CN102488692A

CN102488692A - 乙酰乳酸合成酶抑制剂化合物作为制备抗真菌药物的应用

Info

Publication number: CN102488692A
Application number: CN2011104245521A
Authority: CN
Inventors: 王建国; 卢克·顾达特; 詹姆斯·弗拉泽; 崔长军; 李正名
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: CN102488692B

Abstract

本发明涉及AHAS抑制剂在制备医用抗真菌药物方面的用途。主要涉及磺酰脲化合物氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、苄嘧磺隆和吡嘧磺隆在制备抗白色念珠菌、新生隐球菌、酿酒酵母菌近平滑假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌等药物方面的应用。该类化合物可以强烈抑制来自真菌的AHAS，并且在细胞水平上对几种能引起感染的真菌有较强的抑制。

Description

乙酰乳酸合成酶抑制剂化合物作为制备抗真菌药物的应用

技术领域

本发明涉及AHAS抑制剂在制备医用抗真菌药物方面的用途，具体涉及磺酰脲类化合物在制备抗白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)和光滑假丝酵母菌(Candida.glabrata)等真菌引起的感染方面的相关药物的应用。

技术背景

当今时代，由各种入侵型真菌引起的感染是影响人类健康的重大问题，如手足癣、妇科尿路及阴道炎、外科手术伤口感染引起的艾滋病等等。目前，医治真菌感染的药剂依赖于类型为数不多的化学药物，如氟康唑为代表的唑类，多烯类抗生素和两性霉素B等等。由于这些抗真菌药物长期使用产生的抗性问题日益明显，发现新的抗真菌药物靶点并据此设计新的有效药物迫在眉睫。

乙酰乳酸合成酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS，E.C.2.2.1.6，也简称为ALS)是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途经的第一个关键酶，该生命过程不存在于哺乳动物体内，因此靶向AHAS的药物对人体具有生物安全性(Duggleby，R.G..，et al.J.Biochem.Mol.Biol.2000，33，1-36)。磺酰脲类除草剂是20世纪70年代开发出来的对环境友好除草剂(US 4127405，US 5160305，US6228808 et al)，数年后人们才发现AHAS是磺酰脲除草剂的靶点，多数磺酰脲除草剂对植物AHAS的抑制常数在8～350纳摩尔之间(Wang，J.G.，et al.J.Comput.-aid Mol.Des.，2005，19，801-820)。磺酰脲除草剂迄今仍然在世界范围内广泛使用。

有研究指出当表达新生隐球菌体内AHAS的基因被敲除以后，在小鼠模型上进行这种真菌的感染没有任何致病性，这些突变菌株因为支链氨基酸的匮乏而死亡(Kingsbury，J.M.et al.Microbiology.2004，150，1547-1558)。当白色念珠菌体内的AHAS基因也被突变后，变异菌株在致病性方面就大大减弱，当支链氨基酸去除四个小时后，其生存能力降低了100倍(Kingsbury，J.M.et al.Microbiology.2010，156，929-939)。

尽管磺酰脲等化合物对酵母AHAS有很强的抑制活性，但是至今并没有该类化合物对隐球菌和白色念珠菌AHAS的抑制活性效果报道，并且也没有这些化合物在细胞水平上对这些真菌抑制效果的系统研究。

对磺酰脲等AHAS抑制剂的抗真菌活性深入研究将有助于设计发明作用机理新颖的医用抗真菌药物组合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙酰乳酸合成酶AHAS抑制剂化合物磺酰脲类化合物在抗真菌感染方面的应用。该类化合物可以强烈抑制来自真菌的AHAS，并且在细胞水平上对几种能引起感染的真菌有较强的抑制。

本发明提供了一种乙酰乳酸合成酶AHAS抑制剂磺酰脲类化合物在抗真菌感染方面的应用。

本发明提供的磺酰脲化合物为氯嘧磺隆(chlorimuron ethyl)，乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、苄嘧磺隆(bensulfuron methyl)、吡嘧磺隆(pyrazosulfuron ethyl)以及它们的医用盐，其结构式如下：

氯嘧磺隆苄嘧磺隆

乙氧嘧磺隆吡嘧磺隆

磺酰脲化合物均参考文献合成，分别为氯嘧磺隆(王文芳等，化学世界，2002，43(1)，35-36)，苄嘧磺隆(王岩等，化学世界，2008，49(11)，685-687)、乙氧嘧磺隆(EP 560178)和吡嘧磺隆(刘新河等，农药，2000，39(12)，14-15)。

本发明还提供一种用于治疗人或动物真菌感染的药物，特别是白色念珠菌(Candidaalbicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)和光滑假丝酵母菌(Candida.glabrata)，向真菌或其环境应用有效量的乙酰乳酸合成酶(AHAS)抑制剂，以此杀死真菌或控制真菌生长。该药物可含有上述的磺酰脲化合物以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂以及增效剂等。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮，静脉或肌肉注射，用于治疗人或动物真菌感染。

本发明提供的一种乙酰乳酸合成酶AHAS抑制剂化合物磺酰脲类化合物在抗真菌感染方面的应用。该类化合物可以强烈抑制来自真菌的AHAS，并且在细胞水平上对几种能引起感染的真菌有较强的抑制。

附图说明

图1是氯嘧磺隆对三种真菌AHAS的抑制曲线。图中

代表白色念珠菌AHAS的效果，□代表酵母菌AHAS的效果，●代表隐球菌AHAS的效果。

图2是氯嘧磺隆对白色念珠菌生长抑制的效果图。图中CE代表氯嘧磺隆，显示的是采用纸片扩散法24h的效果。

具体实施方式

本发明实质性特点可以从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不是对本发明进行限制。

实施例1.氯嘧磺隆的制备

100mL四口反应瓶中加入碳酸钾8g、水、丙酮14mL、邻乙氧羰基苯磺酰胺4.7g(0.02mol)，搅拌成糊状降温至5℃，滴加氯甲酸甲酯2.8g，0.5h滴毕后，自然升温，20℃反应2h以上。加入水50mL，溶解物料，然后用浓盐酸约8mL调pH值至2左右，过滤析出的白色固体，晾干得白色粉状产物邻乙氧羰基苯磺酰胺基甲酸甲酯5.7g。

100mL四口瓶配上精馏柱，加入2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶4.3g(0.025mol)、邻乙氧羰基苯磺酰胺甲酸甲酯7.3g(0.025mol)、甲苯50mL。搅拌，加热，塔顶出馏分后，同时补加新鲜甲苯30mL至全过程。维持内温108-113℃，8h反应结束，分出馏分20-30mL。降至室温，过滤析出的淡黄色固体，干燥得氯嘧磺隆9.0g。mp：182～184℃，收率82.5％。粗品经过产品用丙酮与二甲基亚砜混合溶剂重结晶，得纯品7.5g。

同样，可以合成苄嘧磺隆、乙氧嘧磺隆和吡嘧磺隆。

实施例2.对酿酒酵母菌AHAS抑制常数K₁的测定

酵母菌AHAS催化亚基的基因(pET-YLSU)由大肠杆菌(BL21(DE3))超量表达，通过固定金属亲和色谱IMAC纯化后得纯AHAS(Pang S.S.，et al.Biochemistry，1999，38，5222-5231)。测定活性时，反应液pH值为7.0，体积为250μL，含有50mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲体系，50mM的丙酮酸钠，10mM的氯化镁，1mM的二磷酸硫胺，10μM的黄素腺嘌呤二核苷酸，不同浓度的待测化合物，反应在30℃下引发20min，加入25μL 10％的H₂SO₄停止反应。将体系在60℃中加热15min，使生成的乙酰乳酸全部转化成3-羟基-2-丁酮，然后加入250μL0.5％的肌酸和250μL5％的α-萘酚(溶解在4M的NaOH中)，在60℃中再加热15min，读取525nM的吸光度。

抑制常数K_i测定时，对于每一个化合物，都要进行一个大区间和一个小区间下多种浓度同时测定，才能够进行表观抑制常数的计算。具体做法为：首先将化合物在实际反应体系中的浓度设定在1×10^-4M，3×10^-5M，1×10^-5M......1×10^-8M，3×10^-9M，1×10^-9M，找到抑制区间可能出现的范围，然后在一个较小的浓度范围内(如0，1×10^-7M，1.5×10^-7M，2×10^-7M，3×10^-7M，5×10^-7M，7×10^-7M，1×10^-6M，1.5×10^-6M，2×10^-6M，3×10^-6M，5×10^-6M。每个平行3次)测定抑制常数K_i。

抑制常数由以下公式计算得出

V = \frac{V_{\max}}{1 + [I] / K_{i}}

其中，V_max代表AHAS酶未被抑制时的最大催化反应速率，[I]代表化合物的浓度，V则代表反应速率。

同样，可表达、纯化白色念珠菌和新生隐球菌AHAS并测定化合物的抑制常数K_i。

化合物对真菌AHAS的抑制见表1.

实施例3.化合物对白色念珠菌最小抑制浓度MIC₅₀的测定

实验中采用的几种真菌由澳大利亚昆士兰大学澳洲感染疾病研究中心提供，其代号分别为白色念珠菌(ATCC 90028)、新生隐球菌(ATCC 90113)、酿酒酵母菌(Sigma 1278b)、近平滑假丝酵母菌(ATCC 22019)和光滑假丝酵母(PAT 21SO3)。测试化合物为氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、苄嘧磺隆、吡嘧磺隆和对照药氟康唑。

首先通过纸片扩散法来初步测定磺酰脲化合物的抗真菌活性。将10μL 1nM的待测化合物置于接种板上，在35℃下培养24h，48h和72h，读取抑制带(inhibition zone)。

再采用肉汤稀释法测定磺酰脲化合物对白色念珠菌的最小抑制浓度MIC₅₀(Ghannoum，M.A.et.Al.J.Clin.Microbiol.1992，30，2881-2886)。以无菌DMSO为溶剂配制化合物母液，使之在YNB(Yeast Nitrogen Base without Amino Acids)培养基中的最终浓度为0.000195mM至1mM之间的系列浓度。YNB培养基加入终浓度为0.5％的葡萄糖和100mM的硫酸铵。从培养48h的培养皿上挑取1个真菌株于5mL的除菌水当中，在530nm下测量浑浊度，采用0.5％麦氏标准管将浊度调制1×10⁶～5×10⁶CFU/mL，然后接种液的浊度用YNB培养基稀释至约10⁴CFU/mL，96孔板在35℃下培养72h。分别在24h、48h和72h读取浊度值，抑制真菌50％生长的浓度得以计算。每个浓度平行测定三次。

同样，可以测定化合物对酿酒酵母菌、新生隐球菌、近平滑假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的最小半数抑制浓度MIC₅₀。

化合物对三种真菌的最小半数抑制浓度MIC₅₀见表2。可以看出，氯嘧磺隆和乙氧嘧磺隆对白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的活性和氟康唑相当。

表1.磺酰脲化合物对三种真菌AHAS的抑制常数K_i值(nM)

化合物	白色念珠菌AHAS	新生隐球菌AHAS	酿酒酵母菌AHAS
				氯嘧磺隆	7±1	107.8±20.6	3.3^a
乙氧嘧磺隆	20±2	Ni^b	64±14
				苄嘧磺隆	31±4	NI	4.4±2
吡嘧磺隆	66±8	250900±29170	32±7

^a来自参考文献Pang，S.S.；Duggleby，R.G.；Guddat，L.W.Crystal structure of yeast acetohydroxyacidsynthase：A target for herbicidal inhibitors.J.Mol.Biol.2002，317，249-262.

^bNI＝没有抑制(No inhibition)。

表2.磺酰脲化合物对五种真菌的最小抑制浓度MIC₅₀值(μM)

Claims

1.一种乙酰乳酸合成酶AHAS抑制剂化合物作为制备抗真菌药物的应用，其特征在于所述的乙酰乳酸合成酶化合物是有效量的磺酰脲化合物，或其医用盐。

2.如权利要求1所述的作为制备抗真菌药物的应用，其特征在于所述的AHAS抑制剂化合物为氯嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、苄嘧磺隆或吡嘧磺隆。

3.如权利要求1所述的作为制备抗真菌药物的应用，其特征在于所述的真菌为白色念珠菌、新生隐球菌、酿酒酵母菌、近平滑假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌。

4.如权利要求1所述的作为制备抗真菌药物的应用，其特征在于所述的抗真菌药物为用于治疗真菌感染的药物制剂。

5.如权利要求4所述的作为制备抗真菌药物的应用，其特征在于所述的磺酰脲化合物在抗真菌药物制剂的有效浓度为0.9-62μM。