CN102489230A - 一种生物可降解聚合物微囊的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物可降解聚合物微囊的制备方法，主要包括：开孔微球的制备、囊芯材料的装填和开孔微球的封口。所述生物可降解材料微囊可用于包埋小分子、生物大分子物质，还可以装载纳米、微米级尺寸的颗粒。相比传统的复乳包埋方法，该方法更加温和，避免生物活性物质受损；包埋后溶液中剩余的囊芯材料可回收利用；更加环境友好，达到了与之前报道相同的粒径、孔径水平，且内腔容积更大，更有利于囊芯材料的装载；适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，涉及高分子微球、微囊材料的成型加工及作为新型药物制剂材料的应用。
背景技术
微囊是指从亚微米到毫米尺度的小型胶囊。功能材料与壳层材料是构成微囊的两个基本元素。微囊的制备，指的是通过一定的方法使功能材料被包裹或分散在壳层材料中，从而制备颗粒状复合物的过程。微囊是一种重要的商品形式。通过对物质进行包埋可以达到许多目的，如可以改善囊芯材料的化学或物理稳定性，屏蔽囊芯的气味、颜色和毒性，还可以实现囊芯物质的控制释放和靶向释放。合成聚合物材料，由于便于成型加工，便于性能改造，是发展最快的一类微囊材料。
在传统的聚合物领域中，微囊或中空微球能够通过聚合物和致孔剂的相分离来制备。在致孔过程中，溶剂常被称为致孔剂，通常选择油溶性小分子。聚合物与溶剂的相分离能够发生在聚合物链增长过程中，由于聚合物分子量的增长或分子间的交联，大分子逐渐从小分子溶剂中沉淀出来，形成固态高分子。也能够发生在高分子溶液体系中，由于环境条件改变，如温度的变化、良溶剂的去除或不良溶剂的添加，造成溶剂对高分子的溶解能力下降，使高分子沉淀成固相。但是，这种方法只能包埋有限的几种有机溶剂或溶于有机溶剂的物质，难以形成通用的包埋方法。
对于生物活性物质的包埋，更为常用的方法是水包油包水(W/O/W)复乳包埋法，它能够提供生物友好的内水相环境，避免了被包埋组分同疏水溶剂的接触，有利于生物分子构象的稳定和活性保持。再结合油相固化技术，能够制备出以复乳液滴为模板的固体微胶囊，从而满足长期稳定包埋的需要。可选择的油相固化技术有悬浮聚合法和溶剂去除法。前者油相中包含可聚合小分子单体，通过原位聚合实现油相固化；后者油相为高分子有机相溶液，通过溶剂的挥发或萃取实现油相固化。
复乳与溶剂去除法相结合是目前研究的重点，该方法便于采用生物降解的高分子为壳层材料，适用于载药微囊的开发。而其中关注度最高的是聚乳酸类高分子，近十年，和复乳化技术相关的文献中近半数涉及聚乳酸类壳层材料。在体液环境中，聚乳酸胶囊能够在一定时间内完全降解，释放出内部载药，是一种理想的载药材料。例如CN 1935127A提供一种以改性聚乳酸材料为囊材的微球制备方法，采用改性聚乳酸材料为囊材，对于囊芯物是水溶性或不能被溶剂溶解但表面是亲水性的物质或药物的微球制备，先将囊芯物溶解或分散在水中，将改性聚乳酸材料溶解在其能与水相混溶的溶剂中，然后将囊芯物的水溶液加入改性聚乳酸材料的溶液中，或将改性聚乳酸材料的溶液加入囊芯物的水溶液中，或将这两种溶液同时加入用于溶解改性聚乳酸材料的溶剂中，或将它们的混合溶液加入溶解改性聚乳酸材料的溶剂中，搅拌得微球溶液，然后过滤得微球。方法中不使用表面活性剂和分散剂，制备过程简单，粒径可达到纳米级，且粒径可控，包裹率高，可很大程度上维持囊芯物的活性，微球具有缓释功能。
相对于相分离的包埋方法，复乳法更适用于大量生物活性分子的包埋，但由于乳化的过程中伴随着机械搅拌或超声乳化，产生的剪切力会对蛋白质类药物的活性产生不利影响；靠近油水界面的药物会与油相的有机溶剂接触，造成药物活性的降低，甚至失活。此外由于复乳液是热力学不稳定体系，内水相会在固化前与外水相融合，使得原本在内水相的药物泄漏到外水相中，降低药物包埋率。
2005年，Im等(Im，S.H.，U.Y.Jeong，and Y.N.Xia，Polymer hollow particleswith controllable holes in their surfaces.Nature Materials，2005.4(9)：p.671-675)提出了一种先将聚合物微球加工成单眼微球，再封口的纳米微囊制备方法。该方法首先制备纳米尺度的聚苯乙烯胶乳颗粒，再使用甲苯溶胀聚苯乙烯纳米颗粒，随后使用液氮冷冻溶胀纳米球，使纳米球向界面收缩，形成中空结构，最后缓慢升温，使甲苯缓慢挥发，挥发过程中发生相分离形成单眼结构。单眼球作为纳米微囊的半成品，与囊芯材料进行组装，后升高温度至壳层玻璃态温度以上，通过退火处理(缓慢降温)进行封口，或通过有机溶剂对纳米微球进行溶胀，进而达到封口的效果。马光辉等(Ma，G.H.，et al.，Uniform one-hole particles usedas versatile micro-encapsulation.Chemistry Letters，2008.37(3)：p.366-367)利用膜乳化技术，制备出了粒径均一、孔径可控微米尺度的聚苯乙烯单眼微球，并利用溶剂对微球溶胀，实现了微米尺度微球的封口，成功实现了对水溶性分子和磁流体的包埋。但由于聚苯乙烯生物相容性较差，限制了其在医药领域的应用。
在Im方法基础上，Yin等(Yin，W.and M.Z.Yates，Encapsulation and sustainedrelease from biodegradable microcapsules made by emulsification/freeze drying andspray/freeze drying.Journal of Colloid and Interface Science，2009.336(1)：p.155-161)利用喷雾法首先制备出O/W单乳液，并迅速置于低温环境中冷冻干燥，在降温的过程中，单乳液中的聚合物发生相分离，而在干燥过程中，单乳液中的有机溶剂被去除，从而形成多孔的PLA微球；并通过二氯甲烷以及压缩二氧化碳，进行后续处理，实现了多孔微球的封口。实验中选用生物可降解材料作为壳层材料，但制备出的球形不好，且孔径分布不均匀。Kim等(Kim，H.K.，H.J.Chung，and T.G.Park，Biodegradable polymeric microspheres with″open/closed″pores for sustained release of human growth hormone.Journal ofControlled Release，2006.112(2)：p.167-174)同样利用相分离制孔技术，以单乳液为模板，利用表面活性剂Pluronic F127作为致孔剂制备出不同孔径的PLGA多孔微球，在装载重组人生长激素后，对其进行了溶剂封口处理，缺点是制备工艺复杂，药物的包埋率较低。
本发明提出一种完全不同于上述报道的方法，即首先使用复乳法制备生物可降解开孔微球，并在此基础上创造了一种新的微囊化方式，以期待获得更高的囊芯材料装载量和生物活性。首先通过复乳模板法制备中空开孔微球，复乳模板在固化过程中内外水相融合形成内外贯穿的孔道；并将开孔微球浸泡在含有囊芯材料的溶液中，当被包埋物质扩散到微球内部，并达到平衡时，可选用溶剂溶胀、升温退火、照射三种不同方式对微球表面进行处理，使其软化收缩，从而达到封口的效果。相比传统的复乳包埋方法，该方法的包埋过程中无机械搅拌或超声破碎，过程更加温和，避免生物活性物质受损。包埋后溶液中剩余的囊芯材料可回收利用。相比较之前报道的先成球后封口的方法，本发明首次提出用复乳模板法制备开孔微球，该方法使用水相制孔，确保了生物兼容性，更加环境友好。达到了与之前报道相同的粒径、孔径水平，且内腔容积更大，更有利于囊芯材料的装载。本发明选用生物可降解的聚乳酸类作为壳层材料，其中包括PLA，PLGA，PELA。通过调节制备工艺可以实现对微球粒径和孔径的控制，适用于包埋多种尺度的囊芯材料。本发明在开发的过程中考虑了放大的需求，乳化和固化都是常规的生产方式，适合大规模生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种新型的生物可降解材料微囊的制备方法。首先制备出具有贯穿孔结构的开孔微球，该微球具有多腔的内部结构和多孔的壳层，通过复乳演变和复乳固化两个动态过程的控制，可精确控制开孔球的开孔结构与开孔数量。开孔球表面孔径范围为0.1-999μm。该开孔微球生物兼容性好，内腔容积大，腔室之间彼此相互连接，且制备过程易于放大。随后将开孔球浸入到囊芯材料的溶液中，囊芯材料通过扩散进入微球内部，可选用溶剂溶胀法、照射法和升温退火法三种对开孔微球进行封口，从而实现先成球、后包埋生物活性物质的目的。制备的微胶囊粒径控制在1-1000μm；本发明验证了该微胶囊的应用，其中包括装载小分子、生物大分子、纳米材料和微米材料。
所述生物可降解材料微囊的制备方法，主要包括开孔微球的制备、囊芯材料的装填，以及开孔微球的封口。所述方法具体包括以下步骤：
(1)配制油相，所述油相为聚合物膜材溶液，其中溶剂为有机溶剂；配制内水相溶液和外水相溶液，外水相添加表面活性剂；
(2)将内水相分散到油相当中，形成油包水初乳液；再将初乳液分散到外水相中，形成水包油包水复乳液；
(3)利用溶剂去除法，使油相固化，得到具有内外贯穿孔道的开孔微球；
(4)将开孔微球的悬浊液加入到囊芯材料溶液当中，充分混合，得到已装填具有囊芯材料的开孔微球；
(5)开孔微球的封口，得到聚合物微囊。
优选地，步骤(1)中所述聚合物膜材为聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物中的1种或至少2种的组合，所述组合典型但非穷尽的实例有：聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)的组合，聚(乳酸-羟基乙酸)、单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物的组合，聚乳酸、单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物的组合，聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物的组合等。
优选地，步骤(1)中所述有机溶剂为挥发性且不与水互溶的有机溶剂，例如：正丁醇、甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括挥发性且可部分溶于水的有机溶剂，例如乙酸乙酯、苯酚等，进一步优选为不与水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、卤代烷烃、卤代芳烃中的1种或至少2种的组合，所述组合典型但非穷尽的实例有：醇、酮的组合，醇、酮、酯、醚的组合，酯、烷基苯、卤代烷烃的组合，酯、烷基苯、卤代烷烃、卤代芳烃的组合等，特别优选为醇、酯、烷基苯、氯代烷烃、氯代芳烃中的1种或至少2种的组合。
步骤(1)中所述内水相为常规内水相，例如无机盐的水溶液、水等。
步骤(1)中所述外水相为包含表面活性剂的常规水相，例如溶解有无机盐、表面活性剂的水溶液等。
优选地，步骤(3)中所述溶剂去除法为溶剂萃取法，也可以是静置使溶剂挥发，或搅拌使溶剂挥发或其他去除溶剂的方法。
步骤(3)中所述固化过程中，内水相与外水相融合，形成贯穿孔。
步骤(3)所述的具有内外贯穿孔道的开孔微球，为单孔或多孔结构。
步骤(5)所制备的聚合物微囊，为单一内腔或多腔室结构。
优选地，步骤(3)中，使油相固化后，除去残留的表面活性剂，特别优选通过过筛或离心洗涤除去残留的表面活性剂。
优选地，步骤(4)中所述囊芯材料溶液包括囊芯材料悬浊液和囊芯材料溶液。
步骤(4)中所述开孔微球悬浊液溶剂为可分散但不溶解微球的溶剂。
优选地，步骤(4)中所述混合温度为40℃以下，进一步优选为30℃以下，特别优选为室温。
优选地，步骤(4)中所述混合时间为15小时以上，进一步优选为20小时以上，更优选为24小时以上，特别优选为24小时。
优选地，步骤(5)所述开孔微球的封口工艺，包括以下三种方法：
(i)溶剂溶胀法；
(ii)照射法；
(iii)升温退火法。
所属领域技术人员也可根据其掌握的专业知识/新技术对开孔微球进行封口。
优选地，方法(i)中所述溶剂溶胀法具体为：将有机溶剂添加到含有表面活性剂的水溶液中，并使其均匀分散于水相中，将已装填具有囊芯材料的开孔微球加入，充分混合，转移到水溶液中固化，得到封口后的微囊
优选地，方法(i)中所述有机溶剂为挥发性且不与水互溶的有机溶剂，例如：正丁醇、甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括挥发性且可部分溶于水的有机溶剂，例如乙酸乙酯、苯酚等，进一步优选为不与水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、卤代烷烃、卤代芳烃中的1种或至少2种的组合，所述组合典型但非穷尽的实例有：醇、酮的组合，醇、酮、酯、醚的组合，酯、烷基苯、卤代烷烃的组合，酯、烷基苯、卤代烷烃、卤代芳烃的组合等，特别优选为醇、酯、烷基苯、氯代烷烃、氯代芳烃中的1种或至少2种的组合。
优选地，方法(i)中采用超声、均质或机械搅拌的方法使有机溶剂均匀分散于水相中，特别优选采用超声方法，例如采用超声细胞破碎仪。
优选地，方法(i)中所述混合方式为持续搅拌、超声或震荡，保持微球的悬浮状态，特别优选置于垂直混合器上混合。
优选地，方法(i)中固化后，洗涤，得到封口后的微囊，特别优选采用过筛洗涤。
优选地，方法(i)中所述固化可在静置或搅拌状态下进行。
优选地，方法(ii)所述照射法具体为：将载有囊芯材料的开孔微球加入到含有表面活性剂的水溶液中，充分混合，采用紫外线或可见光或红外线光源照射微球悬浊液，一段时间后，降温，得到封口后的微囊。
优选地，方法(ii)中所述混合方式为持续搅拌、超声或震荡，保持微球的悬浮状态，特别优选采用滚轴式混合器。
优选地，方法(ii)中所述照射为红外线照射。
方法(ii)中，所属领域的技术人员可通过调节光源与样品距离、控制光强度使微球悬浊液获得合适的照射到的光强。
优选地，方法(iii)中所述升温退火法具体为：将载有囊芯材料的开孔微球加入到含有表面活性剂的水溶液中，混合并升温至微球的玻璃化温度以上，一段时间后，缓慢降温，洗去表面活性剂，得到封口后的微囊。
优选地，方法(iii)中所述混合方式为持续搅拌、超声或震荡，保持微球的悬浮状态，特别优选采用滚轴式混合器。
优选地，方法(iii)中所述升温采用控温箱或微波加热方式。
保持生物活性是微囊制剂的难题，传统的W/O/W包埋技术都是将生物活性物质溶解于内水相，通过超声破碎、均质乳化、机械搅拌等方案使内水相分散到油相中，在此过程中，被包埋药物，如蛋白质等，会受到机械剪切的破坏，活性降低；此外，复乳体系中存在大量的油水界面，蛋白质与有机溶剂接触，使其构象发生变化，活性丧失；由于复乳液不稳定性，内外水相融合也会造成包埋率的降低。
本发明提出了一种制备生物可降解的微囊的方法，首先使用生物可降解材料制备开孔微球，再将其分散于囊芯材料的水溶液中，由于该发明制备的微球孔道内外贯穿，水溶液会通过孔道灌满整个微球的空腔。随后利用溶剂溶胀法、照射法或升温退火法，实现对微球表面大孔的密封，形成微囊，此时生物活性物质被包埋在微囊内腔中。
本发明所用的壳层材料有多种选择，包括不同分子量的聚乳酸类材料，其中的聚(乳酸-羟基乙酸)、单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物可以是不同单体比例的聚合物。
在本发明中，若油相采用的有机溶剂溶于水，则在油相与外水相混合前，需在外水相中加入所述油相的有机溶剂，并使其饱和，以保证油相中的溶剂不会溶于外水相中，避免油相在乳化过程中出现固化。
本发明的目的之一还在于提供一种生物可降解材料微囊。
所述生物可降解材料微囊直径为1-1000微米，胶囊壳层材料为生物可降解材料，为单一内腔或多腔室结构，由本发明所述方法制备。
本发明的目的之一还在于提供一种所述生物可降解材料微囊的用途。所述生物可降解材料微囊可用于包埋小分子、生物大分子物质，还可以装载纳米、微米级尺寸的颗粒，如图7、11、18、22所示。
本发明中利用溶剂溶胀法封口适用于包埋能耐受微量有机溶剂的生物材料。当所包埋物对有机溶剂较为敏感时，可利用照射法或升温退火法；特别是照射法，能在较低的溶液温度下实现封口。
本发明中开孔微球的结构，可通过复乳演变、固化过程两个动态过程来调控，也可通过调整制备配方来选择合适的壳层材料。
本发明中所述互溶指两种液体能以任何比例互相溶解的现象，因此所述“不与水互溶的有机溶剂”，包括可部分溶于水的有机溶剂。
本发明中采用的制备方法，只涉及工业生产中的常规制备，便于工艺放大与应用推广。
与现有技术相比，本发明所述生物可降解聚合物微囊的制备方法，具有以下优点：
(1)相比传统的复乳包埋方法，该方法的包埋过程中无机械搅拌或超声破碎，过程更加温和，避免生物活性物质受损。
(2)包埋后溶液中剩余的囊芯材料可回收利用。
(3)相比较之前报道的先成球后封口的方法，本发明首次提出用复乳模板法制备开孔微球，该方法使用水相制孔，确保了生物兼容性，更加环境友好。达到了与之前报道相同的粒径、孔径水平，且内腔容积更大，更有利于囊芯材料的装载。
(4)本发明选用生物可降解的聚乳酸类作为壳层材料，通过调节制备工艺可以实现对微球粒径和孔径的控制，适用于包埋多种尺度的囊芯材料。
(5)本发明在开发的过程中考虑了放大的需求，乳化和固化都是常规的生产方式，适合大规模生产。
附图说明
图1是开孔微球制备及封口工艺示意图；
图2是实施例1制备的PELA开孔微球的电子显微镜照片；
图3是实施例1制备的PELA开孔微球的光学显微镜照片；
图4是实施例1利用溶剂溶胀法封口后的PELA微囊电子显微镜照片；
图5是实施例2制备的PELA开孔微球的电子显微镜照片；
图6是实施例2制备的PELA开孔微球的光学显微镜照片；
图7是实施例2PELA微囊包埋小分子染料AF488的激光共聚焦及光学显微镜照片；
图8是实施例2利用升温退火法封口后的PELA微囊电子显微镜照片；
图9是实施例3制备的PELA开孔微球的电子显微镜照片；
图10是实施例3制备的PELA开孔微球的光学显微镜照片；
图11是实施例3PELA微囊包埋生物大分子AF488-BSA的激光共聚焦及光学显微镜照片；
图12是实施例3利用红外照射法封口后的PELA微囊电子显微镜照片；
图13是实施例4制备的PLA开孔微球的电子显微镜照片；
图14是实施例4制备的PLA开孔微球的光学显微镜照片；
图15是实施例4利用红外照射法封口后的PLA微囊电子显微镜照片；
图16是实施例5制备的PELA开孔微球的电子显微镜照片；
图17是实施例5制备的PELA开孔微球的光学显微镜照片；
图18是实施例5PELA微囊包埋500nm荧光纳米颗粒的激光共聚焦及光学显微镜照片；
图19是实施例5利用溶剂溶胀法封口后的PELA微囊电子显微镜照片；
图20是实施例6制备的PELA开孔微球的电子显微镜照片；
图21是实施例6制备的PELA开孔微球的光学显微镜照片；
图22是实施例6PELA微囊包埋2μm荧光颗粒的激光共聚焦及光学显微镜照片；
图23是实施例6利用红外照射法封口后的PELA微囊电子显微镜照片；
图24是实施例7制备的PLGA开孔微球的电子显微镜照片；
图25是实施例7制备的PLGA开孔微球的光学显微镜照片；
图26是实施例7利用红外照射法封口后的PLGA微囊电子显微镜照片。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
称取200mg PELA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制1.0％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相；配制2.5％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，再加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为0.5％(w/v)，将其作为外水相。取800μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合10min后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为1-900μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为80μm，如图2、3所示。
将开孔微球的悬浊液加入到重组人生长激素水溶液中，并置于垂直混合器上，在室温下充分混合24h。
配制0.05％PVA(w/v)水溶液30ml，加入15ml乙酸乙酯，在200V超声强度下超声破碎乳化2min；每超声10s，间隔3s。
将500μl装载有重组人生长激素的开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球；随后加满上述乙酸乙酯乳液，置于混合速度为40rpm的垂直混合器上。整个封口过程在室温下进行，20min后取下反应瓶，倒入10ml水中固化，固化时搅拌速度为200rpm，搅拌时间为3min；最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图4所示。
实施例2
称取200mg PELA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制1.5％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制1.0％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为0.5％(w/v)，将其作为外水相。取600μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合20min后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为10-1000μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为40μm，如图5、6所示。
将开孔微球的悬浊液加入到水溶性荧光染料AF488当中，并置于垂直混合器上，在室温下充分混合24h。
将500μl装载有水溶性荧光染料AF488的开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球，加满0.05％PVA(w/v)水溶液，置于混合速度为70rpm滚轴式混合器上，并将混合器放入44℃恒温箱中，15min后取下样品，置于10ml水中固化，固化时搅拌速度为200rpm，搅拌时间为3min；最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图7、8所示。
实施例3
称取200mg PELA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制2.5％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制1.0％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为1.0％(w/v)，将其作为外水相。取600μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合2min后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为20-800μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为60μm，如图9、10所示。
将开孔微球的悬浊液加入到经AF488标记的BSA溶液当中，在室温下置于垂直混合器上充分混合24h所示。
将500μl装载有经AF488标记的BSA的开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球，加满0.05％PVA(w/v)水溶液，置于混合速度为70rpm滚轴式混合器上，上方放置红外灯，调节红外灯与样品距离，使照射到样品的光强为110μmol/m2/s，1h后取下样品，自然冷却至室温。最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图11、12所示。
实施例4
称取100mg PLA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制1.0％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制1.0％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为1.0％(w/v)，将其作为外水相。取800μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合2min后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为30-1000μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为70μm，如图13、14所示。
将500μl开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球，加满0.05％PVA(w/v)水溶液，置于混合速度为70rpm滚轴式混合器上，上方放置红外灯，调节红外灯与样品距离，使照射到样品的光强为130μmol/m2/s，1h后取下样品，自然冷却至室温。最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图15所示。
实施例5
称取50mg PELA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制1.0％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制1.0％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为0.1％(w/v)，将其作为外水相。取700μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合100min后取下，倒入410ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min，进行固化。所得开孔微球粒径为1-900μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为80μm，如图16、17所示。
将开孔微球的悬浊液加入500nm荧光纳米颗粒悬浊液当中，并置于垂直混合器上，在室温下充分混合24h。
配制0.05％PVA(w/v)水溶液30ml，加入15ml乙酸乙酯，在200V超声强度下超声破碎乳化2min；每超声10s，间隔3s。
将500μl装载有500nm荧光纳米颗粒的开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球；随后加满上述乙酸乙酯乳液，置于混合速度为40rpm的垂直混合器上。整个封口过程在室温下进行，35min后取下反应瓶，倒入10ml水中固化，固化时搅拌速度为200rpm，搅拌时间为3min；最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图18、19所示。
实施例6
称取200mg PELA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制2.5％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制3.5％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为1.0％(w/v)，将其作为外水相。取500μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合5h后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为10-600μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为50μm，如图20、21所示。
将开孔微球的悬浊液加入到2μm荧光颗粒悬浊液当中，并置于垂直混合器上，在室温下充分混合24h。
将500μl装载有2μm荧光颗粒的开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球，加满0.05％PVA(w/v)水溶液，置于混合速度为70rpm滚轴式混合器上，上方放置红外灯，调节红外灯与样品距离，使照射到样品的光强为130μmol/m2/s，1h后取下样品，自然冷却至室温。最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图22、23所示。
实施例7
称取200mg PELA置于试管中，加入2ml乙酸乙酯将其溶解，制成油相；配制2.5％NaCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制1.5％PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量乙酸乙酯，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入NaCl，使饱和溶液中NaCl浓度为1.0％(w/v)，将其作为外水相。取500μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合5h后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为10-600μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为50μm，如图24、25所示。
将500μl开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球，加满0.05％PVA(w/v)水溶液，置于混合速度为70rpm滚轴式混合器上，上方放置红外灯，调节红外灯与样品距离，使照射到样品的光强为140μmol/m2/s，1h后取下样品，自然冷却至室温。最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊，如图26所示。
实施例8
称取200mg PLGA置于试管中，加入5ml氯仿将其溶解，制成油相；配制2.5％KCl(w/v)水溶液，作为内水相。配制1.5％十二烷基硫酸钠(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入过量氯仿，摇匀，制成饱和溶液，静置，待分层后取下清液，加入KCl，使饱和溶液中KCl浓度为1.0％(w/v)，将其作为外水相。取500μl内水相加入到油相中，14000rpm均质乳化25s，形成初乳液；将初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均质乳化60s，形成复乳液。
将复乳液装入反应瓶中，垂直混合5h后取下，倒入10ml去离子水中，200rpm磁力搅拌3min，进行预固化；再将预固化产物倒入400ml去离子水中，500rpm磁力搅拌4min。所得开孔微球粒径为10-500μm，过筛洗三次得到最终产物，平均粒径为70μm。
将开孔微球的悬浊液加入到经AF488标记的BSA溶液当中，在40℃下置于超声振荡下充分混合15h所示。
将500μl开孔微球悬浊液，加入到7ml反应瓶中，其中悬浊液浓度为105个/ml开孔微球，加满0.05％十二烷基硫酸钠(w/v)水溶液，置于混合速度为70rpm滚轴式混合器上，采用控温箱加热到微球玻璃化温度以上，保持2小时，自然冷却至室温。最后洗去表面活性剂，得到封口后的微囊。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种生物可降解材料微囊的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制油相，所述油相为聚合物膜材溶液，其中溶剂为有机溶剂；配制内水相溶液和外水相溶液，外水相添加表面活性剂；
(2)将内水相分散到油相当中，形成油包水初乳液；再将初乳液分散到外水相中，形成水包油包水复乳液；
(3)利用溶剂去除法，使油相固化，得到具有内外贯穿孔道的开孔微球；
(4)将开孔微球的悬浊液加入到囊芯材料溶液当中，充分混合，得到已装填具有囊芯材料的开孔微球；
(5)开孔微球的封口，得到聚合物微囊。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述聚合物膜材优选为聚乳酸、聚(乳酸-羟基乙酸)、单甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物中的1种或至少2种的组合；
优选地，步骤(1)中所述有机溶剂为挥发性且不与水互溶的有机溶剂，例如：正丁醇、甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括挥发性且可部分溶于水的有机溶剂，例如乙酸乙酯、苯酚等，进一步优选为不与水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、卤代烷烃、卤代芳烃中的1种或至少2种的组合，特别优选为醇、酯、烷基苯、氯代烷烃、氯代芳烃中的1种或至少2种的组合。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述溶剂去除法优选为溶剂萃取法，也可以是静置使溶剂挥发，或搅拌使溶剂挥发或其他去除溶剂的方法；
步骤(3)所述的具有内外贯穿孔道的开孔微球，为单孔或多孔结构；
优选地，步骤(3)中，使油相固化后，除去残留的表面活性剂，特别优选通过过筛或离心洗涤除去残留的表面活性剂；
步骤(5)所制备的聚合物微囊，为单一内腔或多腔室结构。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述囊芯材料溶液优选包括囊芯材料悬浊液和囊芯材料溶液；
步骤(4)中所述开孔微球悬浊液溶剂为可分散但不溶解微球的溶剂；
优选地，步骤(4)中所述混合温度为40℃以下，进一步优选为30℃以下，特别优选为室温；
优选地，步骤(4)中所述混合时间为15小时以上，进一步优选为20小时以上，更优选为24小时以上，特别优选为24小时。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述开孔微球的封口工艺，包括以下三种方法：
(i)溶剂溶胀法；
(ii)照射法；
(iii)升温退火法。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，方法(i)中所述溶剂溶胀法为：将有机溶剂添加到含有表面活性剂的水溶液中，并使其均匀分散于水相中，将已装填具有囊芯材料的开孔微球加入，充分混合，转移到水溶液中固化，得到封口后的微囊；
优选地，方法(i)中所述有机溶剂为挥发性且不与水互溶的有机溶剂，例如：正丁醇、甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括挥发性且可部分溶于水的有机溶剂，例如乙酸乙酯、苯酚等，进一步优选为不与水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、卤代烷烃、卤代芳烃中的1种或至少2种的组合，特别优选为醇、酯、烷基苯、氯代烷烃、氯代芳烃中的1种或至少2种的组合；
优选地，方法(i)中采用超声、均质或机械搅拌的方法使有机溶剂均匀分散于水相中，特别优选采用超声方法，例如采用超声细胞破碎仪。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，方法(i)中所述混合方式为持续搅拌、超声或震荡，保持微球的悬浮状态，特别优选置于垂直混合器上混合；
优选地，方法(i)中固化后，洗涤，得到封口后的微囊，特别优选采用过筛洗涤；
优选地，方法(i)中所述固化可在静置或搅拌状态下进行。
8.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，方法(ii)中所述照射法为：将载有囊芯材料的开孔微球加入到含有表面活性剂的水溶液中，充分混合，采用紫外线或可见光或红外线光源照射微球悬浊液，一段时间后，降温，得到封口后的微囊；
优选地，方法(ii)中所述混合方式为持续搅拌、超声或震荡，保持微球的悬浮状态，特别优选采用滚轴式混合器；
优选地，方法(ii)中所述照射为红外线照射；
优选地，方法(iii)中所述升温退火法为：将载有囊芯材料的开孔微球加入到含有表面活性剂的水溶液中，混合并升温至微球的玻璃化温度以上，一段时间后，缓慢降温，洗去表面活性剂，得到封口后的微囊；
优选地，方法(iii)中所述混合方式为持续搅拌、超声或震荡，保持微球的悬浮状态，特别优选采用滚轴式混合器；
优选地，方法(iii)中所述升温采用控温箱或微波加热方式。
9.一种如权利要求1-8任一项所述方法制备的生物可降解材料微囊，其特征在于，所述生物可降解材料微囊直径为1-1000微米，胶囊壳层材料为生物可降解材料，为单一内腔或多腔室结构。
10.一种如权利要求9所述的生物可降解材料微囊的用途，其特征在于，所述生物可降解材料微囊可用于包埋小分子、生物大分子物质，还可以装载纳米、微米级尺寸的颗粒。
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