CN108641714B - 基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针，具有式I所示结构。本发明构建了一种基于罗丹明类化合物的荧光探针用于Hg2+检测。该探针可在pH为4.5～12.0的乙醇/水(v：v＝1：1)溶液中对Hg2+进行检测，具有灵敏度高和选择性好等优点。当Hg2+存在时，该探针的荧光发射强度增强同时溶液的颜色也从无色变为粉红色，该探针对Hg2+的线性响应范围是8.0×10‑8‑1.0×10‑5mol/L，检测下限是3.0×10‑8mol/L。实验结果表明，该探针对河水和自来水中Hg2+的回收率测定结果准确度高，并且该探针具有较好的生物兼容性，可以用于活细胞内Hg2+的荧光成像检测。

Description

基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
汞元素是一种重金属元素，以多种形态，如游离态、无机和有机汞等，存在于自然界中。二价汞离子(Hg2+)比一价汞离子(Hg+)更为常见，具有很强的腐蚀性和致癌性，是常见的环境污染物之一。有机汞，特别是甲基汞，可以在海洋生物体内累积，能通过食物链转移到人体内，导致大脑损伤和其它慢性疾病，最典型的例子就是在日本发生的水俣病。因此，迫切需要建立一种高效、快捷、简便和灵敏地对环境和生物体内微量汞进行检测和识别的方法。
目前很多分析方法已被用来测定汞离子，如原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、冷原子荧光光度法、电感耦合等离子体原子发射光谱法、电化学方法以及紫外可见分光光度法等。尽管这些方法的灵敏度比较高，但都具有检测成本高、样品前处理复杂、费时，不适用于实时和现场检测等缺点。由于荧光探针在选择性、检测成本等方面具有绝对的优势，目前设计和使用荧光探针来检测汞离子引起了分析工作者的广泛关注。
汞离子能和荧光分子自旋轨道进行耦合，猝灭荧光分子的荧光，是一种常见的荧光猝灭剂。故大多数测定汞离子的荧光探针都是基于荧光猝灭机理进行的，其灵敏度低于增强型的探针。在已经报道的荧光探针中，只有一部分是基于荧光增强原理来测定汞离子的。因此，对荧光增强型汞离子探针的研究仍是一个比较活跃的领域，同时也是一个挑战。
罗丹明及其衍生物具有摩尔消光系数大、荧光量子产率高、相对长的激发波长(>500nm)和发射波长等优点，这些优点使其具备了成为良好荧光载体的潜力。目前已经报道了一些基于罗丹明的荧光探针，它们可以通过颜色和荧光信号的变化来检测Hg2+、Cu2+、Pb2 +、Cr3+和Fe3+等金属离子。但是目前所报道的一些Hg2+探针具有响应速度慢、pH范围窄、选择性差等缺点。因此发展一种具有高选择性和灵敏度且响应速度快的汞离子荧光探针是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于罗丹明衍生物的 Hg2+荧光探针及其制备方法和应用，制备的Hg2+荧光探针可以在生理环境下进行检测，且识别过程可逆。
本发明提供了一种基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针，具有式I所示结构：
Figure BDA0001773289520000021
其中，R为末端烯烃基。
本发明中，末端烯烃指C＝C双键位于末端的烯烃，也称为α-烯烃。
所述末端烯烃基指末端烯烃失去一个H原子后剩余的基团。
优选的，所述R为C3～C8的末端烯烃基。
进一步优选的，所述R为-CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、 -CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2、 -CH2CH2CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH(CH3)CH＝CH2、-C(CH3)2CH＝CH2、 -CH(CH3)CH2CH＝CH2、-CH(CH3)CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH(CH3)CH2CH＝CH2、 -C(CH3)2CH2CH＝CH2或-CH(CH3)CH2CH2CH2CH＝CH2。
优选的，所述R为-CH2CH＝CH2，即所述基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针具有式I-b所示结构：
Figure BDA0001773289520000031
优选的，所述R为-C(CH3)2CH＝CH2，即所述基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针具有式I-c所示结构：
Figure BDA0001773289520000032
在本发明的一些具体实施例中，所述Hg2+荧光探针为式I所示化合物溶解于溶剂中，与Hg2+混合后即可检测。
本发明优选的，所述溶剂包括水和有机溶剂，所述有机溶剂为与水互溶的有机溶剂。
在本发明的一些具体实施例中，所述与水互溶的有机溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、二甲亚砜、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺等中的一种或多种。更优选为乙醇。
所述乙醇和水的体积比优选为1:1。
所述式I所示化合物在溶剂中的浓度优选为1.0×10-7～1.0×10-5mol/L，进一步优选为5.0×10-6mol/L。
在本发明的另外一些具体实施例中，所述Hg2+荧光探针为式I所示化合物负载于基底表面，负载后的探针可反复多次使用。
所述基底可以为本领域技术人员熟知的适用基底，在本发明的一些具体实施例中，所述基底为双键修饰的玻璃或纳米颗粒等。
本发明提供了上述Hg2+荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
A)罗丹明B和水合肼进行缩合反应，得到化合物2；
B)化合物2进行硫化反应，得到化合物3；
C)化合物3和化合物4进行缩合反应，得到式I所示化合物；
Figure BDA0001773289520000041
所述R的范围同上，在此不再赘述。
以R为-CH2CH＝CH2为例，上述反应的路线如下图所示：
Figure BDA0001773289520000051
其中，优选的反应条件如下：(a)水合肼(85％),乙醇,回流，12h,86％；(b)劳氏试剂,甲苯,回流,4h,17％；(c)烯丙基溴,NaHCO3,N,N-二甲基甲酰胺, 70℃,48h,61％；(d)乙醇,回流,12h,75％。
本发明提供了上述Hg2+荧光探针或上述制备方法制备的Hg2+荧光探针在 Hg2+荧光检测中的应用，所述检测的pH为4.5～12.0。
所述Hg2+荧光探针的响应时间小于1min。
所述检测中，Hg2+的线性响应范围是8.0×10-8-1.0×10-5mol/L，检测下限是 3.0×10-8mol/L。
与现有技术相比，本发明提供了一种基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针，具有式I所示结构。本发明构建了一种基于罗丹明类化合物的荧光探针用于 Hg2+检测。该探针可在pH为4.5～12.0的乙醇/水(v:v＝1:1)溶液中对Hg2+进行检测，具有灵敏度高和选择性好等优点。当Hg2+存在时，该探针的荧光发射强度增强同时溶液的颜色也从无色变为粉红色，该探针对Hg2+的线性响应范围是8.0×10-8～1.0×10-5mol/L，检测下限是3.0×10-8mol/L。实验结果表明，该探针对河水和自来水中Hg2+的回收率测定结果准确度高，并且该探针具有较好的生物兼容性，可以用于活细胞内Hg2+的荧光成像检测。
附图说明
图1是化合物1(5μM)在不同浓度汞离子存在时的荧光光谱变化图；
图2是汞离子(10μM)加入前后化合物1(5μM)的紫外可见光谱图；
图3是探针1(5μM)对Hg2+的校正曲线图；
图4是探针1(5μM)对Hg2+的Job曲线图；
图5是化合物1和汞离子形成络合物的可能结构模型图；
图6是化合物1(5μM)的荧光发射强度对pH的变化图；
图7是化合物1(5μM)在不同阳离子单独存在以及和Hg2+共存时的荧光发射强度变化图；
图8是化合物1(5μM)在加入Hg2+(10μM)前后以及加入Hg2+(10μM) 和EDTA(40μM)后的荧光发射光谱图；
图9是化合物1(5μM)在加入1.0×10-5mol/L Hg2+后荧光发射强度随时间的变化图；
图10是探针1的MTT试验结果；
图11是探针1的A549细胞荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针及其制备方法和应用进行详细描述。
仪器与试剂：
以下所有的荧光测量在Hitachi F-7000荧光光度计上进行；紫外可见光谱的测定是在UV-2600紫外可见分光光度计上进行；核磁共振光谱在Bruker DRX-500光谱仪上获得(用CDCl3作溶剂)，溶液的pH值用Mettler toledo delta 320pH计测定。
劳氏试剂(97％)从Aldrich购得。
罗丹明B和水合肼(85％)在上海国药集团有限公司购得。
甲苯在使用之前需要重蒸除水，实验过程中所用的水均为去离子水。
除非特别指明外，其它的化学试剂都是分析纯，不需要进一步的纯化和处理，可以直接使用。
实施例1
化合物2的合成：将罗丹明B(4.79g，10mmol)加入到干燥的100mL 单口烧瓶中，并加入30mL乙醇溶解，在磁力搅拌下逐滴加入9mL的水合肼 (85％)，加热回流12h后停止反应，将混合物溶液冷却至室温后减压蒸馏除去溶剂，加入50mL的1mol/L的盐酸溶液，然后用1mol/L的氢氧化钠溶液调节其pH值至中性；加入二氯甲烷萃取，萃取三次，每次加入30mL，收集二氯甲烷相，旋干溶剂，干燥得到化合物2的土黄色固体3.92g，产率为86％。
化合物3的合成：氮气流下，在100mL的圆底烧瓶中加入化合物2(1.08 g，2.4mmol)、劳氏试剂(0.96g，2.4mmol)和重蒸的40mL甲苯，磁力搅拌下加热回流反应4小时，混合物冷却至室温后减压蒸馏去除溶剂得粗产物，以二氯甲烷/石油醚(3：4，v/v)为洗脱剂经柱层析得到化合物3的白色固体 0.19g,产率为17％。
化合物4的合成：2，4-二羟基苯甲醛(1.00g，7.2mmol)和NaHCO3(0.61 g，7.2mmol)溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺，0.625mL(7.2mmol)的烯丙基溴逐滴加入其中，然后在70℃搅拌反应48小时。混合物冷却至室温后，减压蒸馏去除溶剂后得粗产物，以石油醚/二氯甲烷(7：2，v/v)为洗脱剂经柱层析得到化合物4的黄色油状物0.78g，产率为61％。
化合物1(即式I所示化合物)的合成：于50mL乙醇溶液中，加入化合物3(0.19g，0.40mmol)和化合物4(0.096g，0.54mmol)，加热回流12 小时，以石油醚/乙酸乙酯(10：1，v/v)为洗脱剂经柱层析得到化合物1的淡黄色固体0.19g，产率为75％。
采用核磁共振谱和质谱对其结构进行表征，结果如下：
1H NMR(500MHz,CDCl3),δ(ppm):11.50(1H,s),8.62(1H,s),8.09(1H, dd,J＝5.8Hz,3.2Hz),7.41(2H,dd,J＝5.8Hz,3.2Hz),7.19(1H,d,J＝8.5Hz), 7.13-7.11(1H,m),6.74(2H,d,J＝8.8Hz),6.49-6.42(2H,m),6.32-6.27(4H,m), 6.05-5.97(1H,m),5.39(1H,dd,J＝17.2Hz,1.4Hz),5.27(1H,dd,J＝10.5Hz, 1.2Hz),4.51(2H,d,J＝5.3Hz),3.31(8H,q,J＝7.0Hz),1.14(12H,t,J＝7.0Hz).
13C NMR(125MHz,CDCl3),δ(ppm):170.13,162.38,161.97,161.07, 155.13,151.93,148.33,135.19,133.02,132.67,132.16,130.11,127.91,127.12, 122.21,117.99,111.75,110.17,108.28,107.63,101.92,97.53,68.83,64.23,44.37, 12.60.
MS(ESI)m/z:633.2902(M+H)+.
实施例2荧光强度的测量
一定量的化合物1溶解于乙醇中制得1.0×10-5mol/L化合物1的储备液。
用pH7.24的0.05mol/L Tris–HCl缓冲溶液逐级稀释1.0×10-2mol/L硝酸汞溶液得到8×10-7-1.0×10-3mol/L Hg2+储备液。
精密量取12.50mL化合物1的储备液和2.50mL不同浓度的Hg2+溶液加入到25mL容量瓶中，然后用0.05mol/L Tris-HCl溶液定容到25mL。这样得到的溶液中含有5×10-6mol/L化合物1和8×10-8-1×10-4mol/L Hg2+溶液，化合物1的空白溶液是在相同条件下制备的，但不加入Hg2+。所有溶液在4℃下避光保存，以备下一次使用。
荧光强度测量时，固定激发波长为520nm，入射和出射狭缝都为2.5nm, 记录530-650nm范围内的荧光强度的变化。
实验结果见图1～图2。
图1是化合物1(5μM)在不同浓度汞离子存在时的荧光光谱变化图(汞离子的浓度从1到21分别是0,0.08,0.1,0.2,0.4,0.5,0.6,0.8,1,2,4,5,6,8,10, 20,40,50,60,80,100μM；测量是25℃时在pH为7.24的乙醇/水(v：v＝1： 1)溶液中进行；激发波长为520nm)。插图为化合物1在580nm时的荧光强度对不同浓度Hg2+的荧光响应曲线。
从图1可以看出，当没有Hg2+存在时化合物1的荧光强度非常弱，随着 Hg2+浓度的增加化合物1在580nm处的荧光强度逐渐增强。当加入过量的 Hg2+时，化合物1的最大荧光强度增强为原来的52倍。本申请正是基于此来测定汞离子浓度的。
图2是汞离子(10μM)加入前后化合物1(5μM)的紫外可见光谱图(其中实线表示加入Hg2+之前，虚线表示加入Hg2+之后)。插图为荧光探针1加入Hg2+前(左)和后(右)的颜色变化图。
从图2中可以看出在汞离子加入之前，化合物1的紫外可见光谱在565nm 处显示一个弱的吸收峰，这可能是化合物1中罗丹明螺内酰胺被部分开环所引起的。加入过量汞离子之后，565nm处吸收峰的强度增加，可能原因是：汞离子的存在使化合物1的螺内酰胺结构开环，从而化合物1在565nm处的吸收强度增大，紫外可见光谱研究结果表明化合物1与汞离子发生了配位作用。此外，从化合物1在CDCl3溶剂中的核磁共振碳谱可以看出：加入汞离子前δ＝64.23ppm的化学位移对应于季碳的特征化学位移值，这也表明化合物1在没有Hg2+时以螺内酰胺的结构形式存在。插图可以看出，加入Hg2+之前溶液为透明无色；加入Hg2+之后，溶液变为粉红色。
为了测量探针的荧光响应与Hg2+的线性关系，在探针1中加入不同浓度的Hg2+。荧光探针1在发射波长为580nm，Hg2+浓度范围为8.0×10-8-1.0×10-5 mol/L时获得了线性响应，结果见图3。
图3是探针1(5μM)对Hg2+的校正曲线图。插图为探针1对低浓度Hg2+的线性响应曲线的放大图。
由图3可知，荧光探针1对Hg2+的线性回归方程是F＝25.1293+25.1931 ×106×C(R＝0.9949)，其中F代表测量的荧光强度，C代表加入的Hg2+浓度，R是线性相关系数。检测下限根据3SB/m(其中SB是10次空白测量的标准偏差，m是线性回归方程的斜率)计算是3.0×10- 8M。
通过Job曲线图(图4)来确认化合物1与汞离子的配比。
从图4可以看出，当Hg2+的物质的量摩尔百分比接近于0.5时，化合物1 的吸光度达到最大值，这表明化合物1和汞离子是1：1配位的。
结合汞离子存在前后化合物1吸收光谱的变化图(图2)，得到一种化合物1和汞离子形成络合物的可能结构模型，如图5所示。
实施例3pH的影响实验
对不同pH值(2.0-12.0)对化合物1荧光强度的影响进行检测，结果见图6，图6是化合物1(5μM)的荧光发射强度对pH的变化图。
从图6中可以看出，当pH在4.5到12.0之间时化合物1的荧光强度基本保持不变，这表明荧光探针在pH为4.5-12.0时不受pH的影响并且可用于实际样品的检测。当pH小于4.5时，化合物1的荧光强度值随着pH的减小而增加，这可能是由于在酸性条件下化合物1的螺内酰胺结构开环而导致荧光增强。
综合考虑灵敏度、响应时间和实际应用，本申请选择pH为7.24的Tris-HCl 缓冲溶液作为最佳实验条件。
实施例4选择性实验
对不同金属阳离子单独存在时对化合物1的荧光强度的影响进行检测，结果如图7中的黑色柱状图所示，图7为化合物1(5μM)在不同阳离子单独存在以及和Hg2+共存时的荧光发射强度变化图(Cu2+,Co2+,Ni2+,Mn2+和 Hg2+的浓度是1.0×10-5mol/L；其它离子的浓度是1.0×10-4mol/L)。
从图7中的黑色柱状图中可以看出：Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、 Al3+、Cd2+、Zn2+、Ag+、Mg2+、Pb2+、Ba2+、Cr3+离子的浓度在10倍于Hg2+浓度的情况下，对化合物1的荧光强度几乎没有影响。此外，Cu2+,Co2+,Ni2+, Mn2+与Hg2+的浓度相等时，对Hg2+的检测也不会产生影响。可见，该荧光探针表现出对Hg2+良好的选择性。
进一步考查不同金属离子和汞离子共存时对化合物1检测汞离子的影响。固定汞离子的浓度为1.0×10-5mol/L，记录加入不同金属阳离子前后化合物1 荧光强度的变化，结果如图7的白色柱状图所示。
从图7的白色柱状图可知：不同金属离子和汞离子共存时，对测定Hg2+的相对误差低于±5％，这被认为是可以接受的。这说明不同金属阳离子和汞离子共存不影响汞离子的测定，使得该探针具有进一步应用于测定实际样品的前景。
实施例5可逆性和响应时间
通过加入EDTA溶液来检测化合物1的可逆性，实验结果如图8所示，图8是化合物1(5μM)在加入Hg2+(10μM)前后以及加入Hg2+(10μM) 和EDTA(40μM)后的荧光发射光谱图。
从图8中可以看出加入汞离子后化合物1的荧光强度显著增强，同时裸眼看到溶液颜色由无色变为粉红色；但是在上述红色溶液中加入EDTA溶液 (加入EDTA物质的量是Hg2+的4倍)后荧光强度又迅速下降，接近于空白值，同时裸眼看到溶液颜色由粉红色变为无色，这说明化合物1和Hg2+的络合过程是可逆的。
将浓度为1.0×10-5mol/L的汞离子加入到化合物1溶液中，记录从0.0到 10.0分钟内其荧光强度值的变化，从而考查化合物1对Hg2+的响应时间，结果如图9所示，图9是化合物1(5μM)在加入1.0×10-5mol/L Hg2+后荧光发射强度随时间的变化图，时间点代表0、30、60、90、120、150、180、210、 240、270和300s。插图显示探针1(5μM)(左)和探针1(5μM)与Hg2+反应90秒后(右)的可见荧光颜色(UV灯，365nm)，左图为透明无色，右图为粉红色。
从图9中可以看出，化合物1和汞离子的络合速度非常快，在1min内其荧光强度即可达到最大值。因此，该荧光探针可以用于汞离子的实时检测。
实施例6Hg2+荧光检测应用
将实施例1制备的荧光探针用于河水和自来水中汞离子回收率的测定。河水和自来水经0.45μm滤膜处理后直接使用。河水和自来水用所制荧光探针测定汞离子含量，得知其中不含汞离子，然后分别加入不同浓度的Hg2+的标准溶液进行回收率的测定。结果列于表1。从表1中可以看出，该荧光探针对河水、自来水中Hg2+回收率的测定准确度高，所以该传感器可有效的用于实际样品中Hg2+的分析测定。
表1河水和自来水的Hg2+回收率实验
Figure BDA0001773289520000111
Figure BDA0001773289520000121
a三次测量的平均值；b标准偏差
实施例7生物成像应用研究
采用MTT比色法进行细胞毒性试验，评估探针1的生物兼容性，结果如图10所示，图10是探针1的MTT试验，不同浓度(0,2,4,8,16μM)的探针1分别在37℃下孵育A549细胞24h。
从图10可以看出，当探针1存在时，A549细胞的存活率高于90％，这表明探针1对细胞几乎没有毒性。
采用激光共聚焦荧光成像实验验证探针1能否被用于活细胞内Hg2+的检测，结果见图11，图11是探针1的A549细胞荧光共聚焦成像图，(a)为用5μM探针1孵育A549细胞30分钟后的细胞荧光成像；(b)为(a)所示的细胞明场透射图像；(c)为(a)和(b)的叠加图像；(d)5μM探针1 孵育A549细胞30分钟后，再加入1μMHg2+孵育A549细胞30分钟的细胞荧光图像；(e)为(d)中的细胞明场透射图像；(f)为(d)和(e)的叠加图像。
从图11可以看出，A549细胞用含有5μM探针1的培养基培养30min 后，基本上没有荧光；然而相同条件下再加入1μMHg2+培养30min后的A549 细胞，表现出很强的荧光。由研究结果得知，探针1可应用于活细胞中Hg2+的荧光成像。
由上述实施例可知，本发明制备了一种基于罗丹明类化合物的荧光探针用于Hg2+的传感，当Hg2+存在时探针的荧光强度增强，从而实现对Hg2+的选择性识别。探针识别Hg2+的机理是化合物1与汞离子络合后，化合物1的螺内酰胺开环致使其荧光增强和颜色变化，这个过程是可逆的。荧光探针对Hg2+的检测具有灵敏度高、选择性好、响应速度快等优点，对Hg2+的线性响应范围是8.0×10-8-1.0×10-5mol/L，检测下限是3.0×10-8mol/L。该探针对河水和自来水中Hg2+的回收率测定准确度高，并且该探针具有较好的生物兼容性，可以用于活细胞内Hg2+的荧光成像检测。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于罗丹明衍生物的Hg2+荧光探针，其特征在于，具有式Ⅰ所示结构：
Figure FDA0002614676690000011
其中，R为-CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH2CH2CH2CH2CH＝CH2、-CH(CH3)CH＝CH2、-C(CH3)2CH＝CH2、-CH(CH3)CH2CH＝CH2、-CH(CH3)CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH(CH3)CH2CH＝CH2、-C(CH3)2CH2CH＝CH2或-CH(CH3)CH2CH2CH2CH＝CH2。
2.根据权利要求1所述的Hg2+荧光探针，其特征在于，所述式Ⅰ所示化合物溶解于溶剂中，或负载于基底表面。
3.根据权利要求2所述的Hg2+荧光探针，其特征在于，所述基底为双键修饰的玻璃或纳米颗粒；所述溶剂包括水和有机溶剂，所述有机溶剂为与水互溶的有机溶剂。
4.根据权利要求3所述的Hg2+荧光探针，其特征在于，所述与水互溶的有机溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、二甲亚砜、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的Hg2+荧光探针，其特征在于，所述式Ⅰ所示化合物在溶剂中的浓度为1.0×10-7～1.0×10-5mol/L。
6.权利要求1～5任一项所述的Hg2+荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
A)罗丹明B和水合肼进行缩合反应，得到化合物2；
B)化合物2进行硫代反应，得到化合物3；
C)化合物3和化合物4进行缩合反应，得到式Ⅰ所示化合物；
Figure FDA0002614676690000021
其中，R为末端烯烃基。
7.根据权利要求6所示的制备方法，其特征在于，所述硫代反应的硫代试剂为劳氏试剂。
8.权利要求1～5任一项所述的Hg2+荧光探针或权利要求6～7任一项所述的制备方法制备的Hg2+荧光探针在Hg2+荧光检测中的应用，所述检测的pH为4.5～12.0。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测中，Hg2+的线性响应范围是8.0×10-8～1.0×10-5mol/L，检测下限是3.0×10-8mol/L。
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