工作。

2.3pUC57-PI载体的构建

pUC57载体与pLenO-DCE-PI载体用EcoRV酶切后，分别回收pUC57载体片段及IL-17RA PLAD-IgG(PI)融合蛋白基因片段，将回收的片段连接，得到的重组载体进行测序分析及酶切鉴定，测序引物为：CACGCTGTTTTGACCTCCATAGA测序结果比对后完全正确。BamH Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切鉴定结果如图5所示。结果：载体构建正确。大量制备该载体备用。

2.4、IL-17RA PLAD-IgG慢病毒载体包装：

2.4.1材料：

1.材料采用慢病毒的包装细胞293T细胞株(ATCC)

2.大肠杆菌菌株DH5α，DMEM，胎牛血清、胰蛋白酶(Invotrogen公司)

3.慢病毒载体系统(Tronolab公司[url]www.tronolab.com/lentivectors.php[/url])该病毒包装系统由pRsv-REV，plg-RRE，pMD2G，pPGK-Linker四质粒组成，其中pPGK-Linker含有多克隆位点的穿梭质粒.pRsv-REV，plg-RRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件。

4.大量质粒DNA提取试剂盒(Qiagen公司)

2.4.2步骤：

慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，细胞密度为0.5×10⁹/L时，重新接种于25mL的15cm细胞培养皿，37℃，50mL/L CO2培养箱内培养，细胞密度达60％～70％时转染.制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液(pRsv-REV 10μg，plg-RRE 15μg，pMD2G 7.5μg，pPGK-Swi 20ug)，无菌水定容至1800μL，再加入CaCl₂(2.5mol/L)溶液200μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000μL，室温放置20～30min.将DNA磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次.然后每瓶细胞中加入含100mL/L小牛血清的细胞培养液15mL，继续培养48h.收集转染72h的293T细胞上清液.于4℃，4000g离心10min；以0.45μm滤器过滤后置于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min；而后以冰PBS液重旋病毒沉淀，于4℃溶解过夜.次日，以10μL每管分装病毒液置于-70℃冰箱中保存.

测定病毒滴度后感染体外培养心肌成纤维细胞；以表达绿色荧光蛋白的pLenti6.2-GW/EmGFP慢病毒作对照。

2.4.3IL-17plad慢病毒表达载体构建包装纯化-滴度测定

2.4.3.1慢病毒载体滴度测定

病毒滴度测定

使用逐孔稀释滴度测定法：

1.测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，每个96孔中加4×10⁴个细胞，体积为100μl。

2.根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的新鲜培养基。

3.取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

4.选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。

5.24小时后，加入新鲜培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。

6.4天后，观察细胞生长状况，并收取细胞进行后续滴度测定。

10ul、1ul、0.1ul、0.01ul病毒感染293T细胞48小时，荧光显微镜下的结果如图6所示。

FACS(流式细胞检测)方法检测病毒的滴度，实验的操作步骤如下：

On day 0：在24孔板接种三孔293T细胞(每孔3-5×10⁴cells)；

On day 1：细胞计数，每孔需有细胞约6-8×10⁴cells；取浓缩的病毒液体1μl(或者未浓缩的病毒50μl)作为第一个浓度，并依次稀释成3到4个稀释度(倍比稀释1∶100)，每个稀释度的总体积为100μl；

On day 2：去除培养基换500μl新鲜培养基；

On day 3：使用无钙PBS缓冲液冲洗细胞，37℃用胰酶消化细胞一分钟，加入250μl含有2％(w/v)formaldehyde的无钙PBS，将细胞完全重悬浮，使用流式细胞仪(FACS)检测分析GFP阳性表达细胞。取其中GFP阳性率为10-50％一孔细胞进行滴度计算。0.01μl病毒感染293T细胞48小时，流式细胞仪检测的结果如图7所示。

根据流式细胞仪检测结果计算滴度公式：

Titer(293T-transducing units/ml)＝100000(target cells)×(％of GFP-positivecells/100)/volume of supernatant(in ml).

本次病毒制备的滴度为3.4×10⁸TU/ml

2.5Western blot检测IL-17RA PLAD-Ig表达

实验设计：

靶细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，每孔样品排列如下所示。

1：“空白对照”为正常目的细胞组(293T)；

2：“过表达组一”为IL-17RA PLAD慢病毒感染的细胞组(293T)，MOI为2；

3：“过表达组二”为IL-17RA PLAD慢病毒感染的细胞组(293T)，MOI为5

实验步骤

2.5.1.293T细胞的培养

2.5.1.1细胞复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管迅速放入37℃水浴锅中，并不时摇动使其尽快解冻，70％酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台，吸出细胞悬液至含有3ml含10％胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶，置于37℃5％CO2培养箱培养，次日更换一次培养液后再继续培养。

2.5.1.2细胞传代：将生长90％汇合的细胞进行传代，弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液，加入2ml胰酶消化液，消化约1-2min直到细胞完全消化下来，加入含10％胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来，混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。

2.5.2.IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染293T细胞

2.5.2.1细胞悬液制备：处于对数生长期的靶细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液，取10μl上述细胞悬液，与等体积0.4％的台盼兰溶液混合，数分钟后，用血球计数板计数细胞。不着色为活细胞，着色为死细胞，根据需要制备成相应浓度的细胞悬液。

2.5.2.2IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染靶细胞

将细胞悬液接种于6-well中，37℃5％CO2培养箱培养待细胞融合度达30～40％，根据不同的MOI值，加入适宜量的病毒，IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染目的细胞24h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养48h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，马上更换培养基，感染4-5天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率大于70％者继续培养，然后收集细胞蛋白进行Western Blot检测实验；感染效率低于70％的实验组，重新进行感染实验。过表达组一照片(明场和荧光)如图8所示，过表达组二照片(明场和荧光)如图9所示。

3、Western Blot检测IL-17RA PLAD-Ig表达水平

3.1.总蛋白抽提：从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，冰上PBS洗涤2次。弃去PBS，加入适量预冷的1×Lysis Buffer(无溴酚蓝)和50μl 10mg/ml PMSF，细胞刮刮下细胞，冰上裂解细胞10～15min，将样品转移入Ep管中，超声破碎仪破碎细胞，4℃，12000g，离心10min，取上清液，-80℃冻存24hr，4℃12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1％(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。测蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2μg/μl，-80℃保存备用。

3.2.蛋白定量：

根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40μg，测蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2μg/μl，-80℃保存备用。

3.3.上样样品准备

每个样品取相同总蛋白量，根据要求加入相应的6×loading buffer上样缓冲液3.2振荡器混匀后，100℃煮5-10min，4℃存放备用。

4.SDS-PAGE电泳

配制5％(浓缩胶)-10％(分离胶)进行SDS-PAGE电泳分离。

5.转膜及检测

将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质经半干转移至PVDF膜上。

5.1去除浓缩胶和多余的分离胶，用直尺测量余下的分离胶面积，将其在Transfer Buffer中平衡15分钟。

5.2将Mylar Mask挖洞，其面积稍微小于胶面积(约每边小2mm)。

5.3切至少6张Blotting Paper，与凝胶同样大小或稍微小于凝胶，用transferbuffer饱和。

5.4将PVDF膜切至与凝胶同样大小或稍微小于凝胶，用甲醇预湿，然后在transfer buffer中浸泡2～5分钟。

5.5将三张湿的Blotting Paper放在Mylar Mask上对准所挖的洞，周边叠在Mask上，然后在其上面放置湿的PVDF膜，对齐。

5.6将平衡好的凝胶小心地放在PVDF膜上，四周对齐(最好一次放到位)，其上再放置三张湿的Blotting Paper。

5.7盖上电泳槽的盖子，插好电源，用0.8mA/cm²的电流强度电泳1～1.5小时。

5.8封闭：将膜转移至另一容器中，PVDF膜用3％明胶封闭(常温，低温下明胶会凝结)或3％BSA(可低温)，PVDF膜用5％脱脂奶粉室温封闭1hr或者4℃过夜。

5.9一抗孵育：用封闭液将17PLAD抗体(本实验室保存。)稀释成0.1μg/ml，按膜面积0.1ml/cm²的量加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口，室温平缓摇动1小时或4℃过夜。

5.10洗膜：TBST洗涤3次，每次10min。

5.11二抗孵育：碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体用封闭液以1∶1000稀释，按膜面积0.1ml/cm²的量加入塑料袋，放入PVDF膜，赶走气泡，用封口机封口室温孵育1hr。

洗膜：TBST洗涤3次，每次10min。

5.13将PVDF膜放入检测缓冲液中平衡5分钟。

5.14稀释显色底物：每1ml检测缓冲液中加入4.5μl底物9及3.5μl底物10。

5.15按膜面积0.1ml/cm²的量加入玻璃平皿中，放入PVDF膜；取出PVDF膜，去尽残液，ECL(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences，Boston，MA，USA)底物反应1min，压片，显影，定影。

5.16弃去显色液，将膜用TE洗涤2次，在TE中浸泡。

5.17扫描及分析

6.Western Blot结果

如图10所示。

1为293T空细胞组；

2为IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染293T细胞组一，MOI为2；

3为IL-17RAPLAD-Ig慢病毒感染293T细胞组二，MOI为5。

上图结果显示：IL-17RA PLAD-Ig慢病毒感染组有显著增强表达作用，MOI值越高增强表达越明显。

实施例2IL-17RA PLAD-Ig在抗心肌纤维化中的作用

1、肌凝蛋白诱导的大鼠心肌炎模型的建立

材料：6周龄雄性Lewis大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；纯化的猪源心脏肌凝蛋白购自sigma公司。

方法：0.01M的PBS以及添加有10mg/ml结核分支杆菌H37RA(Mycobacteriumtuberculosis H37RA)的完全弗氏佐剂按照体积比为1∶1混合，混合后的溶液溶解纯化的猪源心脏肌凝蛋白(porcine cardiac myosin，购自Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA)，得到免疫乳剂用于大鼠的免疫。每只大鼠在第0天和第7天从脚垫采用单皮下注射的方法注射0.2ml上述制备得到的乳剂。免疫后的大鼠分为两组：IL-17RAPLAD-Ig组(n＝13)，在第7天经尾部注射混合有IL-17RA PLAD-Ig慢病毒的超声微泡剂；GFP组(n＝8)：在第7天经尾部注射混合有GFP慢病毒的超声微泡剂。8只既不注射免疫制剂也不注射微泡剂的大鼠作为正常对照。

基因转入后48小时，从IL-17RAPLAD-Ig组中随机取出5只大鼠无痛致死，分别从心脏、肝脏、肾脏、脾以及肺组织中提取RNA，通过以下引物进行RT-PCR来评估IL-17RA PLAD-Ig在不同组织中的侵染效率，引物序列如下所示：

上游：5’-GTC GCC ACC AAG TGC AGA GA-3’；

下游：5’-GCC GTC CAC GTA CCA GTT GA-3’

RT-PCR检测结果如图11所示。从结果可以看出IL-17RA PLAD-Ig在心脏中的表达水平最高。

2、超声心动检测

注射后35天对上述大鼠进行超声心动检测，检测前，通过肌肉向大鼠体内注射增补有1mg/kg的乙酰丙嗪的40mg/kg的克他命(ketamine)麻醉大鼠，使用仪器HPSonos 2500(Hewlett-Packard Co.)并结合使用一个10-MHz的成像线性扫描传感器对大鼠左室舒张末内径(LVEDd)，收缩末期直径(LVEDs)，舒张期室间隔厚度(IVSTd)和舒张期后壁厚度(PWTd)进行了评估。超声心动图通过装配有7.5-MHz传感器的Sequoia C256心动超生检测系统进行分析，检测结果如表1所示：

表1超声心动检测结果

^*P＜0.05vs.GFP组。

从结果中可以看出三组之间LVEDs没有什么区别。这些结果表明，IL-17RAPLAD-Ig能够阻止左心室重构和心肌炎引起的心脏衰竭的发展。

3、心脏肥大及间质纤维化的测定

取超声心动检测后的所有大鼠的左心室组织用4％多聚甲醛固定后制成石蜡包埋的组织切片，用苏木精和曙红(H&E)进行染色分析，40倍显微镜下，观察除冠状血管及血管外周组织外的受炎症影响的区域与分类排列区域的比值。第二组组织切片用苦味酸天狼猩红(PSR)进行染色(Constantine and Mowry et al.)，颜色深浅的变化表示纤维化的程度。结果如图12所示。在GFP免疫大鼠的心脏组织中，观察到了严重的炎性病变，在显微镜下观察到大范围的心肌坏死和单核细胞，包括心室壁心外膜层的巨细胞渗透。35天的时候，大量的成纤维细胞(CFs)出现在间质区，相反IL-17RA PLAD-Ig处理的大鼠心脏则表现出很少的炎性渗透。

使用偏振光显微技术，胶原蛋白表现出亮橘红色。光密度值通过病理学家的盲法分析而量化，结果如图12所示，证明IL-17RA PLAD-Ig的处理可明显地抑制炎症诱导的心脏纤维化。

4、Western blot分析

MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2是心脏纤维化中最重要的调节因子。提取大鼠的左心室组织蛋白用于Western blot分析，具体方法如前所述，分别用抗MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2，胶原蛋白I以及胶原蛋白III的特异性抗体进行孵育来检测相关蛋白的表达。结果发现与IL-17RA PLAD-Ig及对照组相比，GFP组中MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2以及胶原蛋白的表达量显著上升，如图13所示。升高的MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2表达水平在用IL-17RA PLAD-Ig处理后显著的降低。

I型和III型的胶原蛋白是心脏组织中基本的基质分子，本发明对胶原蛋白进行了测定而非粘多糖、蛋白聚糖和其他结构蛋白。IL-17RA PLAD组中I型和Ⅲ型胶原均有减少。

5、通过酶谱法(zymography)检测MMP-2，MMP-9的活性

通过酶谱法(zymography)检测MMP-2，MMP-9的活性，显示了酶原的白明胶酶活性，成熟的MMPs酶谱图通过扫描密度计量学数字化和定量。

MMP-2，MMP-9的活性以任一单位的每10ng蛋白计算，结果如图14所示，与GFP组相比，IL-17RA PLAD组中MMP-2，MMP-9的活性显著的降低了。

6、mRNA稳定性分析

IL-17能够与TNF-alpha在不同细胞系中的一些靶基因上通过共同作用的方式诱导协同效应。IL-17或TNF-alpha单独使用只能抑制靶基因的表达。而TNF-alpha/IL-17的联合刺激则会导致基因表达的增强。因此，在这项研究中，我们对培养的心肌成纤维细胞使用TNF-<alpha>与IL-17A进行联合处理，而不是单独使用任何一种细胞因子。在MMPs，TIMPs和胶原蛋白mRNA的稳定性试验中，培养的CFs用TNF-alpha(20ng/mL)以及IL-17A(200ng/mL)进行处理，在含有(+)或不含有(-)L-17RA PLAD-Ig慢病毒的情况下作用6小时。培养后的细胞，与放线菌素D(5μg/mL)孵育进一步抑制RNA的转录。用放线菌素D孵育0，6，12和18小时后提取总RNA。对MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2和胶原蛋白(I型和III型)mRNA的表达通过RT-PCR技术进行量化。结果以作用6h后，12小时或18小时后剩余的mRNA与总mRNA的百分比表示(6小时，12小时或18小时后的mRNA/0H mRNA)。

结果如图15所示，结果表明，IL-17增加胶原蛋白mRNA的稳定性和MMPs/TIMPs(特别是TIMP-1，TIMP-2)mRNA在CFS中的稳定性。IL-17RAPLAD-Ig处理后显著加速了胶原蛋白和MMPs/TIMPs mRNA降解。在转录抑制发生18小时后，I型和III型胶原蛋白，TIMPs和MMPs的mRNA的表达是最小的。当IL-17/IL-17RA信号被IL-17RA PLAD-Ig融合蛋白所阻断后，细胞因子诱导的胶原蛋白积累减少(图15)。

7、统计学分析

正态分布数据以平均值±SEM表示。通过单向方差分析(ANOVA)，对组与组之间的统计差异进行了比较。采用SPSS 13.0进行统计分析。P＜0.05的差异被认为是具有统计差异显著性。

8、总结

在发明中，使用超声微泡技术将IL-17RA PLAD-Ig慢病毒转入生物体内，我们证明，IL-17RA PLAD-Ig慢病毒能够减轻炎症诱导的心肌纤维化。结果表明，IL-17RAPLAD-Ig慢病毒基因疗法能够抑制体内炎症介导的自身免疫性心肌纤维化，并且能够抑制培养的CFs中胶原蛋白的产生。潜在的机制在于IL-17RA影响MMPs/TIMPs的平衡。与这一结果一致，在体外研究中我们发现的MMPs和TIMPs mRNA的稳定性下降是由IL-17RA PLAD-Ig慢病毒引起的。

综合以上结果，证明了通过本发明构建表达的可溶性融合蛋白IL-17RAPLAD-Ig能够抑制炎症诱导的心肌纤维化。

Claims (8)

1.一种白细胞介素-17受体阻断剂，其特征在于所述的阻断剂为一多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.编码权利要求1所述的白细胞介素-17受体阻断剂的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在所述的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

4.一种表达载体，其特征在于所述的载体含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为病毒载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4或5所述的表达载体。

7.权利要求1所述的白细胞介素-17受体阻断剂在制备抗心肌纤维化药物中的应用。

8.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备抗心肌纤维化药物中的应用。

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