CN102462702A - 可抑制流感病毒血球凝集素的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可抑制流行性感冒病毒表面抗原蛋白质血球凝集素(Hemagglutinin，HA)活性的药物组合物及其制备方法，该药物组合物利用低温崩解蓝藻的制备方法包括下列步骤：(a)将蓝藻与非有机溶液混合形成含蓝藻的悬浮溶液；(b)将该含蓝藻的悬浮溶液以低于0℃以下的温度冷冻，形成冷冻块，再于低温中融解该冷冻块，重复此步骤两次以上；(c)分离该冷冻块融解后的蓝藻渣和蓝藻提取液；以及(d)收集分离后的提取液，其中，所收集的提取液为包含生物活性物质的药物组合物。此药物组合物可有效抑制A型及/或B型流行性感冒病毒的血球凝集素与唾液酸(sialic acid)结合，进而达到抑制流行性感冒病毒感染与复制的目的。对于具有神经胺酶(Neuraminidase)抑制剂抗药性的突变A型流行性感冒病毒，此药物组合物也能抑制其感染能力。

Description

可抑制流感病毒血球凝集素的药物组合物及其制备方法

技术领域

本案涉及一种可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的药物组合物及其制备方法，尤其涉及一种利用低温崩解蓝藻的制备方法，所获得的提取物可有效抑制A型及/或B型流行性感冒病毒的血球凝集素与唾液酸(sialic acid)结合，进而达到抑制流行性感冒病毒感染与复制的目的。对于具有神经胺酶(Neuraminidase)抑制剂抗药性的突变A型流行性感冒病毒，此药物组合物也能抑制其感染能力。

背景技术

藻类的种类繁多，植物学家根据其所含的色素种类、细胞核和细胞构造的特征，把藻类分为九大门，其中海水中的藻类称为海藻，海藻的植物体是多细胞体，其大小和形状的变化很大，小者只有数毫厘，大者有如巨藻可达六十公尺长。因此，海藻由体型大小区分为微藻与巨藻两大类型。而生长在温带地区的海藻，较多大型的，其海藻的植物相也较丰富；相反的，在亚热带和热带地区的海藻都较小，其海藻的植物相也较贫乏。若依所产生的色素类别，海藻可有蓝藻、绿藻、褐藻和红藻四大群。这些海藻都生长在潮间和较浅的潮下带的岩石或礁石上。

以马尾藻为例，分类上属于褐藻，型态上属于巨藻，台湾有二十余种，为台湾产海藻中，种类和产量最多也最大型的海藻，可长到二公尺多高。马尾藻植物体的构造也是藻类中最复杂的，有大型盘状，或枝状附着器外，有如高等植物的茎、枝和叶的部份，此外亦有气泡和生殖托等器官。

以蓝藻为例，蓝藻是属于微藻，属于原核生物，又叫蓝绿藻或蓝细菌，种类包括有蓝球藻、颤藻、螺旋藻和念珠藻。在所有藻类生物中，蓝藻是最简单、最原始的一种。蓝藻是单细胞生物，没有细胞核，但细胞中央含有核物质，通常呈颗粒状或网状，染色质和色素均匀的分布在细胞质中。该核物质没有核膜和核仁，但具有核的功能，故称其为原核。

由于藻类的型态、色素颜色与细胞构造差异性大，因此在培养的环境、藻内所含的生物活性物质均不相同，相对于各种藻类有效生物活性物质的提取方法也就有所不同，如巨藻在提取前因为其体积庞大，故应先进行切碎的步骤，而微藻由于其体积微小，因此，不需经过任何切碎的动作，但提取的困难度在于打破细胞壁以及去除胞壁外面的胶质衣，并且在提取步骤操作同时仍保有提取物中生物活性物质的活性。

微藻是存在于地球数十亿年的光合生物，可利用二氧化碳作为其生物燃料，并由于富含与人类本身相当相似的胺基酸、维生素、矿物质、钙、磷、铁等矿物元素、-胡萝卜素、泛酸、叶酸、生物素以及含有藻胆素(是藻红素、藻蓝素和别藻蓝素的总称)等，可被制造成营养价值极高的膳食补充品、食品、饮料或动物饲料的添加物。

而蓝藻属于微藻中的一种，除了具有前述微藻所具备的物质或元素，目前有研究成果指出蓝藻提取液对微小病毒科(Picornaviridae)及副黏液病毒科(Paramyxoviridae)的麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类疱诊病毒及HIV病毒具有抑制效果。再者，螺旋藻又为蓝藻中的一种藻类，亦富含蛋白质(占干重60～70％)、维生素(B₁₂和β-胡萝卜素含量高)、矿物质、必需胺基酸和脂肪酸，特别是γ-次亚麻油酸(GLA)含量丰富。因此，螺旋藻将成为重要的营养来源以及抑制病毒复制的药物组合物原料来源。

流行性感冒为滤过性病毒所引起的病症，分类上属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，依引起的血清免疫反应区分为A型、B型及C型流感，其中A型流感再以病毒表面的血球凝集素(hemagglutinin，HA)及神经胺酶(neuroaminidase，NA)分类，常见会在人群中造成传染流行的血清型为H₁N₁及H₃N₂。

入侵宿主细胞为病毒生活史开始的重要步骤，以流感病毒(influenza virus)为例，负责此步骤的蛋白质即为血球凝集素(hemagglutinin)，当血球凝集素辨识了呼吸道内皮细胞表面的的唾液酸(sialic acid)，并且两者结合后，就会引发胞饮作用将病毒吞噬进去，之后病毒外鞘被酵素作用破裂，释放出RNA组成的病毒基因物质及蛋白质，最后这些物质进入细胞核内，开始病毒的复制过程。由此可见，血球凝集素应是抗流感病毒药物开发上很重要的一个标的物，然而目前尚无抑制血球凝集素相关之药物。

近年来引起恐慌的H₁N₁新型流感即是属于会造成大流行及严重并发症的A型流感，虽然可以克流感或乐瑞沙等药物治疗或施打疫苗预防，但现有药物属于神经胺酶抑制剂，目前临床上已出现具克流感抗药性的突变A型流行性感冒病毒株，研究报告指出其中该突变的A型流行性感冒病毒是神经胺酶蛋白质序列第274位置的组胺酸(Histidine，H)产生变异。

此外，B型流感病毒所引起的症状包括全身酸痛、发烧、喉咙痛、咳嗽、全身无力和倦怠感等，甚至会引起支气管炎、肺炎及脑炎等并发症。B型流感虽会引起地区性流行，但症状通常较A型病毒温和，但仍不可不慎。虽然临床上多以治疗A型流感的药物治疗B型流感，但研发对B型流感病毒专一的药物将有助于抑制B型流感爆发。

美国专利公告号US7220417揭露一种褐指藻，其褐指藻属于巨藻，提取方法为在室温加溶剂浸软藻类，再于-20℃～-40℃冷冻1～7天，最后再加入溶剂并加热，此篇专利主要应用于巨藻的提取方法，虽然有使用冷冻技术，但仍无法有效提取出有效打破细胞璧，提取出活性成分，因此再加入有机溶剂且加热，此与本发明的低温崩解技术并不相同。

美国专利公告号US20090042801揭露一种含C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白、蓝藻精及其混合物所制成的药物组合物，此专利为发明人先前技术，该蓝藻提取物所制造的药物组合物是透过下列制备方法所取得：(a)混合有机蓝藻粉及低张缓冲液；(b)于室温以下温度静置过夜；(c)以分离机分离纯化；(d)测定上层液的光谱及成分含量；以及(e)喷雾干燥。其特征在于使用0℃至18℃的低温制备法。此为发明人透过较繁复的蓝藻制备步骤，需长时间进行才能提取得到少量的有效活性物质，由于操作系统繁复耗时费力，所取得的有效活性物质产量不大，因此发明人再次针对制备步骤进行改良，针对制备步骤的低温崩解技术进行开发，不但简化过去繁复的制备过程，且大大提高所提取的活性物质活性、浓度也较以往要高。

因此，蓝藻中具有许多可以抑制病毒的活性物质，目前，虽然已有许多藻类的提取技术提出，但是受限于蓝藻的生物特性，由于其细胞壁的构造，故若要取得细胞内部的有效活性物质必须要破坏细胞壁，传统的破坏细胞壁方法包括煮沸、珠磨、超音波震荡等，然而这些方法都会产热，相对的会使高活性物质失去活性，此外，亦有其它发明人选择使用有机溶剂将细胞壁去除，但所取得的提取物质与本发明所提取的物质活性特性完全不同，生物活性及功效亦不相同。

因此，要能有效打破细胞壁并提取蓝藻内物质的活性一直是该领域极欲克服的难题，因此在极为具有挑战性的技术瓶颈中，本发明研发具有能提取出更多样性、更完整高生物活性物质的蓝藻提取物，并且该蓝藻提取物具有抑制突变的A型流行性感冒病毒与B型流感病毒感染与复制的药物，对于现在大环境具有非常急迫的需求，因为此发明的蓝藻提取物可制造成有效药物，将有助于全球治疗与预防流行性感冒病毒扩散与传染。

本案申请人鉴于已知技术中的不足，经过悉心试验与研究，并一本锲而不舍的精神，终构思出本案“可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的药物组合物及其制备方法”，能有效，且能够克服先前技术的不足，以下为本案的简要说明。

发明内容

为了克服先前技术中提取具有高活性物质的蓝藻提取液的困难，尤其要避免高温的加热使得提取液中的高活性物质尚失功能，并且全程不使用有机溶剂以避免毒性溶剂的残留，确保提取物质具有高度食用安全性；因此，本发明以新颖的低温崩解提取方法制备出蓝藻(或螺旋藻)提取物，可有效抑制A型流行性感冒病毒、A型流行性感冒病毒抗药性突变种、及B型流感病毒的感染与复制。

本发明提出一种低温崩解蓝藻的制备方法，包括下列步骤：(a)将蓝藻与非有机溶液混合形成含蓝藻的悬浮溶液；(b)将含蓝藻的悬浮溶液以低于0℃以下的温度冷冻，形成冷冻块，再于低温中融解冷冻块，重复此步骤两次以上；(c)分离冷冻块融解后的蓝藻渣和蓝藻提取液；以及(d)收集分离后的提取液，其中，所收集的提取液为包含生物活性物质的蓝藻提取液。

优选地，蓝藻可为螺旋藻。

优选地，所述非有机溶液的重量与所述蓝藻的重量之比≥2∶1，优选为2∶1～10∶1。

优选地，所述非有机溶液为水、低张溶液、缓冲液或生理食盐水。

优选地，步骤(b)中所述冷冻温度低于-10℃，进一步优选为-10℃～-30℃；步骤(b)中所述的融解温度介于0℃～4℃。

优选地，所述的生物活性物质选自异藻蓝蛋白、含硫多糖体、C-藻蓝蛋白中的一种或多种。

优选地，上述方法还包括浓缩步骤，将蓝藻提取液进行浓缩，获得浓缩蓝藻提取液。

优选地，上述方法还包括干燥步骤，将蓝藻提取液形成粉末状。

本发明另一方面提出一种抑制A型和B型流行性感冒病毒感染与复制的药物组合物，该药物组合物由上述低温崩解的制备方法所得到的蓝藻提取液。

优选地，所述有效量的药物组合物选自异藻蓝蛋白、含硫多糖体、C-藻蓝蛋白中的一种或多种。

优选地，所述A型流行性感冒病毒进一步包含突变的A型流行性感冒病毒，所述突变的A型流行性感冒病毒是指对克流感产生抗药性的病毒。

优选地，该药物组合物适用于预防或治疗流行性感冒。

优选地，上述药物组合物还包含一种医药可接受载体。

优选地，该载体为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、界面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料。

优选地，所述药物组合物为粉末、颗粒、液体、胶体或膏体。

优选地，所述药物组合物被制造为药品、食品、饮料、膳食补充品或动物饲料的添加物。

优选地，所述药物组合物是通过口服、经皮吸收、注射或吸入的方式进行传输。

优选地，所述药物组合物是传输至哺乳动物。

优选地，该哺乳动物为人类。

本发明又一方面提出一种抑制A型和B型流行性感冒病毒感染与复制的方法，包括下列步骤：提供蓝藻提取液；及将蓝藻萃取液与所述A型和B型流行性感冒病毒接触；其中，所述蓝藻提取液是按照如权利要求1所述制备方法所得到的蓝藻提取液。

优选地，其中所述蓝藻提取液选自异藻蓝蛋白、含硫多糖体、C-藻蓝蛋白中的一种或多种。

附图说明

图1为以本发明螺旋藻提取物治疗受A型流感病毒感染BALB/c小鼠后的小鼠体重变化示意图。

图2为以本发明螺旋藻提取物治疗受B型流感病毒感染BALB/c小鼠后的小鼠体重变化示意图。

图3为以本发明螺旋藻提取物进行血球凝集抑制试验HAI的示意图。

图4a为预先口服100mg/kg/day螺旋藻提取物的BALB/c小鼠受A型流感病毒感染后的小鼠体重变化示意图。

图4b为预先口服100mg/kg/day螺旋藻提取物的BALB/c小鼠受A型流感病毒感染后的临床症状示意图。

图5为本发明的螺旋藻提取物对克流感抗药性的A型流感病毒株的抑制示意图。

图6为不同浓度的螺旋藻提取物抑制不同种流感病毒的病毒斑形成量示意图。

图7为螺旋藻提取物及其不同成分抑制不同流感病毒株的示意图。

图8为低温崩解蓝藻的制备方法流程图。

图9a为低温崩解法制备的螺旋藻提取物有效成分HPLC分析图。

图9b为低温超音波震荡法制备的螺旋藻提取物有效成分HPLC分析图。

图9c为热水煮沸法制备螺旋藻提取物有效成分HPLC分析图。

图10a为它牌螺旋藻粉-1的螺旋藻提取物有效成分HPLC分析。

图10b为它牌螺旋藻粉-2的螺旋藻提取物有效成分HPLC分析及抑制病毒能力的相关性。

具体实施方式

本案所提出之“可抑制流感病毒血球凝集素(Hemagglutinin)的药物组合物及其制备方法”将可由以下的实施例说明而得到充分了解，使得熟习本技艺的人士可以据以完成，然而本案的实施并非可由下列实施例而被限制其实施型态，熟习本技艺之人士仍可依据除既揭露的实施例的精神推演出其它实施例，该等实施例皆当属于本发明的范围。

实施例1：低温崩解蓝藻的制备方法

实施例1以蓝藻中的螺旋藻粉作为实验材料。参阅图8的步骤流程，步骤101：在改良式的藻类制备方法中，首先将螺旋藻粉加入非有机溶液中如纯水、低张溶液、缓冲液或生理食盐水至螺旋藻粉与纯水重量比为1∶2～1∶10，充分搅拌均匀。步骤102：接着，将此螺旋藻悬浮溶液分装置适当容积的离心瓶中，并将螺旋藻悬浮溶液置于0℃以下的冷冻库或是利用干冰使其螺旋藻悬浮液快速结成冻块状，其中最好的温度为-10℃～-30℃，在冷冻8～24小时之后，在低温下缓缓解冻该冷冻块，回融的温度可控制在0℃～4℃缓慢回温，进一步可利用振动、搅拌…等方式协助冻块回融。依序重复前述的冷冻崩解步骤，将螺旋藻悬浮溶液冷冻及低温解冻步骤重复2次或2次以上，步骤103：将回融后的悬浮液置于离心瓶中高速离心1小时；分离藻渣及螺旋藻提取液。步骤104：收集分离后的提取液，其中，所收集的提取液为包含生物活性物质的螺旋藻提取液。

依据提取液未来产品使用的需求，如欲制高浓度的浓缩液，可使用多种浓缩方式进行浓缩，如旋转浓缩仪或使用减压浓缩法，以低温低压方式进行。将温度范围设定在20～40℃，压力范围设定为15000～50000毫米汞柱，当持续至少8小时，可得到浓缩液。如产品型态为锭剂、粉状，可再进一步进行将所获得的浓缩液再进行冷冻干燥，最后会形成粉末状产物，任何型态的产物中均含有高浓度、高活性的C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分。将所收集的提取物进行(1)成分纯度的测定、(2)活菌数及(3)含水量的测定，以作为产品质量的标准规格。所获得的提取物质量的标准规格为：(1)成分纯度A620/A280>0.6、A651/A620＝0.3～0.5及A670/A620<0.12(以紫外光-可见光分光光谱仪侦测吸光光谱200～700nm)，(2)活菌数为<1×10⁵cfu/g，(3)含水量<7％。

所属技术领域中具有通常知识者亦可使用微藻或蓝藻，并应用前述的低温低压方法制备出提取物。

实施例2：不同制备方法的蓝藻提取物及不同来源的蓝藻提取物其有效成分抑制流感病毒能力的比较

实施例2以蓝藻中的螺旋藻作为实验材料。由于欲了解不同制备方法产出的螺旋藻提取物及不同来源的螺旋藻提取物，其中成份组成与抑制流感病毒能力的相关性将以高效液相层析仪(HPLC)分析及病毒中和试验来进行。

高效液相层析仪(HPLC)分析，以分析管柱选用Gel filtration(ShodexKW-803)，以1×PBS buffer为流动相，流速为1ml/min。HPLC仪器规格为Detector：ECOMLCD2083；Pump：ECOMLCP4100；Fixed Syringe：SLC-1F-25。将螺旋藻提取物以1×PBS buffer回溶成浓度50mg/ml，取200μl进行HPLC分析，观测波长为220nm。

另外利用病毒中和试验分析抑制病毒能力。在96孔盘的每个孔(well)中加入130μl的PBS。在第一排的上四孔(A1～D1)中加入130μl的螺旋藻提取物，接着取130μl往右依序做2倍的序列稀释至第10排(A10～D10)，再由第一排的下四排(E13～H13)接着做序列稀释至E22～H22。取150μl的稀释病毒液至MDCKcell的96孔盘；而A11～H11为细胞控制(cell control)的位置，则加入150μl不含FBS的DMEM；A1～A10及H13～H22为药物控制(drug control)的位置，亦加入150μl不含FBS的DMEM。置于5％CO₂的35℃培养箱中培养1小时。由药物稀释平板(drug dilution plate)中取50μl混合液至相对应的well中，再置回培养箱培养64小时。最后用100μl的10％福尔马林固定细胞1小时，再以0.1％结晶紫染色15分钟。以酵素免疫微盘分析仪(ELISA Reader)在570nm读取吸光值。再利用公式求IC₅₀。

利用低温崩解法(图9a)和一般藻类提取较常使用的方法比较，如低温超声波震荡法(图9b)和热水煮沸法(图9c)制备的螺旋藻提取物以HPLC分析后，可以看出本发明制程(低温崩解)所产出的螺旋藻提取物大致分为3个主要波峰，而其它两种制备方法产出的螺旋藻提取物则成份复杂，因此由HPLC分析的结果明显可以看到所萃取出来的蓝藻提取液成份明显不同。进一步将这些混合物进行病毒中和试验测定，由IC₅₀的数据显示，本发明低温崩解制程所制造产出的螺旋藻提取液具有最好的抑制流感病毒的效果(如表1)。

表1不同提取方法制备的螺旋藻提取液抑制流感病毒试验

方法	半抑制浓度(IC50)	标准差(SD)
			低温崩解法	0.570	0.028
低温超音波震荡法	0.695	0.163
			热水煮沸法	无抑制效果	无

整合病毒中和试验与HPLC图谱的比较，三种螺旋藻制备方法的结果其最大差异在于第一个波峰的含量，推测其第一个波峰含有高浓度、高活性的C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等主要有效成分(图9a)。

不同来源的螺旋藻，经过本发明制程(低温崩解)提取后，比较螺旋藻提取物(图9a)与它牌螺旋藻粉-1(图10a)、它牌螺旋藻粉-2(图10b)的HPLC图谱及IC50(如表2)。

表2不同来源的螺旋藻提取物抑制流感病毒试验

显示经由低温崩步骤萃取得到的螺旋藻提取物与不同来源的藻粉材料它牌螺旋藻粉-1(图10a)、它牌螺旋藻粉-2(图10b)，均有明显的病毒抑制效果，所以，这结果显示不同提取的流程所提取得到的蓝藻提取液组成对于抑制病毒功效极大。

实施例3：含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻提取物的动物毒理试验

将含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻提取物依据《国际经济合作与发展组织(OECD)425口服急性毒理试验规范》进行极限剂量毒性试验，口服测试药物(对照组)浓度为5000mg/kg。结果发现本发明的螺旋藻提取物的50％致死剂量(median lethal dose，LD₅₀)大于5000mg/kg。另外依据国际OECD407规范，以SD大鼠以灌食方式给予本发明的螺旋藻提取物(剂量：3000mg/kg/day)，进行连续28天亚急毒测试。实验结果显示：在大鼠连续口服螺旋藻提取物28天后并无任何毒性与副作用产生。

实施例4：含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻提取物抑制A型流感病毒株与B型流感病毒株感染的动物试验

接着，以含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻提取物进行“抗流感药物的动物疗效试验”，发现剂量范围介于25～100mg/kg/day的螺旋藻提取物皆可提高受流感病毒感染的BALB/c雌性小鼠存活率，实验结果亦发现在感染流感病毒前给药，则具有较良好的疗效。详细实验及结果如下所述。

首先，在点鼻施予A型流感病毒(influenza AWSN virus，H₁N₁)前4小时喂食一次本发明的螺旋藻提取物给5周龄BALB/c雌性小鼠，之后再将3.4×10⁴pfu的A型流感病毒点鼻施予于小鼠，感染A型流感病毒6小时后再喂食一次螺旋藻提取物。之后每天灌食2次，持续5天，并比较服用剂量25mg/kg/day螺旋藻提取物组与病毒对照组(又称控制组)(仅施予H₁N₁病毒)的结果。图1，为以本发明螺旋藻提取物治疗受A型流感病毒感染BALB/c小鼠后的小鼠体重变化示意图。在图1中，病毒对照组在实验第8天造成小鼠全部死亡，然而只要给予25mg/kg/day的螺旋藻提取物，即可对感染A型流感病毒的小鼠产生保护效果。BALB/c小鼠于实验初期略有发病的轻微症状，伴随着体重减轻的现象，但是均可逐渐地恢复健康，体重也都明显回升。

在另一实验中，同样在点鼻施予B型流感病毒前4小时喂食一次本发明的螺旋藻提取物给5周龄BALB/c雌性小鼠，之后再将3.5×10⁵pfu的B型流感病毒点鼻施予于小鼠，感染B型流感病毒6小时后再喂食一次螺旋藻提取物。之后每天灌食2次，持续5天，并比较服用剂量25mg/kg/day螺旋藻提取物组与病毒对照组(仅施予B型流感病毒)的结果。图2，为以本发明螺旋藻提取物治疗受B型流感病毒感染BALB/c小鼠后的小鼠体重变化示意图。在图2中，相对于病毒对照组在第9天造成50％的实验老鼠死亡，造成该组平均体重曲线在第9天急速上升，喂食25mg/kg/day的螺旋藻提取物可对感染B型流感病毒的BALB/c小鼠造成明显的保护效果，所以存活率为100％，而且临床症状减轻许多。

而服用克流感

虽可使小鼠100％存活，但却产生如体重显着下降、咳嗽、毛发凌亂无光泽、活动力降低均无改善的临床症状。相对于本发明含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻提取物可有效治疗受A型流感病毒或B型流感病毒感染的小鼠，使其维持存活率及体重，并且不发生咳嗽、毛发凌乱无光泽、活动力降低等显着临床症状。

实施例5：确认含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻提取物可抑制A型流感病毒与B型流感病毒株的血球凝集素(HA)与唾液酸(sialic acid)结合

由于流感病毒表面的血球凝集素能与含唾液酸(sialic acid)的受体物质进行特异性结合，而红血球外膜上即具有这类唾液酸受体物质，当一定量的流感病毒和适当比例的红血球混合后，就会因为结合而产生血球凝集现象。若是加入的物质或抗体可干扰流感病毒和红血球的结合，就可观察到血球凝集被抑制的现象。图3，为以本发明螺旋藻提取物进行血球凝集抑制试验(Hemagglutinin InhibitionTest，HAI)的示意图。在图3中，螺旋藻提取物可有效抑制A型及B型流感病毒的血球凝集素造成的血球凝集现象，表示螺旋藻提取物具有阻碍血球凝集素与唾液酸作用的能力。根据流感病毒在宿主细胞复制、增殖的周期可知，螺旋藻提取物可于流感病毒感染宿主细胞的前中期进行有效抑制。

实施例6：预防流感试验

根据先前实施例结果显示：螺旋藻提取物可于流感病毒感染宿主细胞的前中期进行有效抑制，所以进行感染病毒前服用螺旋藻提取物，感染后即不再给与螺旋藻提取物的预防试验。首先，让4周龄的BALB/c雌性小鼠口服不同剂量的螺旋藻提取物连续7天后，再感染A型流感病毒(图4a、4b)或B型流感病毒，之后停止给予螺旋藻提取物，观察小鼠的体重变化及感染临床症状。预先口服100mg/kg/day螺旋藻提取物的小鼠对A型流感病毒或B型流感病毒的感染均可使存活率达到100％，体重方面缓慢增加(图4a)，没有一般感染后体重下降的问题，同时亦可显着减轻感染流感病毒的小鼠的临床症状(图4b)。临床症状0代表“无明显异常症状”；临床症状1代表“出现呼吸异常”；临床症状2代表“出现呼吸异常及毛发粗糙”；临床症状3代表“出现呼吸异常及毛发粗糙及可观察之活动力下降”。尤其，本发明的螺旋藻提取物对预防感染A型流感病毒的效果明显优于克流感药物。图4a中，克流感组于第9及第12天各有一只小鼠死亡，死亡率总计为33％，病毒感染组在第11、13、15天各有一只小鼠死亡，死亡率总计为50％，螺旋藻提取物组没有任何小鼠死亡。

实施例7：抑制对克流感药物具抗药性的A型流感病毒及2009年A型H1N1新流感病毒

由于目前已发现对克流感药物具有抗药性的A型病毒株，该突变的A型流行性感冒病毒的神经胺酶(neuraminidase，NA)蛋白质序列第274位置的组胺酸(H)产生变异，因此寻找替代克流感的药物即具相当急迫性。图5，为本发明的螺旋藻提取物对药物克流感抗药性的A型病毒株的抑制示意图。在图5中，1.5～3.0mg/ml的螺旋藻提取物可抑制突变的A型流行性感冒病毒的病毒斑形成，表示螺旋藻提取物可应用于治疗突变的A型流行性感冒病毒，尤其是对克流感产生抗药性的A型流感病毒株，该病毒突变的位置位于神经胺酶(neuraminidase，NA)蛋白质序列第274位置的组胺酸(H)。而且当螺旋藻提取物浓度为3.0mg/ml时，螺旋藻提取物可抑制多种流感病毒株(图6)。在图7中，螺旋藻提取物及其不同成分抑制不同流感病毒株的示意图。结果显示螺旋藻提取物及其成分C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体对于不同流感病毒株的50％抑制浓度，在浓度低于2.5mg/ml就有抑制效果。另外也测试螺旋藻提取物及其成分C-藻蓝蛋白及含硫多糖体对于2009年A型H1N1新流感病毒的抑制能力，在浓度低于1.0mg/ml就有50％抑制效果。

综上所述，本发明以低温崩解方法制备出的含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的高生物活性螺旋藻提取物，可有效抑制B型流感病毒的感染与复制，且对实验动物具有保护效果及减轻临床症状。再者，含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的螺旋藻(或蓝藻)提取物亦可抑制突变的A型流行性感冒病毒或对克流感产生抗药性的A型流感病毒株的活性。

由于目前市面上亦已经存在蓝藻的产品，因此，依据本发明低温崩解所提取的含有C-藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白及含硫多糖体等成分的高生物活性螺旋藻提取物可依产品设计的应用，如食品、饮料、膳食补充品或动物饲料的添加物及医药品，加工制作成不同的产品型态，如粉末状、颗粒状、液状、胶体状或膏体状；因此，使用者或是动物可藉由口服、注射、吸入或经皮吸收方式使用。

与先前技术的前案相较，本发明的制备方法及药物组合物具有新颖性及显着的进步性。本发明实属难能的创新发明，深具产业价值，援依法提出申请。此外，本发明可以由本领域技术人员做任何修改，但不脱离如所附申请专利范围所要保护的范围。

Claims (21)

1.一种低温崩解蓝藻的制备方法，包括下列步骤：

(a)将蓝藻与非有机溶液混合形成含蓝藻的悬浮溶液；

(b)将该含蓝藻的悬浮溶液以低于0℃以下的温度冷冻，形成冷冻块，再于低温中融解该冷冻块，重复此步骤两次以上；

(c)分离该冷冻块融解后的蓝藻渣和蓝藻提取液；以及

(d)收集分离后的提取液

其中，所收集的提取液为包含生物活性物质的蓝藻提取液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(a)中所述的非有机溶液的重量与所述蓝藻的重量之比≥2。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(a)中所述的非有机溶液为水、低张溶液、缓冲液或生理食盐水。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(b)中所述冷冻温度低于-10℃。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(b)中所述冷冻温度为-10℃～-30℃。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤(b)中所述融解温度为0℃～4℃。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述生物活性物质选自由异藻蓝蛋白、含硫多糖体、C-藻蓝蛋白中的一种或多种。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是还包括浓缩步骤，将所述蓝藻提取液进行浓缩，获得浓缩蓝藻提取液。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征是还包括干燥步骤，将所述蓝藻提取液形成粉末状。

10.一种抑制A型和B型流行性感冒病毒感染与复制的药物组合物，该药物组合物是选自如权利要求1所述制备方法所得到的蓝藻提取液。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述抑制A型和B型流行性感冒病毒感染与复制的药物组合物，是通过抑制病毒的血球凝集素与唾液酸结合的机制达成。

12.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述蓝藻提取液选自异藻蓝蛋白、含硫多糖体、C-藻蓝蛋白中的一种或多种。

13.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述A型流行性感冒病毒包含对克流感神经胺酶抑制剂产生抗药性的突变的A型流行性感冒病毒。

14.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述A型流行性感冒病毒包含2009年A型H1N1新型流行性感冒病毒。

15.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是还包含一种医药可接受载体。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征是所述载体为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、界面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料。

17.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述药物组合物为粉末、颗粒、液体、胶体或膏体。

18.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述药物组合物被制造为药品、食品、饮料、膳食补充品或动物饲料的添加物。

19.如权利要求10所述的药物组合物，其特征是所述药物组合物是通过口服、经皮吸收、注射或吸入的方式进行传输。

20.一种抑制A型和B型流行性感冒病毒感染与复制的方法，包括下列步骤：

提供蓝藻提取液；及

将蓝藻萃取液与A型和B型流行性感冒病毒接触；

其中，所述的蓝藻提取液是按照如权利要求1所述制备方法所得到的蓝藻提取液。

21.如权利要求20所述的方法，其特征是所述蓝藻提取液选自异藻蓝蛋白、含硫多糖体、C-藻蓝蛋白中的一种或多种。

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