CN102481256B - 包含亚氨基脂质的两性脂质体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂质装配体，具有包含阴离子部分和阳离子部分的混合物的外表面的脂质体；其中所述阳离子部分的至少一部分为在生理条件下基本上带电荷的亚氨基部分，及其在细胞的抗血清转染中的应用。

Description

包含亚氨基脂质的两性脂质体
技术领域
本发明涉及能够克服脂蛋白介导的摄取阻滞的脂质装配体(assembly)或脂质体。更具体地，本发明涉及脂质体或其衍生物在各极性区域的改善，所述脂质体既包含具有羧酸或磷酸头基的带负电荷的脂质也包含具有亚氨基或胍基的带正电荷的脂质。
背景技术
脂质体作为活性成分的载体具有广泛的应用。中性的或带负电荷的脂质体通常用于小分子药物的递送，而带正电荷的(阳离子)或近期引进的两性类脂质体主要用于核酸例如质粒或寡核苷酸的递送。用于递送核酸“货物”的阳离子脂质体的重要实例包括但不限于Semple等，Nat.Biotech.(2010)28：172-176；Akinc等，Nat.Biotech.(2008)26：561-569；Chien等，Cancer GeneTher.(2005)12：321-328；de Fougerolles，Nat.Rev.Drug Discov.(2007)6：443-453；Kim等，Mol.Ther.(2006)14：343-350；Morrissey，Nat.Biotech.(2005)23：1002-1007；Peer，Science(2008)319：627-630和Santel，Gene Ther.(2006)13：1222-1234。两性脂质体用于递送核酸的应用已在Andreakos等，Arthritis Rheum.(2009)60：994-1005中证明。
两性脂质体属于较大一类的pH敏感性脂质体，该类还包括pH-敏感性阴离子或阳离子脂质体，其原型已示于Lai等，Biochemistry(1985)24：1654-1661和Budker等，Nat.Biotech.(1996)14：760-764中。与pH-敏感性阴离子或阳离子脂质体不同，两性脂质体为复杂结构并且包含至少一对具有互补电荷的脂质。WO02/066012公开了两性脂质体的关键特征在于这些脂质体在低pH和中性pH下都具有稳定相。WO02/066012和WO07/107304描述了自低pH下开始使此类颗粒负荷核酸的方法。
Hafez等(Biophys.J.2000，79(3)，1438-1446)和WO 02/066012提供了关于如何选择具有真正两性性质的脂质混合物的指导，更具体地，提供了关于如何确定它们的等电点和融合开始的指导。中性脂质可以为两性脂质体的额外成分。一种或多种此类中性脂质的引入显著增加了混合物的复杂度，特别是由于所有成分的单独的量都可能变化。脂质体的极大数量的可能组合显示出更快速地优化两性脂质体的实践障碍。就此而言，WO08/043575揭示出优化两性脂质体的稳定性、融合性(fusogenicity)和细胞转染的策略，特别是预测何种脂质体混合物在高pH和低pH下形成令人满意的稳定层状相，同时在中间pH下形成融合性的六边形相的方法。
根据上述参考文献的两性脂质体是有效的细胞转染子。然而，观察到通过添加某种血清而能够阻滞这些脂质体中的一些的功能，由此可能限制了这些脂质体体内靶向某种细胞的活性。这进一步在本文中所示的实施例(例如实施例3)中进行了说明。
在不同血清中观察到的两性脂质体的摄取的抑制显然与近期公开的通过与脂蛋白形成复合物而活化阳离子载体(如Akinc等，Mo1.Ther.(2010)，印刷之前于5月11日电子公开，DOI：10.1038/mt.2010.85所证明的，在此情况下脂蛋白为ApoE)相反。
更详细的研究揭示了脂蛋白介导此抑制作用。如本文中实施例4所述，根据siRNA至受刺激细胞的功能递送表明缺乏脂蛋白的人血清不能够再抑制脂质体的摄取。目前，发明人已出人意料地发现某类阳离子脂质与在极性头基中具有羧基或磷酸根的阴离子脂质的组合在存在血清的情况下在保持转染活性方面是特别有利的。当根据本文和WO08/043575中描述的方法配制由所述脂质混合物产生的脂质装配体或脂质体时，经常观察到特别的益处。
发明目的
因此，发明的目的是提供可以在存在各种血清的情况下转染细胞的脂质装配体或脂质体。
发明的另一个目的是提供包含此类脂质体的药物组合物，所述脂质体作为用于将活性剂或活性成分递送至细胞或组织的载体，所述活性剂或活性成分包括药物例如核酸药物，如寡核苷酸或质粒。
发明概述
本发明提供了脂质装配体、脂质体及其用于细胞转染的应用，其中所述脂质装配体包含阴离子和阳离子两性分子并且其中阳离子两性分子的至少一部分是在pH7.5下基本上(substantially)带电荷的亚氨基脂质，其中阴离子两性分子是羧基脂质或磷酸脂质(phosphate lipid)，并且此外其中阳离子和阴离子两性分子之间的电荷比例是1.5或更低。
在本发明的各实施方案中，提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配体，其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，此外其中阴离子两性分子的至少一部分是羧基脂质，并且其中阳离子和阴离子两性分子之间的比例小于或等于1.5。
在本发明的更具体的方面中，提供了包含脂质的组合的脂质装配体，其中所述组合的阳离子脂质包含胍基部分且所述组合的阴离子脂质包含羧基基团，进一步的特征在于胍基部分和羧基基团的比例小于或等于1.5。
在本发明的其他实施方案中，提供了包含阴离子和阳离子两性分子的脂质装配体，其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，此外其中阴离子两性分子的至少一部分是磷酸脂质，并且其中阳离子两性分子和阴离子两性分子之间的比例小于或等于1.5。在这样的实施方案的进一步优选的方面，亚氨基脂质为胍基脂质。
本发明的阳离子两性分子的带电荷的亚氨基基团的pK大于7.5，并且选自亚胺、脒、吡啶、2-氨基吡啶、杂环氮基、胍基部分、异脲或硫代异脲。在优选的实施方案中，阳离子脂质选自PONA、CHOLGUA、GUADACA、MPDACA或SAINT-18。
在优选的实施方案中，所述阴离子脂质选自CHEMS、DMGS、DOGS、DOPA或POPA。
在许多实施方案中，本发明的脂质装配体是脂质体。
在进一步的实施方案中，脂质装配体还包括中性脂质例如胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或鞘磷脂或其混合物。
在优选的实施方案中，中性脂质是胆固醇并且脂质混合物中的胆固醇的摩尔分数在10摩尔％和50摩尔％之间。
在一些实施方案中，脂质装配体还包括PEG化的脂质，并且在这样的实施方案的优选方面，脂质体通过包括以下步骤的方法制备：(1)在存在活性成分的情况下形成并密封脂质体；和(2)在所述步骤(1)之后单独添加PEG-脂质。
出人意料地发现，可以使用外表面具有包含阴离子部分和阳离子部分的混合物的脂质装配体或脂质体实现抗血清性转染；其中阳离子部分的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基部分。在众多实施方案中，使用WO08/043575中描述的方法以及本文中更详细描述的方法配制本发明的脂质装配体和脂质体。
发明详述
脂质化学
“可带电荷的”是指两性分子的pK在pH4至pH8的范围内。因此可带电荷的两性分子可以是弱酸或碱。与带电荷的两性分子有关的“稳定的”是指pK在此范围之外的强酸或碱，其在pH4至pH8的范围内产生基本稳定的电荷。
本文中的“两性”是指包含阴离子特性和阳离子特性的带电基团的物质、物质的混合物或超分子复合物(例如脂质体)，其中：
(1)阳离子和阴离子两性分子中的至少一种是可带电荷的，任选地，两种都是可带电荷的，具有至少一个pK为4-8之间的带电荷基团，
(2)阳离子电荷在pH4下占优势，且
(3)阴离子电荷在pH8下占优势。
结果，物质或物质的混合物在pH4和pH8之间具有中性净电荷的等电点。由该定义的两性特性与两性离子特性不同，这是由于两性离子的pK不在上述范围内。结果，两性离子在一系列pH值下基本上为中性电荷；磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺是具有两性离子特性的中性脂质。
本文中的“电荷比例”或“C/A”是指通常分别分配至阳离子两性分子和阴离子两性分子的额定电荷之间的比例的绝对值或模量。羧基基团的额定电荷为“-1”，磷酸根部分的额定电荷为“-2”，且亚氨基化合物的额定电荷为“+1”。给定两性分子的混合物中或在脂质装配体中的“电荷比例”随后由这些额定电荷和所考虑的化合物的各自摩尔分数的乘积计算，不考虑中性化合物例如胆固醇或两性离子两性分子例如POPC或DOPE。
C/A＝(Xc1＊Zc1+Xc2＊Zc2+...Xcn＊Zcn)/(Xa1＊Za1+Xa2＊Za2+...Xan＊Zan)
其中Xc1...n表示给定阳离子化合物的摩尔分数，Xa1...n表示阴离子化合物的摩尔分数，Zc1...n表示给定阳离子化合物的额定电荷，且Za1...n表示阴离子化合物的额定电荷。
作为实例，包含42摩尔％羧基脂质、38％亚氨基脂质和20摩尔％中性脂质的混合物的电荷比例或C/A为38/42＝0.91。由于磷酸根基团的双倍额定电荷，包含27％磷酸脂质、43摩尔％亚氨基脂质和30摩尔％中性脂质的另一种混合物的电荷比例或C/A为43/54＝0.8。
由定义和实施例，显然脂质之间的摩尔比例或(为了简洁)比例和电荷比例对于单个电荷的物质而言具有相同的含义，并且在此类物质中这些术语可以互换。例如，对于亚氨基和羧基脂质的组合而言即是这种情况。相比之下，对于磷酸脂质而言摩尔比例与电荷比例不同，这是由于这些化合物可具有双倍电荷，例如在其中的磷酸根基团以初级磷酸酯的形式存在(例如在DOPA中)的情况下。如上述计算实例所示，摩尔比例或脂质比例则是电荷比例的两倍。仅为了清楚的目的，在整个说明书中优选使用术语“电荷比例”。
本文中的“生理pH”或“生理条件”是指约7.5的pH。
在其极性头基中包含羧基部分的阴离子脂质是本领域技术人员公知的。所述在其极性头基中包含羧基部分的阴离子脂质的实例可以选自以下结构(1)-(4)：
其中n或m为0-29之间的整数，R1和R2各自独立地选自具有8-24个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分，A、B或D各自独立地选自不存在、-CH2-、-CH＝、＝CH-、-O-、-NH-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、磷酸或亚磷酸二酯，且“固醇”可以是通过其C3原子连接的胆固醇。
以下列表提供了带有羧基基团的脂质的其他具体实例。
以下通式的胆固醇半二羧酸和胆固醇基氧基羰基氨基羧酸：
其中Z为C或-NH-且n为0-29之间的任意数字。
以上列举的包含二酰基基团的阴离子脂质的任何二烷基衍生物也在本发明的范围内。
优选的具有羧基的阴离子脂质可以选自Chol-C1至Chol-C16，包括所有其同系物，特别是CHEMS。还优选的是阴离子脂质DMGS、DPGS、DSGS、DOGS、POGS。
在其极性头基中包含磷酸部分的阴离子脂质是本领域技术人员公知的。磷酸脂质的实例可以选自以下结构(P1)-(P4)：
其中n或m为0-29之间的整数，R1和R2各自独立地选自具有8-24个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分，A、B或D各自独立地选自不存在、-CH2-、-CH＝、＝CH-、-O-、-NH-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-C(O)-NH-或-NH-C(O)-O-，且“固醇”可以是通过其C3原子连接的胆固醇。
以下列表提供了带有磷脂酸基团的脂质的其他具体实例。
其中的R1具有16-24个碳原子的十六烷基磷酸酯同系物。
可以用于本发明的阳离子脂质是在其极性头基中包含亚氨基部分的两性分子，其中所述亚氨基部分在生理条件下基本上带电荷。因此，在优选的实施方案中，此官能基团的pK值为7.5或更高，在进一步优选的形式中，亚氨基基团的pK值为8.5或更高。具有所述特性的亚氨基部分可以自身为亚胺或为较大的官能基团例如脒、吡啶、2-氨基吡啶、杂环氮基、胍基官能团、异脲和异硫脲等的一部分。
以下结构(11)...(1113)表示此类亚氨基部分的一些具体实例：
其中两性脂质分子的L表示极性区域，并且任选地表示连接子或间隔部分。L的实例可以进一步选自以下通式(11)-(15)
其中n或m表示0-29之间的整数，R1和R2各自独立地选自具有8-24个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分，A、B或D各自独立地选自不存在、-CH2-、-CH＝、＝CH-、-O-、-NH-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-O-C(O)-NH--或-NH-C(O)-O-，且“固醇”可以是通过其C3原子连接的胆固醇。
下表1提供了包含(11)-(1113)部分的亚氨基的pK的计算值或数据库值。对于季胺化的亚氨基部分，引入99的假定值，仅用于凸显该事实。
表1：11-1113部分的pK值
由此处所示数据可以明显地看出，结构11-1113中的大多数包含pK大于7.5或甚至大于8.5的优选的亚氨基部分。
pK值可获自公开的数据库。可选地，公开领域中有能够计算、预测或推算此类数值的专业软件，例如ACD/Labs v7(Advanced ChemistryDevelopment，Ontario，Canada)等。
以上分析的亚氨基部分例示了本发明的教导，但本发明并不局限于具体的实施例。当然可以改变取代基的位置，当使用环体系例如吡咯或吡啶来实践本发明时特别如此。也可以使用芳香残基或芳基部分来代替整个11-1113中使用的脂肪族基团。以下化合物(A1)至(A21)的列表提供了用于进一步例示所述修饰的一些实例，其中L如上文所定义。
以下表2提供了包含(A1)至(A21)部分的亚氨基的pK的计算值或数据库值。对于季胺化的亚氨基部分，引入99的假定值，仅用于凸显该事实。
表2：(A1)至(A21)结构的pK值
  结构   原子   pK   原子   pK   原子   pK
  A1   环   7,29   外   -7,16
  A2   环   99
  A3   环   99   外   -6,76
  A4   环   7,06   外   -6,91
  A5   环   4,74
  A6   亚氨基   12,15   淀粉溶素   -4,95
  A7   亚氨基   3,07   淀粉溶素   -12,14   环   99
  A8   亚氨基   14,24   环   -1,31
  A9   亚氨基   14,18   淀粉溶素   -0,72
  A10   亚氨基   12,52   淀粉溶素   -3,12
  A11   亚氨基   14,18   环   -1,27
  A12   亚氨基   14,25   淀粉溶素   -0,71
  A13   亚氨基   12,31   淀粉溶素   -5
  A14   亚氨基   13,75   淀粉溶素   -0,76
  A15   亚氨基   10,98   淀粉溶素   -5,43
  A16   亚氨基   7,96
  A17   亚氨基   9,44   淀粉溶素   -8,39
  A18   亚氨基   9,78   淀粉溶素   0,95
  A19   亚氨基   8,52   外   -1,86
  A20   亚氨基   11,97   淀粉溶素   -6,3
  A21   亚氨基   12,5   淀粉溶素   -3,6
上表2中所示的结构中的许多结构也包含pK大于7.5或甚至大于8.5的优选亚氨基。
如上所述，带电荷的亚氨基部分可以与脂质锚定点或疏水部分组合，以产生脂质或两性分子，所述脂质或两性分子能够自身形成脂质双层或能够整合入由其他脂质或两性分子形成的脂质膜中。在一些实施方案中，具体的脂质或两性分子选自如下所示的实例L1-L17：
其中R1和R2各自独立地选自具有8-24个碳原子和0、1或2个不饱和键的烷基、烯基或炔基部分。
这些脂质中的一些已在早前示于文献中，例如WO91/16024、WO97/43363、WO98/05678、WO01/55098、WO2008/137758(氨基酸脂质)、EP 0685234(基于二酰基甘油)、US 5965434(同样基于二酰基甘油)中的胍基脂质或US 6726894中的吡啶嗡化合物。此外，如WO29086558中所证明的或结构(15)中所例示的，也可能使用可选的脂质主链，例如包含二氧戊环连接子片段同时保持各头基的官能性的那些。
脂质混合物和任选的其他脂质
本发明公开了包含阴离子两性分子和阳离子两性分子的脂质混合物；其中阳离子两性分子的至少一部分是在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质，并且此外其中阴离子两性分子的至少一部分是羧基脂质或磷酸脂质。
阳离子脂质和阴离子脂质共同存在是本发明的核心特征，其中在阳离子脂质的极性头基中包含带电荷的亚氨基部分，在阴离子脂质的头基中包含羧基或磷酸根官能团。即，实质上缺少这些要素中的一个要素的脂质体或脂质装配体不包含在本发明的实践中。阳离子亚氨基脂质和阴离子脂质可以以不同的比例存在；所述比例在本文中全文以“电荷比例”(阳离子∶阴离子比例，C/A，参见定义)表征。在许多实施方案中，C/A比例大于0.33，在优选的实施方案中，该比例大于0.5，并且在一些实施方案中，该比例等于或大于0.66。在所述实施方案的优选方面，C/A等于或小于3，在进一步优选的方面，所述比例等于或小于2，并且在特别优选的方面，所述比例等于或小于1.5。
在所述实施方案的许多方面，所得脂质混合物都具有两性特性。pK大于7.5甚至更高并由此优选pK为8.5或更高的亚氨基脂质在生理条件下是基本上带电荷的，它们的实际电荷变得与其额定电荷接近，并最终与额定电荷相同。通常羧基脂质的pK为4.5-6，因此这些脂质在生理pH下也带电荷。因此，在C/A小于1时，亚氨基脂质和羧基脂质两者的混合物在生理pH下带净负电荷，在C/A＝1时净电荷为0，并且在C/A＞1时净电荷为正。
在低pH下，阴离子电荷在羧基脂质的pK附近消失，这使得C/A＜1的脂质混合物首先为中性并随后带正电。电荷反转是C/A＜1的特性，并且定义了两性特性。C/A＝1或C/A＞1的脂质混合物在低pH下同样经历负电荷的减少，但没有电荷反转。然而，应注意的是C/A和所得到的脂质装配体的两性特性之间的关系暗示了带电荷的部分跨越给定双层的在统计学上基本上相等的分布。这意味着膜的内叶(1eaflet)和外叶必然具有相同的带电荷脂质的组成，以保持这些计算的完全有效性。如实施例9所示，并非总是如此，并且甚至使用C/A＞1的脂质混合物也能够形成两性特性的脂质体。然而，此处公开的膜组成和两性特性之间的关系为脂质混合物的选择提供了良好的指导。
脂质混合物还可以包含其他的阳离子、阴离子、中性/两性离子或官能化的脂质。其他的阳离子脂质可以是已知的成分例如DOTAP、DODAP和DC-Chol等。其他的阴离子脂质可以选自带负电荷的磷脂例如磷脂酰甘油、磷脂酸、二-十六烷基磷酸和心磷脂等。中性或两性离子脂质为胆固醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和鞘磷脂等。
在优选的实施方案中，中性脂质为胆固醇。其他优选的为其中脂质混合物包含10摩尔％-50摩尔％胆固醇的变体，甚至更优选的为包含约20摩尔％-40摩尔％胆固醇的变体。
重要的一类官能化的脂质是包含聚合物延伸例如聚乙二醇(PEG-脂质)的那些。现有技术中已知众多PEG化的脂质，主要差异可以在以下方面找到：(i)PEG链的大小和支化程度，(ii)PEG和分子的膜插入部分之间的连接子基团的类型，和(iii)PEG化脂质的疏水性膜插入区域的大小。PEG化的其他方面是：(iv)脂质装配体中的修饰的密度和(v)它们在此类脂质装配体中的定向。
在方面(i)的许多实施方案中，PEG片段的分子量在500Da和5000Da之间，在更优选的实施方案中，此片断的分子量为约700Da-2500Da，甚至更优选的是约2000Da的PEG片段。在许多这样的实施方案中，PEG部分为单链的、未支化的PEG。
方面(ii)的典型实施方案为磷酸乙醇胺部分、二酰基甘油部分或神经酰胺的极性头基。
方面(iii)中表征的疏水性膜插入区域的大小是此类分子的其他重要特征，原因是其决定PEG脂质在双层中的膜停留时间。作为实例，具有短的疏水区域的PEG化脂质例如DMPE-PEG2000(二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-PEG缀合物，其中PEG链的分子量为2000Da)在若干秒内自给定的膜扩散，而DSPE-PEG2000同系物在双层中停留多个小时或多天(参见Silvius，J.R.和Zuckermann，M.J.(1993)Biochemistry 32，3153-3161或Webb，M.S.等(1988)，Biochim Biophys Acta 1372：272-282或Wheeler等(1999)，Gene Ther6：271-281)。
PEG化同时为脂质体，特别是如US6,287,591中所示的阳离子脂质体与阴离子核酸货物的组合提供了胶性稳定性，但也损害了脂质体的细胞摄取和/或内体(参见Shi.F.等(2002)，Biochem.J.366：333-341)。瞬时PEG化是现有技术，并且同时满足颗粒的胶性稳定性和活性的需要。
PEG化的其他方面(iv)是此类修饰的密度，其应在脂质混合物的0.5摩尔％-10摩尔％之间，在优选的实施方案中，PEG化的程度为约1摩尔％-4摩尔％。
由于给定双层的PEG化稳定了脂质装配体的层状相并损害与六边形相的形成有关的脂质融合，因此必须使双层中残留的PEG部分的量最小。这可以通过所需PEG脂质量的滴定而实现。因此，在方面(v)的一些实施方案中，脂质体在全部两个膜叶上均被PEG化并且使PEG的量最小化。在另一个变体中，尽可能完全地除去PEG。尽管这对于与外部双层相连的PEG脂质而言容易实现，但对于与脂质结构的内部连接的PEG脂质而言扩散是基本不可能的。因此本发明的方面(v)的优选的实施方案是提供包含带电荷的亚氨基和羧基或进一步包含PEG化脂质的磷酸脂质的脂质体，其中所述PEG化的脂质基本上位于外表面上。
此类脂质体的特征在于它们的制备方法，其中脂质体在第一步骤中形成，且该步骤还包括“货物”分子的包封。随后，在第二步骤中通过例如将PEG化脂质的胶束溶液添加至脂质体悬浮液中，而将PEG-脂质插入预先制作的脂质体的外部双层中。在此类方法的具体实施方案中，通过将核酸的水溶液与脂质的醇溶液混合而形成隔离(sequester)核酸的脂质体。捕获核酸的脂质体自发形成，并且在随后的步骤中加入PEG化的脂质。
特别有利地，可以使用两性脂质体实施此方法，这是由于这些脂质体已具有胶性稳定性，并且脂质体形成和PEG化之间的时间因素较不重要。包封核酸的两性脂质体的制备公开于WO 02/066012，其继续申请US2007/0252295中，或另外公开于WO 07/107304中。
在优选的实施方案中，通过提供所需量的PEG脂质以及中和缓冲剂而将包含亚氨基和羧基或磷酸脂质的两性脂质体在其外表面PEG化。为此，可以将PEG脂质溶于中和缓冲剂中。在另一个实施方案中，形成所述脂质体并中和，并且在0.1秒至若干天的时间间隔之后单独添加PEG脂质。在另一个实施方案中，形成脂质体并中和，将脂质体悬浮液进一步浓缩，并在物质浓缩后添加PEG脂质。在另一个实施方案中，形成脂质体并中和和浓缩，除去未包封的核酸，任选地替换用于脂质体悬浮液的缓冲剂，并随后添加PEG脂质。总之，可以在脂质体形成和闭合后的任何时间添加PEG脂质。
在另一个实施方案中，包含亚氨基和羧基或磷酸脂质的脂质体具有pH-敏感性阳离子特性，并且遵循上文列举的步骤通过在所述脂质体形成和闭合时提供所需量的PEG脂质而在其外表面PEG化。由于在核酸存在的情况下pH-敏感性脂质体更易于形成聚集体，因此优选快速PEG化，并且在脂质体闭合时(例如在其产生后0.1秒-1分钟)立即加入PEG脂质。
与产生在其外表面上基本PEG化的脂质体产物的上述方法相反，在脂质体的实际形成期间存在PEG化脂质；其在初生的结构闭合之前，生成不同的产物。尽管尚未获得结构数据，但本领域技术人员应预期在这种情况下大量的PEG部分也停留在膜的内叶中。这与具有进入初生脂质体的全部两叶的通路的核酸“货物”的情况类似，并且一旦这些脂质体已闭合，即可在脂质体内部检测到大部分核酸。
脂质装配体
本文提及的成分可以以本领域中已知的多种结构装配。这些结构可以是包含一个或多个单独的双层的脂质体、其它超分子脂质装配体或具有提供水相的相当大的内部体积的囊泡。其也可以是乳滴或lipoplex装配体形式的结构，在许多实施方案中后者包含脂质和核酸的静电复合物。在优选的实施方案中，这些结构是脂质体或囊泡。在许多实施方案中，这些脂质体或囊泡具有相当大的含水内部。在本发明的许多方面，活性药物成分与脂质装配体复合，被脂质装配体包封、隔离或与脂质装配体结合。由于大量可用的亚氨基和羧基或磷酸脂质和其他脂质，确实存在极大量的可能有用的组合，由此产生从这些变体中选择和优化的进一步需要。WO08/043575给出了用于优化复合物脂质装配体，特别是脂质双层的具体指导并提供了如本文另外详细讨论的方法。简而言之，WO08/043575中的教导证明两性脂质混合物在酸性和中性pH条件下都形成稳定的双层，然而，由这些脂质混合物形成的双层可经历相变并且在其等电点下(通常是在微酸性的条件下)融合。WO08/043575公开了将中等大小的或小的脂质头基用于带电荷的脂质成分的用途。WO08/043575还教导了使用大的缓冲剂离子或大体积的缓冲剂离子以在装载步骤期间在低pH下稳定层状相，以及使用大的或大体积的缓冲剂离子以在储存期间在中性pH下稳定层状相。特别地，参考WO08/043575的第44-57页，其重点公开了上述基本要素。所述参考文献还公开了使用带有小的头基的中性脂质以使融合活性最大化。通常用于经改善的融合的中性脂质为胆固醇或DOPE。对于中性脂质的具体考虑和优化规则另外示于WO09/047006中，特别是第63页-第70页。
总而言之，WO08/043575或WO09/047006(在本文中一起被称为“参考文献”)提供了有关脂质装配体的优化的合理指导。所述参考文献不限于两性脂质体，但为脂质装配体的结构-活性关系提供了综合模型。
本发明由于提供了用于配制能够避免与脂蛋白或其他血清成分的细胞结合、相互作用或竞争的脂质体的优化方法，而代表了现有技术的进步。尽管所述参考文献教导的方法提供了关于脂质装配体的必需融合性的信息，但其未公开关于脂质体的细胞结合的预测的信息。
因此，本发明的目的是提供通过所述参考文献中公开的方法同时组合了当使用在生理条件下基本上带电荷的亚氨基脂质与具有羧基或磷酸根的阴离子脂质(即带负电荷的部分)的组合时观察到的出人意料的性质而配制的脂质装配体、脂质混合物和脂质体。不期望受理论的限制，本文配制的所述新型组合物可以更好地促进脂蛋白样细胞结合和摄取——本领域中不知道的特征。
本文中描述的脂质混合物可以具有两性或pH-敏感性阳离子性质，这两个性质通常由形成其的脂质赋予脂质装配体或脂质体。可容易地如WO02/066012所述预测电荷性质，用于脂质朝向脂质膜或双层的两叶的对称分布。然而，在一些情况下最外叶的脂质分布可能与装配体的其他部分不同。宏观地，如实施例9和图1中所证明的，C/A略大于1且包含带电荷的亚氨基脂质以及羧基或磷酸脂质的组合的脂质混合物可能因此仍然形成具有两性特性的脂质体。
出于计算机优化和预测的目的，认为本发明的C/A＜1的脂质混合物是两性的并且可以形成根据参考文献的分类被归类于“两性子(amphoter)I”混合物的脂质装配体。在其他实施方案中，使用C/A＝1或C/A＞1的脂质混合物；这些是pH-敏感性阳离子脂质混合物，其电荷在生理pH下为中性或阳离子性的，并且随着pH降低而变得更阳离子性。所述实施方案的pH-敏感性阳离子混合物不再具有等电点，这是由于其两性对应物即是如此。然而，参考文献中提供的结构-活性关系是可用的，这是由于其提供了对于脂质装配体和溶质以及离子(与其电荷无关)的组合的相行为的通用理解。
为了说明，本发明的脂质混合物包含一种或多种具有在生理pH下基本上带电荷的亚氨基基团的阳离子脂质，还包含一个或多个具有羧基或磷酸根基团的阴离子脂质，任选地还包含中性脂质。
脂质体的两性特性还具有其他益处。此类脂质体或脂质装配体的负表面电荷大大地改善了脂质体在悬浮液中的胶性稳定性。这在与易于与阳离子脂质体生成聚集体的多阴离子“货物”(例如核酸)的组合中是特别重要的。
当体内施用脂质体时，两性脂质装配体或脂质体的阴性至中性表面电荷也是有利的，在此其防止了利用阳离子脂质体观察到的在内皮上的非特异性吸收或与血清成分形成聚集体(关于阳离子脂质体的内皮吸收参见Santel等，(2006)，Gene Therapy 13：1222-1234，或者关于防止与两性脂质体形成聚集体参见Andreakos等，(2009)，Arthritis and Rheumatism，60：994-1005)。
因此，在优选的实施方案中，本发明的脂质体具有两性特性。在该组中，避免极低百分比的阳离子成分以保持颗粒对多阴离子“货物”例如核酸的有效装载是有利的。在其他优选的实施方案中，C/A大于0.5。
当全身施用，即施用至血流中时，脂质体在体内经历某种分布。通常的靶点是肝和脾，但是也包括循环的吞噬细胞。脂质体也与围绕血管的内皮接触并可转染这些细胞。脂质体在发炎部位和肿瘤中的聚集具有特别的治疗相关性。
技术人员应知晓将颗粒的分布引向一个或另一个部位的方法。公知具有约150nm或更小的小直径的脂质体可以穿透肝内皮，由此获得进入至肝细胞和肝实质的其他细胞的通道。在靶向肝细胞受到治疗关注的情况下，本发明的脂质体的直径可以为150nm或更小，在优选的实施方案中，脂质体的直径可以小于120nm。
还公知直径为100nm或更大的颗粒很好地被吞噬细胞识别。因此，在巨噬细胞或树突细胞构成受关注的靶的实施方案中，本发明的脂质体为120nm或更大。在一些实施方案中，这些脂质体为150nm或更大。在其他实施方案中，这些脂质体的大小可以为250nm或大至400nm。
还描述了表面电荷可影响循环时间，因此影响脂质体的生物分布，并且已明确证明PEG化减少了表面电荷并导致脂质体的循环延长。通常认为循环延长使向肿瘤的分布最大化。因此，在其中肿瘤构成受关注的靶的方面，本发明的脂质体具有小的净表面电荷，并且其特征在于0.67-1.5的C/A。在此类应用的优选实施方案中，形成所述脂质体的脂质混合物的C/A为0.8-1.25。同样，靶向肿瘤的脂质体为小体积。在优选的实施方案中，此类脂质体小于150nm，在进一步优选的实施方案中，脂质体小于120nm。在一些实施方案中，脂质体还包括PEG脂质。
用于本发明脂质体的“货物”
本发明的脂质体或脂质装配体可以隔离或包封至少一种活性剂。所述活性剂可以包括药物。在一些实施方案中，所述活性剂可以包含一种或多种核酸。在优选的实施方案中，活性成分由核酸组成。
不限于此类应用，本发明中所述的脂质体或脂质装配体非常适于用作基于核酸的药物(例如寡核苷酸、多核苷酸和DNA质粒)的载体。这些药物被归类为编码一个或多个特定蛋白质、多肽或RNA序列的核酸，以及能够特定地调节蛋白质表达水平或特别通过干扰剪接和人工截短而影响蛋白质结构的寡核苷酸。
因此，在本发明的一些实施方案中，基于核酸的治疗剂可包含能够在脊椎动物细胞中被转录为一种或多种RNA的核酸，所述RNA可以为mRNA、shRNA、miRNA或核酶，其中所述mRNA编码一种或多种蛋白或多肽。此类核酸治疗剂可以为环状DNA质粒、线性DNA构建体，如WO98/21322或DE19753182中公开的MIDGE载体(免疫学上最低定义的基因表达)，或准备用于翻译的mRNA(例如EP 1392341)。
在本发明的其他实施方案中，可以使用能够靶向现有的细胞内核酸或蛋白的寡核苷酸。所述核酸可以为特定基因编码，以使所述寡核苷酸适于减弱或调节转录，改变转录物的加工，或干扰蛋白质的表达。术语“靶核酸”包括编码具体基因的DNA，以及源自此类DNA的所有RNA(前-mRNA或mRNA)。靶核酸和靶向此类序列的一种或多种寡核苷酸之间的特定杂交可能导致蛋白表达的抑制或调节。为了实现此类特定靶向，寡核苷酸应适当地包含与靶核酸的序列基本互补的核苷酸的连续延伸段。
可以使用多种化学物质和拓扑物质构建满足上述标准的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以包含天然存在的或经修饰的核苷酸，包括但不限于磷酸酯或磷硫酯形式的DNA、RNA、锁核酸(LNA)、未锁核酸(UNA)、2′O-甲基RNA(2′Ome)、2′O-甲氧基乙基RNA(2′MOE)或吗啉代类(Morpholinos)或肽核酸(PNA)。寡核苷酸可以为单链的或双链的。
寡核苷酸为具有8-60个电荷的多阴离子结构。在大多数情况下，这些结构是包含核苷酸的聚合物。本发明不限于寡核苷酸的具体作用机制，并且对所述机制的理解对于实施本发明而言不是必需的。寡核苷酸的作用机制可能不同，并且其中可能包括对剪接、转录、核-细胞质转运和翻译的特别作用。
在本发明优选的实施方案中，可以使用单链寡核苷酸，包括但不限于基于DNA的寡核苷酸、锁核酸和2′-修饰的寡核苷酸等，通常被认为是反义寡核苷酸。主链或碱基或糖修饰可以包括但不限于磷硫酯DNA(PTO)、2′O-甲基RNA(2′Ome)、2′氟RNA(2′F)、2′O-甲氧基乙基-RNA(2′MOE)、肽核酸(PNA)、N3′-P5′氨基磷酸酯(phosphoamidate，NP)、2′氟阿拉伯核酸(FANA)、锁核酸(LNA)、未锁核酸(UNA)、吗啉氨基磷酸酯(吗啉代类)、环己烯核酸(CeNA)和三环DNA(tcDNA)等。此外，混合的化学物质是本领域中已知的，由多于一种核酸种类以共聚物、嵌段共聚物或gapmer的形式或以其他排列构建。
除了上述寡核苷酸以外，也可以使用包含互补序列基序的双链化RNA分子抑制蛋白表达。此类RNA分子在本领域被称为siRNA分子(例如WO99/32619或WO02/055693)。其他siRNA包括单链siRNA或具有一个不连续的链的双链化siRNA。同样，各种化学物质适于此类寡核苷酸。此外，DNA/RNA杂交体系是本领域中已知的。siRNA的其他变体包括其中的两个较小的链杂交至一个共同的较长链上的三链结构，即所谓的在其体系结构中具有切口或间隙的部分双链(meroduplex)或sisiRNA。
在本发明的另一个实施方案中，可以使用诱饵寡核苷酸。这些双链DNA分子及其化学修饰物不靶向核酸，而是靶向转录因子。这意味着诱饵寡核苷酸结合序列特异性的DNA结合蛋白并干扰转录(例如Cho-Chung等，Curr.Opin.Mol.Ther.，1999)。
在发明的另一个实施方案中，可以使用可通过在生理条件下杂交至基因的启动子区域而影响转录的寡核苷酸。同样，各种化学物质可以适于此类寡核苷酸。
在发明的另一个可选方案中，可以使用DNAzyme。DNAzyme是具有酶活性的单链寡核苷酸及其化学修饰物。被称为“10-23”型的典型DNA酶能够在生理条件下在特异性位点切割单链RNA。DNAzyme的10-23型具有15个高度保守的脱氧核苷酸的催化域，侧翼为与RNA上的靶序列互补的两个底物识别域。靶mRNA的切割可能导致其受到破坏，且DNAzyme回收并切割多种底物。
在发明的另一个实施方案中，可以使用核酶。核酶是具有酶活性的单链寡核糖核苷酸及其化学修饰物。它们可以被操作性地分为两种成分，形成催化核心的保守的茎环结构和与给定RNA转录物中的靶位点周围的序列反向互补的侧翼序列。侧翼序列可以赋予特异性，并且总共通常形成在所选的靶位点的两侧上延伸的14-16nt。
在发明的其他实施方案中，可以使用适配子以靶向蛋白质。适配子是由核酸例如RNA或DNA组成的大分子及其化学修饰物，其紧密地结合至特定的分子靶并且长度通常为15-60nt。核苷酸链可以形成分子内的相互作用，其将分子折叠为复杂的三维形状。适配子的形状使其能够紧密地结合背向其靶分子的表面，所述靶分子包括但不限于酸性蛋白质、碱性蛋白质、膜蛋白、转录因子和酶。适配子分子的结合可能影响靶分子的功能。
所有上述寡核苷酸的长度都可以在少至每条链5或10个核苷酸，优选15个核苷酸，甚至更优选18个核苷酸，并且多至50或60个核苷酸，优选30个核苷酸，更优选25个核苷酸之间变化。更具体地，所述寡核苷酸可以是8-50个核苷酸长度的反义寡核苷酸，其催化RNAseH介导的其靶序列的降解或阻断翻译或重新引导剪接或起antagomir的作用；它们可以是15-30个碱基对长度的siRNA；或它们也可以表示15-30个碱基对长度的诱饵寡核苷酸。可选地，它们可以是影响15-30个核苷酸长度的基因组DNA的转录的互补寡核苷酸；它们也可能代表25-50个核苷酸长度的DNAzyme或25-50个核苷酸长度的核酶或15-60个核苷酸长度的适配子。所述寡核苷酸亚类通常在功能地定义并且可以相同或不同或共有一些但不是全部其化学性质或体系结构特征，而基本上不影响本发明的教导。在上述数目的寡核苷酸的连续的延伸中，寡核苷酸和靶序列之间的配合优选是完美的，其中寡核苷酸的各碱基与靶核酸上的沿上述数量的寡核苷酸的连续延伸段上的其互补碱基形成碱基对。在碱基对的所述连续延伸段中，所述序列配对可以包含一个或多个错配，但这是较不优选的。通常，所述核酸的类型和化学组成对于本发明的脂质体在体内或体外作为运载体的性能几乎没有影响，并且本领域技术人员可以找到适于与本发明的两性脂质体组合的其他类型的寡核苷酸或核酸。
在某些方面并且如本文所证明的，本发明的脂质体可用于体外、体内或离体转染细胞。
具体实施方式
基于胆固醇的脂质
为了说明本发明的教导，将包含胍基部分(带电荷的亚氨基基团，CHOL-GUA)、咪唑部分(不带电荷的亚氨基基团，CHIM)或二甲基氨基或三甲基铵部分(非亚氨基但带电荷的基团，DC-CHOL或TC-CHOL)的胆固醇的阳离子衍生物系统地(systematically)与不同的阴离子脂质组合。
所用的阴离子脂质为CHEMS(胆固醇作为疏水部分，羧酸作为带电荷基团)、DMGS或DOGS(二酰基甘油疏水部分，羧酸作为带电荷基团)或DOPA(二酰基甘油作为疏水部分，磷酸酯作为带电荷基团)。对于大多数阳离子/阴离子组合，制备了C/A比例在0.33-2之间的8个系列二元混合物，在C/A为0.75和1下测试了阳离子脂质与DOPA的组合。如所示，将胆固醇加入所有脂质混合物中以构成20-40摩尔％。
所有脂质体都装载PLK-1 siRNA(能够抑制细胞周期激酶PLK-1的生成的寡核苷酸)，并通过对测试细胞的细胞存活的抑制测定成功的转染(也参见Haupenthal等，Int.J.Cancer(2007)，121：206-210)。通过包含相同的整体组成和相同量的非靶向siRNA的对照配制物，监测对细胞存活的非特异性抑制，即细胞毒性作用。
随后在常规细胞培养基中或具有额外的10％小鼠血清(细胞摄取许多两性脂质体的有效抑制剂)的细胞培养基中进行细胞转染。转染效率以IC50(达到细胞存活的50％抑制所需的浓度)表示。
将常规培养基中的IC50与添加小鼠血清的IC50之间的比例用作小鼠血清抑制细胞摄取的度量。对于没有特异靶向性质的脂质体而言，此比例为5或更高。对于本发明的脂质体(即包含带电荷的亚氨基基团和带负电荷的脂质的组合的脂质体)而言，其为5或更低。
如实施例14中进一步证明的，通过CHOLGUA与羧基脂质DOGS的组合可以获得对HeLa细胞的最佳抗血清转染。在存在少于40％胆固醇的情况下，C/A为0.5-1.5的混合物获得特别好的结果。如果所有其他成分例如DOGS或胆固醇保持不变，并如DC-CHOL中用二甲基胺与GUA头基交换，则在不存在小鼠血清的情况下脂质体仍然具有活性，但在存在小鼠血清的情况下不再具有活性。对于CHIM和DMGS的组合，可以观察到相同的情况。
基于胆固醇阳离子脂质与磷酸脂质DOPA的组合与所述结果的相似之处在于亚氨基脂质CHOLGUA观察到最佳活性。此外，虽然与不存在血清的情况相比较有大量抑制，但可能观察到CHOLGUA:DOPA脂质体的抗血清转染。在存在血清的情况下，DOPA与CHIM或DC-CHOL的组合不产生任何转染。
基于DACA的脂质
为了进一步研究抗血清转染与头基化学的相关性，使用普通的二烷基羧酸(DACA)锚定作为其疏水域合成以下脂质：
其中DACA部分通过如实施例10中所述将油基碘化物添加至油酸中而获得，生成的化合物为：
在阳离子脂质之外，GUADACA、MPDACA或BADACA在其极性头基中具有带电荷的亚氨基部分。由于吡啶部分的低pK(计算的pK为5.9)，PDACA的头基基本上不带电荷，而甲基化的变体导致带恒定电荷的吡啶鎓化合物MPDACA的生成。ADACA具有约为9的足够高的pK，但缺少亚氨基成分。然而，当氨基基团位于酰胺的□-位时少量的各烯胺可以由此成分形成，使得亚氨基形式内消旋稳定化。
如以上关于基于胆固醇的脂质所述，制备与阴离子脂质CHEMS、DMGS、DOGS和DOPA的组合，产生具有0.33-2(或对于磷酸脂质为0.75-1)的各C/A比例的相似系列的不同脂质体。
此外，用靶向PLK-1或不相关序列的siRNA装载脂质体，并在存在小鼠血清的情况下或不存在小鼠血清的情况下在HeLa细胞上测试转染性质。
如在实施例14和15中进一步证明的，通过GUADACA或MPDACA与羧基脂质或磷酸脂质的组合，可以获得HeLa细胞的抗血清转染。此外，这些脂质还在不存在血清的情况下产生非常高效的PLK-1 siRNA转染。这意味着没有出现如近期描述的与具有二甲基氨基头基的脂质体有关的所述脂质体被血清成分的活化(Akinc等，Mol.Ther.(2010)，印刷之前于5月11日电子公开，DOI：10.1038/mt.2010.85)。与羧酸脂质的组合在0.5-1.5的C/A值也观察到极高水平的载体活性，磷酸脂质在C/A 0.75或1观察到极高水平的载体活性。在这些情况中的一些的情况下，制剂具有两性电荷性质。
吡啶鎓化合物MPDACA的甲基化缺乏产生了相关PDACA。尽管仍然带有亚胺官能团，但此官能团不再如在MPDACA中那样带电荷；PDACA不具有出于转染目的的阳离子脂质的活性。在另一个变体中，保留头基的芳香环，但带电荷的亚胺则以额外的环形胺(aminide)基团的一部分的形式存在。发现此化合物具有作为用于转染的脂质的活性，例如与CHEMS或DMGS组合(其中其也产生抗血清转染)。
基于二烷基羧酸的其他脂质
使用如US 6726894中所述的吡啶鎓脂质SAINT-18(结构31)得到了相似的结果。
将SAINT-18与各种脂质阴离子例如CHEMS、DMGS或DOGS组合。阳离子脂质和阴离子脂质的比例以系统的方式变化，并且所得到的二元混合物任选地还补充有20或40摩尔％胆固醇。将单独的脂质混合物转化为脂质体并用于活性siRNA和对照siRNA的包封。如实施例8中所证明的，当在存在普通细胞培养基的情况下在HeLa细胞上进行测试时，大量测试制剂都观察到了细胞存活的有效和特异性抑制。然而，C/A＞＝1的脂质体均没有在存在小鼠血清的情况下产生细胞转染。形成鲜明对照的是，大量的两性制剂抵抗血清并确实有效地转染细胞。此外，此作用特异性于PLK-1siRNA，并且需要浓度高得多的且装载有不相关的siRNA(SCR)的脂质体以非特异性地抑制细胞增殖。使用SAINT18与DMGS的组合获得了最佳结果。因此，包含SAINT-18和DMGS且其他特征在于C/A＜1的脂质体在本发明的范围内。
基于氨基酸的脂质
为了进一步说明本发明的教导，将阳离子胍基脂质PONA(棕榈酰基-油酰基-去甲-精氨酸，结构21)与各种脂质阴离子例如CHEMS或DMGS组合。阳离子脂质和阴离子脂质的比例以系统的方式变化，并且所得到的二元混合物任选地还补充有20摩尔％胆固醇。将单独的脂质混合物转化为脂质体并用于包封活性siRNA和对照siRNA。当在HeLa细胞上进行测试时，如实施例5中所证明的，大多数测试制剂都观察到了细胞存活的有效和特异性抑制。活性不受存在的人或小鼠血清的影响，或仅略微(marginally)受存在的人或小鼠血清的影响。
在实施例6中，将阴离子脂质CHEMS与PONA的衍生物组合，其中如结构(21)和(23)中所示，胍基部分被氨基基团取代(POAamine)或季胺化的铵基团(POAammouium)取代。
同样，系统地改变阴离子和阳离子脂质成分之间的比例，并且在所有脂质混合物中都存在20％胆固醇。将原料配制成脂质体并用于包封活性siRNA和对照siRNA。当在HeLa细胞上测试时，所有包含摩尔过量的阳离子脂质的制剂都观察到了细胞存活的有效和特异性抑制。对于包含较高摩尔量的阴离子脂质CHEMS的混合物，在与PONA的组合中观察到最佳活性，而POAamine∶CHEMS组合仅在一些情况下有效。当使用过量的阴离子脂质时，PONammonium∶CHEMS组合无效。
此外，在包含过量阴离子脂质CHEMS的混合物之外，PONA∶CHEMS组合的转染活性仅略微受存在的人或小鼠血清的影响，而在存在小鼠血清的情况下PONamine∶CHEMS组合的活性被完全抑制。在存在血清的情况下，PONammonium制剂保持无活性。
如实施例15中进一步描述的，还测试了PONA、PONamine或POAammonium与磷酸脂质DOPA的组合。PONA和POAamine都导致HeLa细胞的抗血清转染，而POAammonium未导致HeLa细胞的抗血清转染。
组合的数据支持了包含胍基脂质与带负电荷的脂质例如羧基脂质或磷酸脂质的组合的脂质组合物的优选摄取。这可能涉及以下进一步的力学考虑。具有过量阳离子脂质成分的制剂的恒定高活性可能是由于这些颗粒和细胞表面之间的静电相互作用，然而这种相互作用是非特异性的。与此观点一致的是阳离子制剂的活性不取决于阴离子或阳离子脂质的性质这一事实。
在进一步的实验中，将胍基脂质PONA与CHEMS、DMGS或DOGS组合。同样，在各二元混合物中进行阴离子和阳离子脂质化合物的比例的系统变化，并且制剂进一步补充有0、20或40摩尔％胆固醇。当如上所示进行测试时，大多数制剂具有抑制HeLa细胞的细胞增殖的活性，IC50低于6nM(参见实施例7)。然而，活性和无活性siRNA的效率所需的浓度之间的比较揭示了制剂之间的实质差异。此类比较的度量是两种siRNA的IC50之比，在本文中以SCR/PLK比表示。仅所选的制剂达到了显著高于5的值。甚至更优选的制剂的SCR/PLK＞＝10。所有这些优选制剂都可以通过其阳离子脂质成分和阴离子脂质成分之间的比例(小于1)而表征。
本发明鉴定出在存在抑制性血清的情况下对某些细胞的摄取至关重要的特定脂质头基化学。优选地，包含羧基基团的阴离子脂质和包含带电的亚氨基部分的阳离子脂质的两性组合产生了期望的性质。相比之下，包含相同脂质的阳离子制剂不依赖于特定的头基化学并且较不易被细胞耐受。
脂蛋白结合
根据其密度，竞争脂质体转染的脂蛋白包括多种结构。这些结构被称为乳糜微粒、VLDL、LDL、IDL或HDL颗粒。在内源途径中，乳糜微粒在小肠的上皮内层中合成并使用ApoB-48(ApoB基因产物的较短变体)装配。脂蛋白与HDL颗粒的进一步交换导致ApoC-II和ApoE被转移至乳糜微粒颗粒，ApoC-II介导脂蛋白脂肪酶(自颗粒释放脂质所需的酶)的活化。水解的乳糜微粒形成所谓的残留物，其主要在肝中通过对其ApoE部分的识别而被摄取。VLDL颗粒的合成、熟化、使用和再循环遵循相同的途径，但自肝中开始并且使用ApoB-100蛋白作为其结构形成单元。同样，ApoE介导VLDL-残留物(所谓的IDL颗粒)的最终摄取和再循环。(还参见http://en.wikipedia.org/wiki/lipoprotein)
ApoE与载脂蛋白A和C共有的结构同源性在于它们都包含11个氨基酸的两性串联重复序列。ApoA-I和ApoE片段的晶体学数据确认了延长的两性螺旋结构的存在，并且揭示这些螺旋的极性面上的混合的电荷结构。这些数据可以公开地获自RCSB Protein Data Bank(可获自www.rcsb.org/pdb/home/home.do)并且登录号1AV1.pdb给出了ApoA-I的蛋白结构。1lpe.pdb的氨基酸129-166表示ApoE的LDL-受体结合片段。与它们的整体相似性相反，当分析三种载脂蛋白的氨基酸组成时它们显示出特别的偏差。在ApoE中，在串联重复序列中精氨酸是占主要地位的阳离子氨基酸。相比之下，ApoA具有等量的赖氨酸和精氨酸，而ApoC具有过量的赖氨酸残基。
表3：相关载脂蛋白的串联重复序列中的氨基酸组成分析(序列数据获自www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html的Swiss-Protacailable)。
总之，天然脂蛋白的极性表面被载脂蛋白覆盖，其中ApoE是用于细胞摄取这些颗粒的共有结合基序。ApoE的暴露于水的部分代表了阴离子电荷和阳离子电荷的嵌合，其中阴离子电荷由天冬氨酸和谷氨酸残基的游离羧基末端产生。阳离子电荷包括氨基和胍基基团的混合物，并且存在极少量的咪唑。
为了模拟脂质体表面上的ApoE结合组件的识别方式，可以遵循不同的可选方案。可能合成ApoE肽片段并将此类肽接枝至脂质体的表面。这已被Mims等，J Biol.Chem.269，20539(1994)；Rensen等，Mol Pharmacol.52，445(1997)；Rensen等，J.Lipid Res.38，1070(1997)；Saue等，Biochemistry 44，2021(2005)或Versluis等，J Pharmacol.Exp.Ther 289，1(1999)所证明。然而，与肽合成和衍生化相关的高成本需要替代方法。
使用不同的带电荷脂质的混合物(可能还包含中性脂质)直接提供所需的带电荷的部分将产生简单得多的结构，并且消除了对高成本的肽生产和衍生化的需要。所述方法的一个显著的难题在于带电的基团在脂质双层中的平面扩散；在此之前不清楚是否这种组织较差的装配体的亲和力是否能有效地竞争真正的脂蛋白提供的亲和力。此外，带相反电荷的脂质头基可能彼此会形成盐桥，而在脂蛋白例如ApoE的结合组件中在官能基之间仅检测到极少量的氢键。这可以解释亚氨基∶磷酸脂质组合例如GUADACA∶DOPA或MPDACA∶DOPA的活性。尽管DOPA在生理条件下提供两个负电荷，但空间位阻使得不能由一个DOPA和两个GUADACA脂质形成盐。因此，在这些膜中，DOPA和GUADACA之间的带负电荷的盐必须与游离的GUADACA分子共同存在，由此有利于在共同的脂质装配体中同时存在单独的阴离子要素和阳离子要素。
上述理论的提及并不限制本发明的发现。不期望受具体理论的限制，可以假定带电荷的亚氨基脂质与带负电荷的羧基或磷酸脂质的组合模拟了被ApoE覆盖的脂蛋白的表面性质。当然，没有这样的知识也可以使用、开发和优化所述颗粒。然而，理论背景可能有助于了解本发明各实施方案中所述的指导原则或载体的适用性。
例如，已知脂蛋白受体在不同的细胞类型中具有不同的表达谱，这样的知识可以用于评价用于本发明的脂质体的靶细胞群。
LDL-受体在肿瘤上和肺的支气管上皮细胞上高度表达(参见Su Al，Wiltshire T，Batalov S等(2004).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(16)：6062-7，也公开于http://en.wikipedia.org/wiki/file：PBB_GE_LDLR_202068_s_at_tn.png)。
因此，本发明的脂质体特别适于肿瘤学领域的应用，但也适于特定肺细胞的转染。尽管可通过EPR-作用(增强的渗透性和保留)而由体循环与肿瘤接触，即通过渗漏的肿瘤脉管系统接触，但也可以由气道靶向支气管上皮细胞。
因此，在本发明的具体实施方案中，将包含带电荷的亚氨基和羧基或磷酸脂质的脂质体的气溶胶用作用于靶向肺细胞特别是支气管上皮细胞的吸入剂型。
图注
图1-6显示了实施例14中描述的筛选试验的结果。阳离子脂质的性质示于较小的图中，且显示的所有项目的其他图注和坐标轴相似，并示于以下独立的较小的图中。两个柱分别表示包含20％胆固醇(左柱)和40％胆固醇(右柱)的脂质体。
对于每张图，柱表示各脂质体/siRNA组合在试验条件下(即在存在小鼠血清的情况下和在不存在小鼠血清的情况下)的IC50值。这些IC50值表示细胞生长的半最大抑制所需的浓度，并且以nM表示。测试项目的最大浓度在存在小鼠血清的情况和不存在小鼠血清的情况分别为40nM和36nM。
测试项目的顺序如下：
图1：阴离子脂质为CHEMS-未添加小鼠血清
图2：阴离子脂质为CHEMS+添加小鼠血清
图3：阴离子脂质为DMGS-未添加小鼠血清
图4：阴离子脂质为DMGS+添加小鼠血清
图5：阴离子脂质为DOGS-未添加小鼠血清
图6：阴离子脂质为DOGS+添加小鼠血清
实施例
通过考虑以下实施例可以更好地理解本发明的教导。然而，这些实施例绝不应限制本发明的教导。
实施例1-制备、表征脂质体并包封siRNA。
使用如WO07/107304公开的方法制备脂质体。更具体地，将脂质溶于异丙醇并通过将含siRNA的pH为4.0(pH用HAc调节)的NaAc 20mM、蔗糖300mM溶液添加至醇性脂质混合物中而制备脂质体，最终的醇浓度为30％。用两倍体积的Na2HPO4 136mM、NaCl 100nM(pH9)将所形成的脂质体悬浮液调整为pH7.5，得到的脂质最终浓度为3mM，异丙醇最终浓度为10％。
使用动态光散射(MALVERN 3000HSA)表征脂质体的粒径。
活性siRNA：21聚体，钝尾的，靶向小鼠和人PLK-1mRNA，如Haupenthal等，Int.J.Cancer(2007)，121：206-210中所述。
对照siRNA(SCR)：21聚体，同一来源。
实施例2-通用细胞培养和增殖测定。
自DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)获得HeLa细胞并将其维持于DMEM(Gibco-Invitrogen)中并补充有10％FCS。以2.5x104细胞/ml的密度使细胞铺板并且在37℃、5％CO2下在100μl培养基中培养。16小时后将包含siRNA的脂质体稀释并添加10μl至细胞，以使Plk1或秩乱siRNA的最终浓度为0.4-100nM；同样将10μl稀释缓冲剂添加至未处理的细胞中和无细胞的孔中。将细胞培养盘在37℃、5％CO2下温育72小时。
根据供应商的指导，通过使用Celltiter-Blue Cell Viability实验(Promega，US)测定细胞增殖/存活。
实施例3-血清对转染的抑制。
如上所述用活性siRNA和对照siRNA装载获自DODAP∶DMGS∶胆固醇(24∶36∶40摩尔％)的脂质体，并使来自不同物种的75μl血清(SIGMA-Aldrich)和25μl所述脂质体温育30分钟。随后，将所述脂质体添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。
当不使用血清温育时，活性siRNA的施用导致对细胞增殖的强抑制。如下表7中所证明的，该过程通过添加血清而被抑制。
表7：细胞转染被不同来源的血清抑制
 siRNA类型  siRNA浓度   血清   细胞存活(％)
 PLK1  50nM   无   7
 PLK1  50nM   人   98
 PLK1  50nM   仓鼠   80
 PLK1  50nM   大鼠   108
 PLK1  50nM   小鼠   102
 无  无   无   100
实施例4-抑制是脂蛋白依赖性的
如上所述将实施例3中的脂质体用缺乏某些补体因子或脂蛋白人血清(SIGMA-Aldrich)温育，并分析它们介导对HeLa细胞的RNAi作用的能力。
如表8中所证明的，通过除去脂蛋白可以恢复转染效率。除去补体因子是无效的。
表8：在缺乏各种因子的血清中恢复细胞转染
 siRNA类型  siRNA浓度   血清   细胞存活(％)
 PLK1  50nM   无   7
 PLK1  50nM   人，完整   98
 PLK1  50nM   人，无C3补体因子   91
 PLK1  50nM   人，无C9补体因子   98
  PLK1   50nM   人，缺乏脂蛋白   18
  无   无   无   100
实施例5-使用胍基脂质的抗血清转染。
如实施例1所述由PONA∶阴离子脂质∶胆固醇(x∶y∶20摩尔％)构建一系列脂质体，并装载活性siRNA和对照siRNA。如表中所示，在该系列脂质体中，阳离子组分PONA和阴离子脂质CHEMS或DMGS的比例系统地在0.33-2之间变化。阳离子脂质∶阴离子脂质的比例为1或更高的脂质体另外补充有2摩尔％DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)，以避免颗粒的聚集。此修饰在表中以“+”表示。用C/A＜1的颗粒的对照反应未显示出转染性质在存在PEG脂质和不存在PEG脂质的情况下的变化。
如实施例2所述，培养并维持HeLa细胞，并将人或小鼠来源的血清(SIGMA-Aldrich)直接添加至细胞，持续120分钟。随后，将脂质体以50pM-50nM的浓度添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。转染效率在此以IC50(抑制50％细胞增殖所需的浓度)表示。因此，低IC50值表示高度有效的转染。
由表9中的结果显而易见，添加血清仅略微影响由实施例的脂质体介导的siRNA转染。对于获自PONA∶CHEMS的包含少量阴离子脂质的脂质体，仍观察到一些抑制(比例0.33和0.5，用小鼠血清的抑制特别强)。
表9：包含胍基部分的脂质体在存在血清的情况下的转染效率
实施例6-胍基头基的重要性
如实施例5所述，制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例的一系列脂质体，并装载siRNA。阳离子脂质成分为PONA、PONamine和PONammonium，阴离子脂质为CHEMS，并将胆固醇含量固定为20摩尔％。阳离子∶阴离子脂质比例为1或大于1的脂质体另外补充有2摩尔％DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)，以避免颗粒的聚集。此修饰在表中以“+”表示。
如实施例2所述，培养并维持HeLa细胞，并将人或小鼠来源的血清(SIGMA-Aldrich)直接添加至细胞，持续120分钟。随后，将脂质体以50pM-50nM的浓度添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。如实施例5中所述，转染效率在此以IC50表示。
由表10中的数据显而易见，在存在血清的情况下，仅PONA介导HeLa细胞的转染，而PONamine和PONammonium都不介导HeLa细胞的转染，并且其中PONammonium的介导甚至更低。这一点在更积极地抑制转染的小鼠血清的情况下最为显著。过量的阳离子脂质成分在某种程度上补偿了血清导致的活性损失，但也可能是由于这些脂质体对细胞的非特异性静电吸附。
表10：胍基头基对于细胞的抗血清转染的重要性。
实施例7-脂质体组成的优化
如实施例5所述，制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例的一系列脂质体，并装载siRNA。阳离子脂质成分为PONA，阴离子脂质为CHEMS、DMGS或DOGS，胆固醇含量在0-40摩尔％之间变化。阳离子脂质∶阴离子脂质比例为1或大于1的脂质体以及一些其他脂质体另外补充有2摩尔％DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)，以避免颗粒的聚集。此修饰在表中以“+”表示。
如实施例2所述，培养并维持HeLa细胞，将脂质体以6nM-200nM的浓度添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。如以上实施例所述，转染效率在此以IC50表示。此外，测定装载有无活性siRNA(SCR)的脂质体的IC50，并计算IC50(SCR)和IC50(PLK1)之比。此参数的数值高表示PLK1 siRNA对细胞存活的极特异的抑制，载体贡献的低的非特异性作用，和总体的水平低的细胞毒性。
表11：CHEMS的优化结果。最低的和最高的可测IC50值分别为6nM和200nM。
表12：DMGS的优化结果。最低的和最高的可测IC50值分别为6nM和200nM。
表13：DOGS的优化结果。最低的和最高的可测IC50值分别为6nM和200nM。
实施例8-包含吡啶鎓脂质的脂质体
将SAINT-18用作阳离子脂质，其甲基化的吡啶鎓结构提供了带电荷的亚氨基部分。将CHEM、DMGS和DOGS单独地用作提供羧基官能团的阴离子脂质。如实施例5所述，制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例的一系列脂质体，并装载siRNA。脂质混合物另外补充有20或40摩尔％胆固醇。阳离子∶阴离子脂质比例为1或大于1的脂质体另外补充有2摩尔％DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)，以避免颗粒的聚集。此修饰在表中以“+”表示。
如实施例2所述，培养并维持HeLa细胞。将脂质体以50pM-50nM的浓度添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。如以上实施例所述，转染效率在此以IC50表示。此外，测定装载有无活性siRNA(SCR)的脂质体的IC50，并计算IC50(SCR)和IC50(PLK1)之比。此参数的数值高表示PLK1 siRNA对细胞存活的极特异的抑制，载体贡献的低的非特异性作用，并且总体水平低的细胞毒性。
表14：获自SAINT-18、CHEMS和胆固醇的脂质体的转染结果
表15：获自SAINT-18、DMGS和胆固醇的脂质体的转染结果
表16：获自SAINT-18、DOGS和胆固醇的脂质体的转染结果
由表14-16中的数据显而易见，大量两性脂质体即使在存在小鼠血清的情况下仍促进细胞转染。特别有用的是包含SAIT-18与二酰基甘油DMGS和DOGS的组合的脂质体，而与CHEMS的组合仅在C/A＝0.67时有效。与和PONA的组合相同，两性结构以高特异性转染细胞，而如SCR/PLK1低于2所表明的，C/A＞1的组合物不提供高特异性的转染。
通过考虑本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案和应用对本领域技术人员而言将是显而易见的。说明书和实施例应仅被认为是示例性的，发明的真正范围和精神由以下权利要求书所示。
实施例9-动电位测量
9.1 由PONA∶CHEMS∶CHOL形成的脂质体的动电位分析。
将包含x摩尔％PONA、y摩尔％CHEMS和20摩尔％胆固醇的100μl脂质混合物(20mM总脂质浓度，溶剂为异丙醇)注射入900μl包含10mM乙酸和10mM磷酸的缓冲剂(pH4)中。调节PONA和CHEMS的摩尔百分比X和Y，以获得表17中的C/A比例。
立即将悬浮液涡旋并添加3mL的pH调节缓冲剂。缓冲剂选自以下组中：50mM乙酸和50mM磷酸(使用NaOH调节至pH4、5、6.5或7.5)，或50mM Na2HPO4/50mM乙酸钠(pH9.4)。记录混合pH并与使用ZetasizerHSA3000监测的所得脂质颗粒的动电位一起示于下表17中。
表17：获自PONA∶CHEMS∶CHOL的脂质颗粒的动电位
  C/A比例   0,5   0,67   0,82   1,00   1,22   1,5   2,00
  最终pH
  7,56   -54,40   -58,90   -58,20   -61,80   -21,80   22,60   #NV
  7,20   -48,47   -46,00   -44,90   -50,00   -21,10   14,97   #NV
  6,32   -44,33   -37,07   -31,37   0,64   23,43   9,60   #NV
  4,84   19,67   18,00   22,15   31,80   32,77   32,57   28,37
  3,93   35,53   41,73   43,75   46,63   46,20   43,40   43,23
显然，所述颗粒即使是对于C/A为1.22(即大于1)的混合物也显示出两性特性。同样，在pH7.4下制备C/A为0.67、0.82或1的颗粒，并随后使其暴露于较低的pH。表17中所示的动电位没有明显变化。
9.2 其中的DOPA为阴离子脂质的组合的动电位测量
同样，由GUADACA和DOPA的二元混合物(脂质头基亚氨基/磷酸根的组合)制备脂质颗粒。以与9.1中所示的方式相同的方式制备颗粒，记录具有不同C/A比例的混合物的表18的动电位。
表18：获自GUADACA∶DOPA的脂质颗粒的动电位
  C/A   0,65   0,75   0,98   1,16   1,4
  最终pH
  4,5   21   13   38   46   51
  5,32   -24   22   20   33   35
  6,25   -8   -45   -30   2   24
  7,02   -61   -67   -8   -56   -6
  7,81   -67   -78   -76   -65   -21
与9.1中获得的颗粒相同，同样获得C/A＞1的具有两性特性的颗粒。同样，等电点的漂移符合预期。
9.3 DOTAP∶CHEMS∶CHOL的动电位测量。
为了比较，对其中的PONA用DOTAP取代的脂质混合物进行相同的测量。结果示于表19中。与PONA∶CHEMS相反，仅在C/A＜1下发现获自DOTAP∶CHEMS的两性颗粒。
表19：获自DOTAP∶CHEMS∶CHOL的脂质颗粒的动电位。
  C/A 比例   0,67   0,82   1   1,22
  最终pH
  7,56   -37,7   -21,63   4,9   13,25
  7,20   -50,17   -24,1   #NV   12,55
  6,32   #NV   #NV   11,43   7,37
  4,84   25,6   32,1   20,27   9,3
  3,93   52,13   43,93   47,77   12,15
实施例10-CHOLGUA的合成。
将25g胆固醇氯甲酸酯和50当量(eq.)的乙二胺溶于二氯甲烷中，并在20℃下反应6h。使用色谱法和结晶分离氨基乙基氨基甲酰-胆固醇。产量为28.7g，纯度为90％。
由先前分离的氨基乙基氨基甲酰-胆固醇合成CHOLGUA。使用1.5eq.的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和4eq.的N，N-二异丙基乙基胺在二氯甲烷/乙醇中将30g的所述物质在20℃下温育16小时，之后通过色谱法分离产物。纯度为95％，收率为16.5g。
实施例11-DACA、PDACA和MPDACA的合成
将42.4g油醇、2.5eq.二异丙基偶氮二羧酸酯、2.5eq.三苯基膦和5eq.LiI在20℃下在四氢呋喃(THF)中反应24小时。通过色谱法分离油基碘化物，纯度为90％，产量为13.4g。
在第二步骤中，将10g油酸与2.2eq.的二异丙基氨基锂在20℃下在THF中混合0.5小时，之后添加1eq.油基碘化物。将混合物在20℃下温育2小时，并使用色谱法自反应混合物中纯化DACA。纯度为95％，产量为14.96g。
对于PDACA的合成，将2g DACA、1.2eq.的4-氨甲基吡啶、1.4eq.的O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐和4eq.的N-甲基吗啉在20℃下在THF中混合24小时。将反应混合物纯化(包括色谱法)。PDACA的纯度为95％，产量为1.72g。
对于MPDACA的合成，将2g PDACA与2eq.的硫酸二甲酯一起溶于THF中，将混合物在20℃下温育16小时，之后通过色谱法纯化MPDACA。MPDACA的纯度：95％，产量：1.71g。
实施例12-GUADACA的合成。
在第一步中，将3.5g DACA和1.5eq.的1，1′-羰基二咪唑溶于二氯甲烷中并在20℃下温育16小时，之后添加30eq.的乙二胺。将反应混合物在20℃下温育4小时，之后，纯化氨基乙基-DACA(包括色谱法)。纯度为90％，产量为3.2g。
由氨基乙基-DACA合成GUADACA，为此，将3.2g氨基乙基-DACA、2.5eq.的1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和12eq.的N，N-二异丙基乙胺在20℃下温育3小时，之后分离GUADACA。纯度：95％，产量：2.24g。
实施例13-BADACA的合成
根据以下方法由DACA合成BADACA：将4.15g DACA、1.2eq.的对氨基苄脒、1.2eq.的N，N-二环己基碳酰二亚胺和3eq.的4-二甲基氨基吡啶在无水二甲基甲酰胺中混合，并在70℃下温育16小时。使用色谱法自反应中分离BADACA。纯度：95％，产量：1.62g。
实施例14-基于DACA或胆固醇的阳离子脂质与羧基脂质的组合的抗血清 转染
如实施例5所述，制备具有系统地变化的阳离子脂质成分和阴离子脂质成分比例的一系列脂质体，并装载siRNA。阳离子脂质组分为CHOLGUA、CHIM、DC-CHOL、TC-CHOL、GUADACA、MPDACA、BADACA和PDACA。阴离子脂质为CHEMS、DMGS或DOGS，且胆固醇含量为20或40摩尔％，所有的脂质混合物都示于数据表中。阳离子∶阴离子脂质比例为1或大于1(C/A＞＝1)的脂质体另外补充有1.5摩尔％的DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)。
如实施例2所述，培养并维持HeLa细胞，将小鼠血清(SIGMA-Aldrich)直接添加至细胞，持续120分钟。随后，将脂质体添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。对于在不存在小鼠血清的情况下或存在小鼠血清的情况下的实验，脂质体的最高浓度分别为40nM和36nM。如实施例5所述，转染效率在此以IC50(nM siRNA)表示。该筛选试验的所有结果都示于图1-6中。
如极低的IC50值所示，许多转染混合物都产生了极有效的siRNA对HeLa细胞的转染。包含亚氨基脂质(例如CHOLGUA)的脂质组合即使在存在小鼠血清的情况下也仍保持有效的转染子，包含MPDACA、GUADACA或PONA的脂质组合更是如此。
实施例15-若干阳离子脂质与磷酸脂质的组合的抗血清转染
如实施例5所述，制备C/A比例为0.75或1的一系列脂质体，并装载siRNA。阳离子脂质组分为CHOLGUA、CHIM、DC-CHOL、GUADACA、MPDACA、BADACA、PONA、DOTAP或DODAP。阴离子脂质为DOPA，且胆固醇含量为40摩尔％，所有的脂质混合物都示于表20中。脂质体另外补充有1.5摩尔％的DMPE-PEG2000(Nippon Oils and Fats)。
如实施例2所述，培养并维持HeLa细胞，将小鼠血清(SIGMA-Aldrich)直接添加至细胞，持续120分钟。随后，将脂质体添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。如实施例5所述，转染效率在此以IC50(nM siRNA)表示。
如极低的IC50值所示，许多转染混合物都产生siRNA对HeLa细胞的极有效转染。包含亚氨基脂质(例如CHOLGUA)的脂质组合即使在存在小鼠血清的情况下仍保持有效的转染子，包含MPDACA、GUADACA或PONA的脂质组合更是如此。
表20：在存在小鼠血清的情况下和不存在小鼠血清的情况下各脂质体的IC50值(nM siRNA)。血清抑制“无效”是指在存在小鼠血清的情况下没有最小效力，在这些情况下无法确定抑制因子。测试中siRNA的最高浓度为146nM。
实施例16-在不存在带负电荷的脂质的情况下抗血清转染差
由阳离子脂质和作为中性脂质的胆固醇制备一系列脂质体。在这些配制物中未使用阴离子脂质。阳离子脂质组分为CHOLGUA、CHIM、DC-CHOL、ADACA、GUADACA、MPDACA、BADACA、PONA、DOTAP和DODAP，并使用实施例5中描述的方法制备所述脂质体。胆固醇含量为40摩尔％，脂质体另外补充有1.5摩尔％的DMPE-PEG2000(Nippon Oils andFats)，以在存在siRNA的情况下避免聚集体形成。
如实施例2所述，培育并维持HeLa细胞，将小鼠血清(SIGMA-Aldrich)直接添加至细胞，持续120分钟。随后，将脂质体添加至细胞，继续温育72小时，并如上所述测定细胞存活。如实施例5所述，转染效率在此以IC50(nM siRNA)表示。
获得的结果示于下表21中。在所有情况下，转染效率都大大低于另外还包含阴离子脂质的混合物的转染效率。除GUADACA或PONA以外，在存在小鼠血清的情况下没有可检测的活性。
表21：在存在小鼠血清的情况下和不存在小鼠血清的情况下各脂质体的IC50值(nM siRNA)。血清抑制“无效”是指在存在小鼠血清的情况下没有最小效力，在这些情况下无法确定抑制因子。在不存在小鼠血清的情况下或存在小鼠血清的情况下，测试中siRNA的最高浓度分别为160或146nM。

Claims (20)

1.包含阴离子两亲分子和阳离子两亲分子的脂质装配体；其中所述阳离子两亲分子的至少一部分是在生理条件下带电荷的亚氨基脂质，其中所述阴离子两亲分子是羧基或磷酸脂质，并且其中此外所述阳离子两亲分子和所述阴离子两亲分子之间的电荷比例为1.5或更低，所述阳离子两亲分子的带电荷的亚氨基基团的pK大于7.5，并且选自亚胺、脒、吡啶、2-氨基吡啶、杂环氮基、胍基部分、异脲或硫代异脲。
2.如权利要求1所述的包含阴离子两亲分子和阳离子两亲分子的脂质装配体，其中所述阳离子两亲分子的至少一部分是在生理条件下带电荷的亚氨基脂质，其中此外所述阴离子两亲分子的至少一部分是羧基脂质，并且其中所述阳离子两亲分子和所述阴离子两亲分子之间的电荷比例小于或等于1.5。
3.如权利要求1或2所述的脂质装配体，其包含脂质的组合，其中所述组合的阳离子脂质包含胍基部分且所述组合的阴离子脂质包含羧基基团，进一步的特征在于所述胍基部分和所述羧基基团的电荷比例小于或等于1.5。
4.如权利要求1所述的包含阴离子两亲分子和阳离子两亲分子的脂质装配体，其中所述阳离子两亲分子的至少一部分是在生理条件下带电荷的亚氨基脂质，其中此外所述阴离子两亲分子的至少一部分是磷酸脂质，并且其中所述阳离子两亲分子和所述阴离子两亲分子之间的电荷比例小于或等于1.5。
5.如权利要求1所述的脂质装配体，其中所述阳离子两亲分子选自包括结构l1-l113、结构A1-A21或结构L1-L17的组中，其中根据pK大于7.5进一步选择所述组的成员。
6.如权利要求1所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述阳离子脂质选自PONA、CHOLGUA、GUADACA、MPDACA或SAINT-18。
7.如权利要求1所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述阴离子脂质选自CHEMS、DMGS、DOGS、DOPA或POPA。
8.如权利要求1所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述装配体的阳离子脂质和阴离子脂质的电荷比例为0.5-1.5.
9.如权利要求1所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述装配体为脂质体。
10.如权利要求9所述的脂质装配体，其进一步包含选自胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂或其混合物的中性脂质或两性离子脂质。
11.如权利要求10所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述中性脂质为胆固醇，并且所述脂质混合物中胆固醇的摩尔分数为10-50摩尔％。
12.如权利要求9、10或11所述的脂质装配体，其还包含PEG脂质。
13.如权利要求12所述的脂质装配体，其进一步的特征在于所述PEG脂质位于最外侧的膜叶中。
14.如权利要求9所述的脂质装配体，其还包含活性药物成分。
15.如权利要求14所述的脂质装配体，其中所述药物成分为寡核苷酸。
16.如权利要求15所述的脂质装配体，其中所述寡核苷酸为诱饵寡核苷酸、和反义寡核苷酸、siRNA、核酶、DNAzyme或适配体。
17.如权利要求16所述的脂质装配体，其中所述寡核苷酸包括经修饰的核苷酸，其选自磷酸二酯或硫代磷酸酯形式的DNA、RNA、LNA、PNA、2'Ome RNA、2'MOE RNA、2'F RNA。
18.如权利要求13所述的脂质装配体，其通过包括以下步骤的方法制备：(i)在存在活性成分的情况下形成并密封脂质体；和(ii)在所述步骤(i)之后单独添加PEG-脂质。
19.权利要求9-18任一项所述的脂质装配体在制备用于细胞的体内、体外或离体转染的药剂中的应用。
20.包含权利要求9-18任一项所述的脂质装配体的气溶胶在制备用于肺细胞的转染的药剂中的应用。
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