CN102503875A

CN102503875A - 一种检测铜离子的荧光探针及其制备方法

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Publication number: CN102503875A
Application number: CN2011103723757A
Authority: CN
Inventors: 郑洪�; 吴聪; 蔡鑫
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: CN102503875B

Abstract

一种检测铜离子的荧光探针及其制备方法，涉及一种荧光分子探针。所述荧光探针为丹磺酰基与具有荧光猝灭功能的猝灭剂的共价结合体。先制备4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸甲酯，再制备4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺，然后制备4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺异硫氰酸酯，最后制备检测铜离子的荧光探针。检测铜离子的荧光探针应用于中性条件下水溶液中铜离子的荧光检测。探针的Stokes位移大，散射光干扰小，信噪比大；探针在铜离子与其它多种金属离子共存体系中，表现出抗干扰能力强的特点，选择性高；具有较高的水相中铜离子测定灵敏度。

Description

一种检测铜离子的荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种荧光分子探针，尤其是涉及一种检测铜离子的荧光探针及其制备方法。

背景技术

铜广泛应用于电器、电子工业，也应用于如铸币、各种合金铸造及供水管道中。而铜离子是生命系统中的一种重要的微量元素，它对于生物体中血红蛋白的合成及多种金属酶的活性保持是不可或缺的，铜离子的缺乏将导致生长和代谢的紊乱。铜离子在细胞中的含量失去平衡将导致抑制神经性疾病，如Wilson病、家族遗传性脊侧索硬化症、Menkes综合症、Alzheimers症和Prion病等。正是由于铜离子对于生命的重要性，故环境体系与生命体系中的铜离子含量的测定具有重要意义。

现有测定铜离子的方法主要是原子吸收光谱法以及分光光度法，但前者需要相对复杂的仪器及熟练的技术人员才能得到可靠的分析结果，检测费用高昂；而后者也需要繁琐的操作(如化学转化、掩蔽、分离、萃取等消除干扰的预处理过程)，这显然不符合现代环境监测所要求的快速现场评价的要求。基于此，现代分析化学已发展出一类新颖的检测试剂，即所谓的化学传感器(chemosensor)(参见文献：de Silva A.P，Gunaratne H.Q.N，GunnlaugssonT.，Huxley A.J.M.，McCoy C.P.，Rademacher J.T.，Rice T.E.Chem.Rev.1997，97：1515-1566.)能够较好地满足以上几个要求。化学传感器指的是具有分子尺寸的、在与被分析物相互作用时能够给出实时信号的一种化合物分子。化学传感器具有携带方便、费用低、对于待测物种选择性高、不需要样品预处理、不受外界电磁场的影响、可现场显示或可远距离传输信号等优点，因此受到人们的青睐。近几年来，设计和使用化学传感器来检测重金属离子逐渐成为一个新兴的研究热点。化学传感器自身对待测物种具有高度特异性的响应，也即具有高度的选择性，因而在测定时可免除繁琐的样品预处理(如分离、掩蔽、萃取)过程；而其中的一种，即荧光化学传感器(fluorescent chemosensor)能把这种响应转化为直观的荧光信号变化，这不仅可减少复杂仪器的使用及对相关检测人员的技术熟练程度的依赖，而且显著简化了检测程序及降低了检测成本。

丹磺酰基(Dansyl)类荧光染料由于其具有较大的Stokes位移，能够有效地减小测定中散射光的影响，以及具有较大的荧光量子产率，已作为经典的荧光标记物在生物技术方面有广泛的应用。然而把它作为识别铜离子的荧光传感分子，还不多见(Chem.Commun.，2003，3026-3027)，且该法需借助于硅纳米颗粒的协同作用，方法繁琐，灵敏度不高。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种识别性较好的检测铜离子的荧光探针及其制备方法。

本发明的另一目的是提供一种所述检测铜离子的荧光探针在重金属离子检测中的应用。

所述检测铜离子的荧光探针为丹磺酰基与具有荧光猝灭功能的猝灭剂的共价结合体，所述检测铜离子的荧光探针的结构式如下所示：

所述检测铜离子的荧光探针记为探针1，所述检测铜离子的荧光探针与铜离子作用后，丹磺酰基与猝灭剂断开，从而导致检测体系荧光的增强。

所述检测铜离子的荧光探针的制备路线如下：

所述检测铜离子的荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤一：在反应容器中，按质量比加入1份的4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸及10份重蒸甲醇，再加入2份氯化亚讽，先室温反应，再加热回流；冷却，旋干甲醇，再加入饱和食盐水，然后各以20份乙酸乙酯萃取两次；有机层以无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸甲酯；

步骤二：在反应容器中，按质量比加入1份的4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸甲酯及10份乙二胺，加热反应后，冷却；旋转蒸发除掉乙二胺，再加入饱和食盐水，然后用二氯甲烷萃取，有机层以饱和食盐水清洗，所得有机相用无水硫酸钠干燥后旋干溶剂，得4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺；

步骤三：在反应容器中，按质量比加入1份的硫光气，以20份干燥的二氯甲烷稀释；称取0.8份的4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺于另一反应容器中，以50份干燥的二氯甲烷溶解后，在冰浴下加入稀释后的硫光气溶液中，再加入0.5份氢氧化钠；室温反应后，再分别加入50份二氯甲烷以及150份饱和碳酸氢钠溶液搅拌1h以除去多余的硫光气；分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，以柱色谱分离，得4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺异硫氰酸酯；

步骤四：在反应容器中，依次加入1份丹磺酰肼和2份4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺异硫氰酸酯，用20份干燥DMF溶解，保持氮气氛下，加热反应；冷却，减压除去DMF；加入50份饱和食盐水，再各以50份二氯甲烷萃取2次；有机相用无水硫酸钠干燥；旋干溶剂，粗产物以柱色谱分离，得检测铜离子的荧光探针，即探针1，探针1的结构式如下：

在步骤一中，所述室温反应的时间可为0.5～2h，最好为1h；加热回流的温度可为60～80℃，最好为70℃；所述加热回流的时间可为3～8h，最好为6h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h。

在步骤二中，所述加热反应的温度可为70～90℃，最好为80℃；所述加热反应的时间可为8～12h，最好为10h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h。

在步骤三中，所述室温反应时间可为2～6h，最好为4h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h；所述柱色谱可采用乙酸乙酯/石油醚＝1/8。

在步骤四中，所述加热反应的温度可为40～60℃，最好为50℃；所述加热反应的时间可为24～72h，最好为48h；所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h，最好为1h。

将本发明制备的检测铜离子的荧光探针应用于中性条件下水溶液中铜离子的荧光检测。

本发明所提供的检测铜离子方法依赖于以下的化学反应机制：荧光猝灭基团通过肼基硫脲与丹磺酰基共价结合，所获得的化合物即探针1，探针1呈现弱荧光。探针1在铜离子作用下，重新释放出具有强荧光性质的丹磺酰基分子，实现测定体系的荧光信号的急剧增强。反应过程如下所示：

与现有的技术相比，本发明的突出优点是：

基于新颖的铜离子脱除荧光猝灭剂的原理；

探针的Stokes位移大，散射光干扰小，信噪比大；

探针在铜离子与其它多种金属离子共存体系中，表现出抗干扰能力强的特点，选择性高；

具有较高的水相中铜离子测定灵敏度。

附图说明

图1为探针1与不同浓度的铜离子作用后的荧光光谱。在图1中，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；在0.01mol/L的pH 7.4磷酸缓冲溶液(乙腈/水＝1/4，体积之比)中，探针1浓度均为1.0μmol/L，铜离子浓度(由下而上：×10^-8mol/L)分别为：0，2，3，5，7，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，140，170，200，250，300，400，500，600；激发波长：310nm。

图2为探针1对铜离子的荧光选择性。在0.01mol/L的pH 7.4磷酸缓冲液(乙腈/水＝1/4，体积之比)中，探针1对于各种金属离子的荧光信号对比图。在图2中，横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度；探针1浓度均为10.0μmol/L，各种金属离子浓度均为10μmol/L。激发波长：310nm。

图3为共存离子对于探针1以荧光光度法检测铜离子的影响。在图3中，横坐标为金属离子，纵坐标为荧光强度；在0.01mol/L的pH 7.4磷酸缓冲液(乙腈/水＝1/4，体积之比)中，探针1的浓度为1.0×10^-6mol/L，铜离子的浓度均为1.0×10^-6mol/L。共存离子相对于铜离子的浓度倍数如下：Mn²⁺(10)，Hg²⁺(5)，Cd²⁺(5)，Ag⁺(5)，Cr³⁺(5)，Fe³⁺(20)，Ni²⁺(20)，Pb²⁺(20)，Zn²⁺(20)，Co²⁺(20)，K⁺(100)，Na⁺(100)，Mg²⁺(50)，Al³⁺(50)以及Ca²⁺(30)；从左至右：无共存离子，Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Ba²⁺(分别为银离子的200倍)，Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cr³⁺，Mn²⁺，Pb²⁺，Fe³⁺以及Cd²⁺离子(分别为银离子的50倍)。

图4为探针1在0.01mol/L的pH 7.4磷酸缓冲液(乙腈/水＝1/4，体积之比)中，检测铜离子的荧光强度-剂量曲线(铜离子浓度在(0～100)10^-8mol/L)。在图4中，横坐标为铜离子浓度(10^-8mol/L)，纵坐标为荧光强度；探针1的浓度为1.0×10^-6mol/L，激发波长为310nm。

图5为探针1在0.01mol/L的pH 7.4磷酸缓冲液(乙腈/水＝1/4，体积之比)中，检测铜离子的荧光强度-剂量曲线(铜离子浓度在(0～600)10^-8mol/L)。在图5中，横坐标为铜离子浓度(10^-8mol/L)，纵坐标为荧光强度；探针1的浓度为1.0×10^-6mol/L，激发波长为310nm。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实施例1

探针1的合成方法：

步骤一、0.5g 4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸溶于5.0mL重蒸甲醇中，搅拌下加入0.5mL氯化亚砜，室温搅拌1h后，再加热回流9h；冷却，旋干甲醇；加入饱和食盐水，再用乙酸乙酯萃取；有机层以无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸甲酯，0.5190g，产率98％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ：8.10(d，J＝8.7Hz，2H)，7.86(d，J＝8.8Hz，2H)，7.84(d，J＝9.3Hz，2H)，6.86(d，J＝8.0Hz，2H)，3.88(s，3H)，3.09(s，6H).

¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ：166.29，155.76，153.56，143.16，130.87，130.06，129.38，125.82，124.62，122.34，114.25，112.09，52.72，40.32.

步骤二、0.50g 4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸甲酯溶于5.0mL乙二胺中，在氮气氛下加热升温至70℃反应过夜；冷却后旋转蒸发除掉乙二胺；加入饱和食盐水，再用二氯甲烷萃取；有机层再用饱和食盐水洗4次；所得有机相用无水硫酸钠干燥后旋干溶剂得4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺，0.5300g，产率96％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ：8.51(t，J＝5.5Hz，1H)，8.01(d，J＝8.4Hz，2H)，7.83(d，J＝3.6Hz，2H)，7.81(d，J＝3.2Hz，2H)，6.85(d，J＝9.2Hz，2H)，3.261-3.307(m，2H)，3.08(s，3H)，2.70(t，J＝6.5Hz，2H).

¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ：166.22，154.37，153.29，143.12，135.42，128.81，125.54，121.93，112.04，43.60，41.77，40.30.

FT-MS：312.18245

步骤三、在25mL圆底烧瓶中加入98μL硫光气(1.286mmol，4.0eq)，用2.0mL干燥的二氯甲烷稀释，称取0.10g4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺(0.3215mmol，1.0eq)于另一圆底烧瓶中，用干燥的二氯甲烷溶解(5.0mL)后在冰浴条件下滴入上述硫光气溶液中，滴完后再加入51.44mg氢氧化钠(1.286mmol，4.0eq)，室温反应4h后，再分别加入5mL二氯甲烷以及15mL饱和碳酸氢钠溶液搅拌30分钟；分液漏斗分离，所得有机相用无水硫酸钠干燥，旋干溶剂得橙红色固体，以柱色谱(乙酸乙酯/石油醚＝1/8)分离得4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酰乙二胺异硫氰酸酯，74mg，产率65％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ：8.89(t，J＝5.5Hz，1H)，8.00(d，J＝8.6Hz，2H)，7.85(d，J＝5.4Hz，2H)，7.82(d，J＝6.0Hz，2H)，6.85(d，J＝9.2Hz，2H)，3.87(t，J＝5.7Hz，2H)，3.56(m，2H)，3.08(s，6H).

¹3C NMR(100MHz，DMSO)δ：166.60，154.62，153.35，143.13，134.76，131.98，128.86，125.59，122.05，112.06，65.49，44.99，40.31.

FT-MS：354.13859

步骤四、在10mL圆底烧瓶中依次加入25mg(0.09442mmol，1.0eq)丹磺酰肼和50mg(0.1416mmol，1.5eq)5，用1.0mL干燥DMF溶解，保持氮气氛下，于50℃反应48h；冷却，减压除去DMF；加入饱和食盐水，再用二氯甲烷萃取；有机相用无水硫酸钠干燥；旋干溶剂，粗产物以柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝80/1)分离，得橙红色固体，即探针1，20mg，产率35％。

探针分子的表征

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ：10.18(s，1H)，9.49(s，1H)，8.53(d，J＝8.5Hz，1H)，8.49(t，J＝4.9Hz，1H)，8.27(d，J＝8.7Hz，1H)，8.22(t，J＝5.4Hz，1H)，8.15(d，J＝7.4Hz，1H)，8.01(d，J＝8.5Hz，2H)，7.83(d，J＝8.6Hz，4H)，7.64(t，J＝7.9Hz，1H)，7.57(t，J＝8.1Hz，1H)，7.26(d，J＝7.6Hz，1H)，6.86(d，J＝9.2Hz，2H)，3.57(d，J＝5.8Hz，2H)，3.32-3.24(m，2H)，3.08(s，6H)，2.83(s，6H).

¹³C NMR(100MHz，DMSO)δ：182.53，166.45，154.47，153.32，151.81，143.12，135.15，133.88，131.06，130.93，130.20，129.63，128.89，128.57，125.57，124.02，121.95，119.74，115.64，112.06，45.58，43.44，40.32.

FT_MS：619.22728(M+1)

实施例2

以下给出本发明所说的检测水中汞离子或银离子的分子探针的性能：

测试液的配制程序：在10mL刻度试管中，加入1.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲溶液(pH7.4)，再加入铜离子标准溶液(或其它金属离子的标准溶液)，用去离子水稀释至8.0mL，混匀；再加入2.0mL乙腈，混匀；最后加入0.1mL 1×10^-4mol/L探针1的乙腈溶液，再次混匀。放置30min后，于310nm为激发波长，于485nm处为发射波长，测定荧光值。

如上的操作，不加入金属离子溶液，即为空白试液的配制。

光谱特性及相关性能

荧光光谱：如图1中显示，探针1的空白试液在485nm处仅有微弱的荧光；当存在铜离子时，其荧光显著增强。

选择性：如图2中显示，当同样浓度的各种金属离子分别与探针1作用时，唯有铜离子能引起探针1在485nm处荧光强度的显著增强；而其他金属离子与探针1作用时，相比较于探针1的空白试液，其在485nm处的荧光强度无明显变化。这表明，就荧光光度法而言，探针1对铜离子的传感具有高度的特异性。

共存离子对铜离子测定的影响：为进考察探针1对铜离子传感的选择性，尝试了性质相近的各种金属离子与铜离子共存时对体系吸光度的影响。在图3中标“Cu²⁺”为1.0×10^-6mol/L的铜离子单独存在时体系的荧光强度，其余为同等浓度铜离子与不同浓度倍数的各种金属离子共存时体系的荧光强度。各金属离子浓度为铜离子浓度的倍数分别如下：Mn²⁺(10)，Hg²⁺(5)，Cd²⁺(5)，Ag⁺(5)，Cr³⁺(5)，Fe³⁺(20)，Ni²⁺(20)，Pb²⁺(20)，Zn²⁺(20)，Co²⁺(20)，K⁺(100)，Na⁺(100)，Mg²⁺(50)，Al³⁺(50)以及Ca²⁺(30)。由图可见，高倍数的过渡金属共存离子的存在并没有明显地改变该探针分子对于铜离子的检测结果。

检测铜离子的荧光强度-剂量曲线：如图4和5所示，体系的荧光强度随铜离子浓度的增加而增强。而探针溶液对低至2.0×10^-8的铜离子即有响应，表明该法具有较高的灵敏度。

Claims

1.一种检测铜离子的荧光探针，其特征在于为丹磺酰基与具有荧光猝灭功能的猝灭剂的共价结合体，所述检测铜离子的荧光探针的结构式如下所示：

所述检测铜离子的荧光探针记为探针1。

2.如权利要求1所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤一中，所述室温反应的时间为0.5～2h，最好为1h；加热回流的温度为60～80℃，最好为70℃；所述加热回流的时间为3～8h，最好为6h。

4.如权利要求2所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤二中，所述加热反应的温度为70～90℃，最好为80℃；所述加热反应的时间为8～12h，最好为10h。

5.如权利要求2所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤三中，所述室温反应时间为2～6h，最好为4h。

6.如权利要求2所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤三中，所述柱色谱采用乙酸乙酯/石油醚＝1/8。

7.如权利要求2所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤四中，所述加热反应的温度为40～60℃，最好为50℃；所述加热反应的时间为24～72h，最好为48h。

8.如权利要求2所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤一中，所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h；在步骤二中，所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h；在步骤三中，所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h；在步骤四中，所述无水硫酸钠干燥时间为0.5～3h。

9.如权利要求8所述的一种检测铜离子的荧光探针的制备方法，其特征在于在步骤一中，所述无水硫酸钠干燥时间为1h；在步骤二中，所述无水硫酸钠干燥时间为1h；在步骤三中，所述无水硫酸钠干燥时间为1h；在步骤四中，所述无水硫酸钠干燥时间为1h。

10.如权利要求1所述检测铜离子的荧光探针用于中性条件下水溶液中铜离子的荧光检测。