CN102485750A - 植物抗氧化相关蛋白SsOEP8及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗氧化相关蛋白SsOEP8及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗氧化相关的由序列1衍生的蛋白质。SsOEP8是一个氧化胁迫相关蛋白，通过调控叶绿体的位移控制细胞内ROS的产生，从而在植物抗氧化胁迫过程中起重要作用。本发明不仅为研究SsOEP8在植物抗氧化胁迫过程中的作用奠定了基础，而且可能为利用基因工程方法提高作物耐逆能力从而增加土地利用率提供一种新的目标基因。

Description

植物抗氧化相关蛋白SsOEP8及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物抗氧化相关蛋白SsOEP8及其编码基因和应用。 

背景技术

盐碱、干旱、极端温度等非生物胁迫是严重影响植物生长和发育造成农作物减产的主要因素。这些胁迫会引发细胞内超氧化物(ROS)的大量积累从而给植物带来次级氧化胁迫。在正常情况下，一定浓度的ROS对于植物的生长发育、激素信号转导、生物及非生物胁迫的应答反应等过程有重要的调控作用。然而在植物受到外界胁迫后，ROS的过量积累会导致脂膜的氧化、DNA及蛋白质的氧化、酶活性的抑制和引发细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)等(Mittler R(2002)Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance.Trends in Plant Science 7：405-410)。因此，控制细胞体内ROS的含量使之保持在正常水平对于植物的生长发育具有重大意义。 

虽然植物耐逆的分子生物学研究已经取得了重要进展，但已有研究结果大多是以拟南芥等非盐生植物为实验材料，而这些植物中可能不存在那些决定高度耐逆性的关键基因，故不足以用于全面解析植物耐逆的分子机理。碱蓬(Suaeda salsa)是一种具有高度耐盐碱能力的真盐生植物，是研究植物耐逆机理的模式植物，主要分布在我国北部和沿海地区的盐碱地、荒漠、海滨、湖边等处，是我国最重要的盐生植物之一。由于碱蓬具有高度的耐逆能力和改良土质的能力，其耐逆机制的研究逐渐受到人们的重视。在分子水平上，抗氧化相关基因的研究是探索碱蓬耐逆机理的研究重点之一。赵凤云等(Zhao FY，Wang XY，Zhao YX，and Zhang H(2006)[Transferring the Suaedasalsa glutathione S-transferase and catalase genes enhances low temperaturestress resistance in transgenic rice seedlings].Zhi wu sheng li yu fen zi shengwu xue xue bao＝Journal of plant physiology and molecular biology 32，231-238.)将盐地碱蓬中编码谷胱甘肽转移酶(GST)的单基因以及编码谷胱甘肽转移酶和过氧化氢酶(GST+CAT1)的双基因分别转入低温敏感水稻品种“中花11号”中，发现GST和GST+CAT1的表达提高了转基因水稻对低温胁迫的抗性。发明人所在实验室利用酵母体系从碱蓬cDNA文库中筛选出多个耐逆相关基因，其中SsTYPA1的表达受氧化胁迫的诱导，其过量表达能显著提高转基因烟草悬浮细胞和转基因烟草植株的抗氧化能力(Wang F，Zhong NQ，Gao P，Wang GL，Wang HY，Xia GX(2008)SsTypA1，a chloroplast-specific TypA/BipA-type GTPase from the halophytic plant Suaedasalsa，plays a role in oxidative stress tolerance.Plant Cell and Environment31：982-994)。另外，碱蓬中还含有一些高效的非酶类抗氧化物质，如甜菜红素。研究发现，甜菜红素的表达受各种非生物胁迫的诱导，在碱蓬中耐逆过程中起重要作用(Wang CQ，Zhao JQ，Chen M，and Wang BS(2006)Identification of betacyanin andeffects of environmental factors on its accumulation in halophyte Suaeda salsa.Zhi wu sheng li yu fen zi sheng wu xue xue bao＝Journal of plant physiologyand molecular biology 32，195-201.)。这些研究结果说明，碱蓬很可能通过高效的抗氧化体系抵御其生长环境中的高盐、强碱、强光照和干旱等多种逆境的胁迫。 

叶绿体外被膜蛋白(outer envelope protein，OEP)是一类分布在叶绿体外被膜上的蛋白。其重要功能是调控叶绿体蛋白的转运、溶质的扩散和膜脂的代谢(Inoue K(2007)The chloroplast outer envelope membrane：The edge of light andexcitement.Journal of Integrative Plant Biology 49：1100-1111)。最近的研究表明，叶绿体外被膜蛋白还在质体的分裂(Miyagishima SY，Froehlich JE，OsteryoungKW(2006)PDV1 and PDV2 mediate recruitment of the dynamin-related protein ARC5to the plastid division site.Plant Cell 18：2517-2530)、叶绿体的位移(OikawaK，Kasahara M，Kiyosue T，Kagawa T，Suetsugu N，Takahashi F，Kanegae T，NiwaY，Kadota A，Wada M(2003)Chloroplast unusual positioning1 is essential forproper chloroplast positioning.Plant Cell 15：2805-2815)以及植物抗低温胁迫(Fourrier N，Bedard J，Lopez-Juez E，Barbrook A，Bowyer J，Jarvis P，WarrenG，Thorlby G(2008)A role for SENSITIVE TO FREEZING2 in protecting chloroplastsagainst freeze-induced damage in Arabidopsis.Plant J 55：734-745)的过程中起关键作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗氧化相关蛋白SsOEP8及其编码基因和应用。 

本发明提供的蛋白，是新的叶绿体外被膜蛋白，获自盐地碱蓬(Suaeda salsa)，命名为SsOEP8，是如下(a)或(b)： 

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 

(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗氧化相关的由序列1衍生的蛋白质。 

为了使(a)中的SsOEP8便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸 序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 

表1标签的序列 

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的SsOEP8可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的SsOEP8的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。 

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。 

所述基因可为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子： 

(1)序列表中序列2自5’末端第93至320位核苷酸所示的DNA分子； 

(2)序列表中序列2自5’末端第93至323位核苷酸所示的DNA分子； 

(3)序列表中序列2所示的DNA分子； 

(4)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物抗氧化相关蛋白的DNA分子； 

(5)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物抗氧化相关蛋白的DNA分子。 

所述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。 

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。 

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本 发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。 

所述重组载体具体可为将所述基因插入载体pPZP-GFP的多克隆位点得到的重组质粒(重组表达载体)。 

扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。 

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到抗氧化能力高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥。 

所述抗氧化能力可表现为如下(I)、(II)、(III)和(IV)中的至少一种： 

(I)在氧化胁迫下所述转基因植株的根的伸长量高于所述目的植物； 

(II)在氧化胁迫下所述转基因植株的鲜重高于所述目的植物； 

(III)在氧化胁迫下所述转基因植株的叶绿素含量高于所述目的植物； 

(IV)在氧化胁迫下所述转基因植株的H₂O₂增加量低于所述目的植物。 

所述氧化胁迫具体可为甲基紫晶(MV)引起的氧化胁迫。 

利用基因特异性探针进行Real-time PCR分析，发现SsOEP8基因特异地受到强氧化剂甲基紫晶(methyl viologen)和过氧化氢(H₂O₂)诱导，而不受NaCl、LiCl、甘露醇的诱导，表明该基因可能在植物抗氧化胁迫过程中起重要作用。把SsOEP8-GFP转入拟南芥中稳定表达并用荧光显微镜观察发现，融合蛋白定位于叶肉细胞的叶绿体被膜上。过量表达SsOEP8可以显著提高烟草BY-2细胞和拟南芥的抗氧化能力。氧化胁迫后，转基因植株在根的伸长、植株鲜重和叶绿素含量等方面均明显高于野生型，同时转基因拟南芥叶片中的H₂O₂含量明显减少。叶绿体在受到外界胁迫的情况下会发生位置的改变从而通过影响光的吸收调节细胞内ROS的产生(Wada M，Kagawa T，Sato Y(2003)Chloroplast movement.Annual Review of Plant Biology 54：455-468)。为了进一步研究SsOEP8的作用机理，对野生型和转基因拟南芥叶肉细胞进行显微镜观察发现，转基因细胞中的叶绿体发生了明显的聚集，其聚集程度与SsOEP8的表达量成正相关。Real-time PCR分析结果表明，在转基因植物中，几个调控叶绿体位移的重要基因CHUP1、PHOT1和PHOT2的表达都受到了抑制，此外几个氧化胁迫相关基因，如Pad3和POX的表达量都有所提高。这些结果说明，SsOEP8有可能通过影响叶绿体的位移，降低植物在胁迫状态下ROS的产生，从而提高植株的抗氧化能力。 

SsOEP8是一个氧化胁迫相关蛋白，通过调控叶绿体的位移控制细胞内ROS的产生，从而在植物抗氧化胁迫过程中起重要作用。该基因可能作为一种新型目的基因，应用于作物抗逆基因工程。本发明不仅为研究SsOEP8在植物抗氧化胁迫过程中的作用奠定了基础，而且可能为利用基因工程方法提高作物耐逆能力从而增加土地利用率提供一种新的目标基因。 

附图说明

图1为SsOEP8基因氧化胁迫应答分析；纵坐标表示诱导后的表达量和诱导前的表达量的比值(诱导后/诱导前，单位为“倍数”)；横坐标表示两种处理的取样时间(单位为“小时”)；该结果为三次独立实验的平均值。 

图2为野生型和转基因细胞抗氧化能力的检测；(a)SsOEP8-GFP的表达水平分析；(b)野生型和转基因细胞在液体培养基中的抗氧化能力分析；(c)野生型和转基因细胞在固体培养基中的抗氧化能力分析。 

图3为野生型和转基因拟南芥抗氧化能力的检测；(a)野生型和转基因拟南芥氧化胁迫后的表形分析；(b)SsOEP8-GFP的表达水平分析；(c)根的伸长量；(d)植株鲜重；(e)叶绿素含量；(f)H₂O₂染色分析。 

图4为野生型和转基因拟南芥叶肉细胞的显微镜观察。 

图5为叶绿体位移和氧化胁迫相关基因在野生型和转基因拟南芥中的表达分析。 

图6为SsOEP8-GFP在叶肉细胞中的亚细胞定位；分别用20×(a，b，c)、63×(d，e，f)、100×(g，h，i)的物镜观察转基因拟南芥叶片；(a，d，g)为SsOEP8-GFP绿色荧光；(b，e，h)为叶绿素自发荧光；(c，f，i)为共定位。 

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。 

实施例中所用的碱蓬均为碱蓬属盐地碱蓬(Suaeda salsa)；参考文献：Wang B，Luttge U，Ratajczak R(2001)Effects of salt treatment and osmotic stress onV-ATPase and V-PPase in leaves of the halophyte Suaeda salsa.J Exp Bot 52：2355-2365。 

烟草BY-2细胞；参考文献：Nakayama H，Yoshida K，Ono H，Murooka Y，ShinmyoA(2000)Ectoine，the compatible solute of Halomonas elongata，confershyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells.Plant Physiology 122：1239-1247。 

载体pPZP-GFP；参考文献：Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The Small，Versatile Ppzp Family of Agrobacterium Binary Vectors for Plant Transformation.Plant Molecular Biology 25：989-994。 

甲基紫晶(MV)：sigma-aldrich，货号856177。 

哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia ecotype Arabidopsis thaliana，col-0)：购自英国Nottingham.Arabidopsis Stock Centre。 

实施例1、植物耐逆相关蛋白SsOEP8及其编码基因的发现 

利用酵母体系从盐地碱蓬(Suaeda salsa)中筛选出一个8.4kDa的耐逆性相关蛋白，如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。 

将序列1所示的蛋白质命名为SsOEP8蛋白，由76个氨基酸残基组成。将SsOEP8蛋白的编码基因命名为SsOEP8基因，其开放阅读框如序列表的序列2自5’末端第93至323位核苷酸所示。 

实施例2、SsOEP8基因的表达分析 

五周大的盐地碱蓬(Suaeda salsa)小苗用20mM过氧化氢(H₂O₂)处理0、4、8、16、24小时；五周大的盐地碱蓬(Suaeda salsa)小苗用20μM甲基紫晶(MV)处理0、4、8、16小时；分别提取总RNA进行SsOEP8基因表达量分析。Real-Time PCR反应使用TOYOBO公司的RealTime PCR Master Mix试剂盒，并按照说明进行操作。碱蓬Actin基因为内标。 

结果见图1。SsOEP8基因特异地受到甲基紫晶和过氧化氢诱导，表明该基因可能在植物抗氧化胁迫过程中起重要作用。 

实施例3、转基因细胞系和转基因植物的获得和鉴定 

NT培养基(pH5.8)：每升培养基中含MS盐4.3g，KH₂PO₄ 200mg，维生素B1(Thiamin)1mg，肌醇(inositol)100mg，2，4-D 0.2mg，甘氨酸(Glycine)2mg，蔗糖30g。 

NT筛选培养基：NT培养基+卡那霉素(Km)100mg/l+羧苄青霉素(Crb)200mg/l。 

一、重组表达载体的构建 

1、SsOEP8基因的克隆 

提取盐地碱蓬(Suaeda salsa)的RNA，将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，用Primer-F和Primer-R进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收250bp左右的目的片段(序列表中序列2自5’末端第93至320位核苷酸所示的SsOEP8基因)。 

Primer-F：5’-CGGGATCCGAGCTCATGAAGAAAGAAGCAACA-3’(下划线标注BamHI酶切识别位点)； 

Primer-R：5’-TCCCCGCGGCCACCTCTAGAAGAACGTTGTTGATCATC-3’(下划线标注SacII酶切识别位点)。 

PCR扩增体系(50μl)：cDNA 1μl，10×buffer 5μl，dNTP(10mM)1μl，Primer-F1μl，Primer-R 1μl，Pfu DNA Polymerase(TaKaRa)1μl，ddH₂O 40μl。 

PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10m。 

2、重组表达载体的构建 

①用限制性内切酶BamH I和Sac II双酶切步骤1的目的片段，回收酶切产物。 

②用限制性内切酶BamH I和Sac II双酶切载体pPZP-GFP，回收载体骨架。 

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒(骨架载体为pPZP-GFP，在BamHI和Sac II酶切位点之间插入了序列表中序列2自5’末端第93至320位核苷酸所示的SsOEP8基因，SsOEP8基因与骨架载体上的GFP编码基因融合，表达SsOEP8-GFP融合蛋白)。 

二、转基因细胞系的获得和鉴定 

1、转基因细胞系的获得 

(1)将步骤一得到的重组质粒转化农杆菌LBA4404(鼎国MCC026)，得到重组农杆菌；将重组农杆菌单菌落接到5ml LB培养基中28℃培养至OD600＝0.8左右(36-48小时)，即为重组农杆菌菌液； 

(2)取10ml培养4-6天的烟草BY-2悬浮细胞液，转入100ml无菌三角瓶中； 

(3)离心收集菌体，用20mlLB液体培养基重悬，每瓶BY-2悬浮细胞液加1ml重组农杆菌菌液，摇匀，静置4小时，然后再加10ml新鲜的LB液体培养基，28℃摇床中暗培养28-36小时； 

(4)离心收集细胞，吸出上清，再加入新鲜的NT液体培养基重悬，洗1次，最后挑取少许细胞至固体NT筛选培养基上，用液体NT培养基将其稀释均匀铺在板上，吸去多余的液体； 

(5)细胞28℃避光培养至有抗卡那霉素团块出现，用镊子挑取抗卡那霉素的细胞团块至新培养基中继代培养。 

得到转基因细胞系，随机选取两个细胞系(OEP8-2、OEP8-4)进行抗氧化能力检测。 

2、转空载体细胞系的获得 

用载体pPZP-GFP转化烟草BY-2细胞，得到转空载体细胞系，作为转基因细胞系的对照，进行抗氧化能力检测。 

3、Western杂交鉴定 

分别提取烟草BY-2细胞(WT)、OEP8-2细胞和OEP8-4细胞的粗蛋白，进行Western杂交鉴定。一抗为兔抗GFP(1∶1000)中，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1∶5000)。 

结果见图2a。OEP8-2细胞和OEP8-4细胞中均有目标蛋白(SsOEP8-GFP融合蛋白)生成。 

4、抗氧化能力的检测 

将两个转基因细胞系(OEP8-2、OEP8-4)、转空载体细胞系和烟草BY-2细胞(野生型)分别进行如下检测：取指数生长期的细胞，沉淀后用NT液体培养基稀释至50％(体积百分含量)，取200微升加入10毫升含100μM甲基紫晶的NT液体培养基，28℃摇床中暗培养20小时；用FDA荧光染料进行活细胞染色(Nakayama H，Yoshi da K，Ono H，Murooka Y，Shinmyo A(2000)Ectoine，the compatible solute of Halomonaselongata，confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco cells.PlantPhysiology 122：1239-1247)；染色后在荧光显微镜下观察、照相并通过计数器计算活细胞百分比。激发波长为480nm。结果见图2b。野生型细胞和转空载体细胞只有很少量存活；但转基因细胞系的存活率能达到70％以上。 

将两个转基因细胞系(OEP8-2、OEP8-4)和烟草BY-2细胞(野生型，WT)分别进 行如下检测：取指数生长期的细胞，用NT液体培养基稀释至50％(体积百分含量)，分别取30μl滴在含20μM甲基紫晶的NT固体培养基和NT固体培养基上，28℃暗培养2周。结果见图2c，烟草BY-2细胞(野生型)的生长受到MV的严重抑制，而两个转基因细胞系的细胞却能够正常生长。 

三、转基因植物的获得和鉴定 

1、重组农杆菌的获得 

用步骤一得到的重组质粒转化农杆菌LBA4404(鼎国MCC026)，得到重组农杆菌。 

2、转基因拟南芥的获得 

然后利用重组农杆菌，通过花浸泡法(Clough，S.J.，and Bent，A.F.(1998).Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J 16，735-743.)将SsOEP8基因导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T1代种子。 

T1代种子收获后在MS培养基(含有50mg/L卡那霉素)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子。 

将T2代种子培育为植株(T2代植株)，提取叶片的RNA，反转录为cDNA，用Primer-F和Primer-R进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即为T2代转基因植株。 

T2代转基因植株自交产生T3代种子。随机选取两个转基因植株株系(OEP8-3、OEP8-1)的T3代种子进行步骤4的鉴定。 

3、转空载体植株的获得 

用出发质粒代替重组质粒，其它同步骤2，得到转空载体植株的T3代种子，作为转基因植株T3代种子的对照。 

4、Western杂交鉴定 

分别提取两个转基因植株株系(OEP8-3、OEP8-1)的T3代植株和野生型拟南芥(WT)的粗蛋白，进行Western杂交鉴定。一抗为兔抗GFP(1∶1000)中，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG(1∶5000)。 

结果见图3b。OEP8-3、OEP8-1中均有目标蛋白(SsOEP8-GFP融合蛋白)生成。 

5、抗氧化能力鉴定 

两个转基因植株株系(OEP8-3、OEP8-1)的T3代植种子(每个株系50粒)，转空载体植株的T3代植种子(50粒)，野生型拟南芥(WT)的种子(50粒)，分别进行如下抗氧化能力鉴定：将各个株系植株的种子同时播种在MS培养基平板上；萌发6天后将幼苗等分为两组，第一组继续在MS培养基平板上培养28天，第二组转移到含 有1μM甲基紫晶的MS培养基平板上胁迫处理7天再移至MS培养基平板上恢复21天；观察拍照(第二组的表型见图3a)，测量植株的根长(见图3c，纵坐标指的是该株系第二组比第一组的值)、鲜重(见图3d，纵坐标指的是该株系第二组比第一组的值)和叶绿素含量(Chla+Chlb)(见图3e，纵坐标指的是该株系第二组比第一组的值)。 

叶绿素含量的检测方法 

①取新鲜的植物叶片，擦除其表面的污物，剪碎后混匀。 

②称取剪碎的新鲜样品0.1克，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 80％丙酮，研成匀浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白，静置3分钟。 

③取滤纸1张，置漏斗中，用丙酮湿润，沿玻璃棒把提取液转移到漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，最后定容到25ml容量瓶中。 

④将叶绿素提取液转移到比色杯中，以80％丙酮为空白，分别在波长663nm、646nm、470nm测定其光吸收。 

⑤计算叶绿素含量，公式如下： 

Chla＝12.21D₆₆₃-2.81D₆₄₆；Chlb＝20.13D₆₄₆-5.03D₆₆₃。 

第一组中：OEP8-3的叶绿色含量为6193微克/克(鲜重)，OEP8-1的叶绿色含量为5707微克/克(鲜重)，野生型拟南芥的叶绿色含量为5910微克/克(鲜重)。第二组中：OEP8-3的叶绿色含量为2644微克/克(鲜重)，OEP8-1的叶绿色含量为3065微克/克(鲜重)，野生型拟南芥的叶绿色含量为1085微克/克(鲜重)。 

第一组中：OEP8-3的鲜重为0.0367g/株，OEP8-1的鲜重为0.0373g/株，野生型拟南芥的鲜重为0.0395g/株。第二组中：OEP8-3的鲜重为0.0070g/株，OEP8-1的鲜重为0.0170g/株，野生型拟南芥的鲜重为0.0045g/株。 

第一组中：OEP8-3的根的伸长量为62.5毫米，OEP8-1的根的伸长量为69毫米，野生型拟南芥的根的伸长量为68毫米。第二组中：OEP8-3的根的伸长量为5.75毫米，OEP8-1的根的伸长量为11.875毫米，野生型拟南芥的根的伸长量为1.375毫米。 

与第一组(未胁迫处理的对照)相比，第二组转基因植株根的伸长量、植株鲜重和叶绿素含量明显高于野生型，野生型植株和转空载体植株没有显著差异。植株的抗氧化能力与SsOEP8的表达量成正相关。这些结果表明，SsOEP8的过量表达可以抑制胁迫导致的叶绿体中ROS的大量积累，从而提高转基因植株的抗氧化能力。 

6、H₂O₂的含量 

用DAB染色的方法检测未胁迫和胁迫后的野生型和转基因烟草叶片中H₂O₂的含量， 两个转基因植株株系(OEP8-3、OEP8-1)的T3代植种子(每个株系50粒)，转空载体植株的T3代植种子(50粒)，野生型拟南芥(WT)的种子(50粒)，分别进行H₂O₂的含量测定：将各个株系植株的种子同时播种在MS培养基平板上；萌发6天后将幼苗等分为两组，第一组(未胁迫)继续在MS培养基平板上培养过夜，第二组(胁迫后)转移到含有10μM甲基紫晶的MS培养基平板上培养过夜；通过DAB染色进行H₂O₂的含量测定。 

DAB染色的方法： 

①取2周大的小苗，置于小烧杯中，用ddH₂O清洗3次； 

②再浸泡于DAB染色液(DAB 1mg/ml，50mM TB缓冲液配制/pH 7.6)中，暗处理24小时； 

③把染色后的小苗切分成根、茎和叶，用固定液(4％甲醛和0.25％戊二醛，0.01M磷酸缓冲液配制)4℃固定过夜； 

④乙醇系列脱水后包埋于树脂(Leica)中，用薄片切片机(Leica)切片； 

⑤显微镜观察、照相。 

结果见图3f。未胁迫处理的野生型和转基因植株叶片中H₂O₂的含量都很低，MV处理过夜后所有叶片中的H₂O₂含量都有所增加，但是转基因植株叶片中H₂O₂增加的幅度比野生型叶片中的小得多，野生型植株和转空载体植株没有显著差异。 

7、转基因拟南芥叶绿体位置的变化 

由于植物可以通过改变叶绿体的位移调节光吸收从而控制ROS的产生，所以对野生型和转基因拟南芥的叶肉细胞进行了显微镜观察。观察发现，转基因细胞中的叶绿体发生了明显的聚集(图4)。而且Real-time PCR结果表明，在转基因植物中，几个调控叶绿体位移的重要基因CHUP1、PHOT1和PHOT2的表达都受到了抑制，此外几个氧化胁迫相关基因，如Pad3和POX的表达量都有所提高(图5)。这说明SsOEP8的过量表达可能通过调控叶绿体在细胞中的位置从而降低ROS的含量。 

实施例4、SsOEP8的亚细胞定位分析 

为研究SsOEP8蛋白的亚细胞定位，将实施例3的步骤一构建的重组质粒用农杆菌滴花转化法转化至拟南芥植株中，并用confocal荧光显微镜进行观察。GFP的激发波长为488nm，叶绿素自发荧光的激发波长为543nm。通过观察转基因植株的叶片可以看到，SsOEP8-GFP特异的定位在叶绿体膜上(见图6)。 

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗氧化相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2自5’末端第93至320位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2自5’末端第93至323位核苷酸所示的DNA分子；

(3)序列表中序列2所示的DNA分子；

(4)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物抗氧化相关蛋白的DNA分子；

(5)与(1)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码植物抗氧化相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求2或3所述基因插入载体pPZP-GFP的多克隆位点得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到抗氧化能力高于所述目的植物的转基因植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组载体导入所述目的植物中。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抗氧化能力表现为如下(I)、(II)、(III)和(IV)中的至少一种：

(I)在氧化胁迫下所述转基因植株的根的伸长量高于所述目的植物；

(II)在氧化胁迫下所述转基因植株的鲜重高于所述目的植物；

(III)在氧化胁迫下所述转基因植株的叶绿素含量高于所述目的植物；

(IV)在氧化胁迫下所述转基因植株的H₂O₂增加量低于所述目的植物。

10.如权利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。

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