CN102459571A - 抗炎细菌 - Google Patents

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Abstract

提供了表达导管素(cathelicidin)的乳酸菌以及利用这些乳酸菌的方法。还提供了包含所述乳酸菌的食品以及包含生物活性导管素的核酸编码序列的分离的核酸。

Description

抗炎细菌
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2009年6月4日提交的美国临时专利申请号61/184,226以及于2009年8月7日提交的美国临时专利申请号61/232,106的优先权，上述每篇临时申请通过引用并入用于所有目的。
发明背景
导管素(cathelicidin)抗微生物肽是在多形核白细胞(PMNs)的溶酶体中发现的多肽家族。导管素抗微生物多肽家族的成员的特征在于高度保守的区域(cathelin结构域)和高度可变的导管素肽结构域。导管素肽已经从多种不同种类的哺乳动物中分离出。导管素最初在嗜中性粒细胞中发现，但到目前为止已在许多其它细胞中发现，包括被细菌、病毒、真菌或激素1，25-D激活的上皮细胞和巨噬细胞。
LL-37是人类导管素蛋白。基因产物被合成为前肽(命名为“hCAP-18”)。参见，例如，Agerberth et al.，Proc Natl Acad Sci USA92：195-199(1995)。该前肽在细胞外被切割从而产生LL-37(Gudmundssonet al.，Eur J Biochem 238：325-332(1996))，LL-37具有广谱的抗微生物活性。参见，例如，Chromek，et al.，Nature Medicine 12(6)：636-641(2006)。
在质粒中编码的人类导管素(LL-37)能够促进大鼠胃的溃疡愈合。该肽本身能够通过转化生长因子α/表皮生长因子受体途径增加胃上皮细胞增殖。参见，Yang，Y.H.，et al.，J.Pharmacol.Exp.Therap.318：547-554(2006)。已表明导管素对小鼠溃疡性结肠炎有抗炎作用。参见，Tai，E.K.K.，et al.，Exp.Biol.Med.232，799-808(2007)。
发明概述
本发明提供了分泌生物活性导管素的转化的乳酸菌。在一些实施方案中，乳酸菌选自乳球菌属(Lactococcus sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)和双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)。在一些实施方案中，细菌是乳球菌(Lactococcus)。
在一些实施方案中，导管素的表达受诱导型启动子的调控。
在一些实施方案中，细菌包含导管素的核酸编码序列，并且该编码序列的密码子已被改良用于所述细菌种类。
在一些实施方案中，导管素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2基本上一致(例如，至少80％一致)。
本发明还提供了通过给予足以减少哺乳动物胃肠道中的炎症的量的本文描述的乳酸菌来减少哺乳动物胃肠道炎症的方法。
在一些实施方案中，每天给予哺乳动物108至1012CFU的细菌。在一些实施方案中，每天给予哺乳动物大于1010CFU的细菌。在一些实施方案中，给予细菌至少3天。在一些实施方案中，每天给予细菌，总共不超过7、10或14天。
在一些实施方案中，细菌在限定性体外培养条件下，以至少1pg/天的量分泌导管素。
在一些实施方案中，乳酸菌选自乳球菌属、乳杆菌属和双歧杆菌属。在一些实施方案中，细菌是乳球菌。
在一些实施方案中，哺乳动物患结肠炎或肠炎性疾病。在一些实施方案中，哺乳动物患克罗恩氏病(Crohns’disease)。在一些实施方案中，哺乳动物患结直肠癌或胃癌。在一些实施方案中，哺乳动物患有选自胃炎、胃溃疡或胃食管反流病(GERD)的疾病状态。
在一些实施方案中，导管素的表达受诱导型启动子的调控，并且该方法还包括给予足量的诱导子以诱导启动子在动物肠道内的表达。
在一些实施方案中，经口给予细菌。
在一些实施方案中，细菌与导管素肽共给药。
在一些实施方案中，导管素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2基本上一致(例如，至少80％一致)。
在一些实施方案中，哺乳动物是人。
本发明还提供了包含足以减少哺乳动物胃肠道中的炎症的量的本文所述的乳酸菌的食品。
在一些实施方案中，食品是饮料或半固体产品。在一些实施方案中，半固体产品是酸乳。
在一些实施方案中，导管素的表达受诱导型启动子的调控，以及食品还包含足量的诱导子以诱导启动子的表达。
本发明还提供了分离的核酸，其包含生物活性导管素的核酸编码序列，其中所述编码序列的密码子已被改良用于在乳酸菌中表达。在一些实施方案中，核酸还包含与编码序列可操作连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，编码序列包含至少一个改良的密码子，用于在乳球菌属、乳杆菌属或双歧杆菌属表达。定义
术语“分离的”当应用于核酸或蛋白时，表示核酸或蛋白基本上没有与其在天然状态下有关的其他细胞组分。它任选地为均质状态，以及可以在例如干或水性溶液中。通常利用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术来测定纯度和均一性。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其聚合物。除非特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参照核酸类似的结合特性。除非另外指明，特定核酸序列无疑还包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代物)、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代物可以通过产生以下序列实现：在该序列中，一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer et al.，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini et al.，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
“保守性修饰的变体”既适用于氨基酸序列，又适用于核酸序列。关于特定的核酸序列，“保守性修饰的变体”指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本上一致的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任一给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸被一密码子指定的每一位置，该密码子可以改变为所描述的任一对应的密码子，而不改变所编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，其是保守性修饰的变体的一种。本文编码多肽的每一核酸序列还描述了该核酸每一种可能的沉默变异。本领域技术人员会认识到，核酸中的每一密码子(AUG除外，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；以及TGG除外，其通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一种沉默变异都暗含在描述的每一序列中。
关于氨基酸序列，本领域技术人员会认识到，改变、添加或缺失了编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单独取代、缺失或添加是“保守性修饰的变体”，其中改变导致某一氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守性取代是本领域熟知的。这种保守性修饰的变体补充了但并不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。
下述8组中的每组都包含彼此为保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)
(参见，例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1984))。
还认识到，非天然存在的氨基酸可以用于取代生物活性蛋白中的一个或多个氨基酸。氨基酸在本文可以通过它们的公知三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过它们公认的单字母代码来提及。
如本文所用的，上下文中描述两个或多个多核苷酸或氨基酸序列的术语“一致的”或“一致性”百分比指比较和比对比较窗或指定区域的最大对应性时，利用下述序列比较算法之一或通过人工比对和目测所测量的相同的两个或更多个序列或亚序列，或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或亚序列(即，与参照序列如SEQ IDNO：1 or SEQ ID NO：2具有80％一致性的序列，优选85％，90％，91％，92％，93，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％一致性)。这样的序列被称为“基本上一致的”。关于多核苷酸序列，该定义还指测试序列的互补物。优选地，在长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上存在的一致性，或更优选地，在长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在的一致性。
对于序列比较，一条序列作为参照序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，如果需要的话，指定亚序列坐标，然后指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或者可以指定可选的参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的序列一致性百分比。
本文使用的“比较窗”包括对一段任一连续位置数的参考，该连续位置数选自20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150个位置，其中在某一序列与相同连续位置数的参照序列进行最优比对后，可以将这两条序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。可以通过下述来进行用于比较的序列的最优比对：例如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索方法、这些算法的计算机实施(威斯康辛遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(GeneticsComputer Group)，575 Science Dr.，Madison，WI)、或者人工比对和目测法(参见，例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，eds.1995补充))。
适于确定序列一致性百分比和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，这两种算法分别在Altschul et al..Nuc.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中描述。利用本文描述的参数，使用BLAST和BLAST 2.0来确定本发明核酸和蛋白的序列一致性百分比。用于运行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information)网站可为公众获得。该算法首先涉及通过在询问序列中识别短字长W来识别高评分序列对(HSP)，其当与数据库序列中相同字长比对时，匹配或符合某正值的阈值评分T。T被称为相邻字评分阈值(Altschul et al.，同上)。这些初始的相邻字符命中作为启动检索以发现含有它们的更长HSP的种子。字符命中在两个方向沿每一序列延伸直到可以增加累加比对评分。对于核苷酸序列，累加评分可以利用参数M(匹配残基对的奖励评分；总＞0)以及N(错配残基的惩罚评分；总＜0)来计算。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累加分值。当出现以下情况时停止每一方向的字符命中延伸：累加比对评分从其最大实现值下降X量时；由于一个或多个负评分残基比对的累积，从而使累加评分到零或以下时；或者到达每一序列的末端时。BLAST算法参数W，T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5，N＝-4和双链比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长为3、期望值(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))、比对(B)为50、期望值(E)为10，M＝5，N＝-4以及双链比较作为缺省值。
BLAST算法还在两条序列间进行相似性的统计分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列间匹配偶然发生的概率估计。例如，如果在测试核酸与参照核酸比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，以及最优选小于约0.001时，则核酸被视为与参照序列是相似的。
“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有允许特定核酸在宿主细胞中转录的一系列指定的核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。一般地，表达载体包括可操作连接到启动子的待转录的核酸。
“启动子”是指导核酸转录的核酸调控序列排列。
术语“可操作地连接”指核酸表达调控序列(诸如启动子、或转录因子结合部位排列)与第二核酸序列间的功能连接，其中表达调控序列指导对应于第二序列的核酸的转录。
本文使用的“导管素”指导管素抗微生物多肽家族的成员，其天然存在的前蛋白的特征为高度保守的区域(cathelin结构域)和高度可变的导管素肽结构域。后一结构域是生物活性的，即具有抗微生物活性。已经描述了多种导管素多肽，包括人类序列(CAP18，“LL-37”指该蛋白的活性、切割的部分)、小鼠蛋白(CRAMP)、绵羊蛋白(SC5)、牛蛋白(Bac5)、猪蛋白(PR-39)和鱼蛋白家族(参见，例如美国专利号7,351,693)。除了内源性产生的C-末端肽，导管素多肽C-末端区的更小片段已被描述为具有活性。参见，例如，美国专利公开号2009/0088382。
导管素具有与针对原型蛋白SEQ ID NOs：1或2产生的多克隆抗体结合的能力。在指定的免疫测定条件下，确定的抗体结合导管素为背景的至少两倍，并且基本上不以显著量与样品中存在的其他蛋白结合。例如，可以选择针对由SEQ ID NO：1或2组成的蛋白、其剪接变体或一部分所产生的多克隆抗体，以获得那些仅与SEQ ID NO：1或2而不与其他蛋白(SEQ ID NO：1或2的多态性变体和等位体除外)发生特异性免疫反应的多克隆抗体。可以通过去除与诸如非人导管素直系同源物的分子交叉反应的抗体来实现这种选择。多种免疫测定形式可以用于选择与特定蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规用于选择与蛋白发生特异性免疫反应的抗体(参见，例如，Harlow & Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)对可以用于确定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述)。通常，特异性或选择性反应为背景信号或噪声的至少两倍，更通常超过背景10至100倍。
本文描述的“生物活性”导管素多肽具有抗微生物活性。示例性生物活性LL-37和小鼠CRAMP多肽具有8μM或更低的最小抑制浓度(较低的值代表较高的活性)，如Chromek，et al.，Nature Medicine 12(6)：636-641(2006)中列出的测定方法所测量的。
“乳酸菌”指通过它们共同的代谢和生理特征相关联的革兰氏阳性、低-GC、耐酸、通常为非产孢、非呼吸性杆菌或球菌的分枝。通常在腐烂植物和乳产品中存在的这些细菌产生乳酸作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物。示例性乳酸菌属包括：乳酸杆菌属、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、乳酸球菌属、链球菌属(Streptococcus)和双歧杆菌属。
附图简要说明
图1.LL-37对胃癌细胞增殖的体外影响。A，与LL-37孵育24h抑制AGS和TMK1细胞的DNA合成。B，RT-PCR显示AGS和TMK1细胞中LL-37/hCAP18的mRNA表达。C，LL-37/hCAP18表达的敲低(knockdown)或诱导增加或抑制了TMK1细胞增殖。2x104 TMK1细胞用20pmol/L的LL-37/hCAP-18-siRNA或对照siRNA转染，或者用或不用1μmol/L的1a，25-双羟基维生素D3(VD3)处理24h。在转染后或处理后48h测定细胞增殖和LL-37/hCAP18 mRNA表达。D，LL-37处理诱导TMK1中的G0/G1-期细胞的积聚。TMK1细胞用或不用10μg/ml或20μg/mlLL-37处理24h，并且通过流式细胞术分析来测定它们的DNA含量。结果是3次独立实验的代表。*，P＜0.05；**，P＜0.01，与各自的对照组差异显著。
图2.LL-37对胃癌异种移植物的体外影响。A，连续4次隔日注射40μg的LL-37使移植入裸鼠的TMK1癌异种移植物的体积显著减小了49％。B，在实验结束时，切除肿瘤并称重。LL-37-注射组的肿瘤质量显著减小了40％。
图3.LL-37对Smad信号转导的影响。A，LL-37时间-和浓度-依赖性地增加Smad1/5，但抑制Smad2/3磷酸化。总Smad1和Smad2/3的表达不受LL-37处理影响。结果是3次独立实验的代表。B，实时PCR结果显示LL-37(2μg/ml)时间-依赖性地增加TMK1细胞中Smad6和Smad7的mRNA表达。*，P＜0.05；**，P＜0.01，与各自的对照组差异显著。
图4.p21Waf1/Cip1在LL-37对TMK1细胞增殖的抑制作用中的上调和功能参与。A，用LL-37(20μg/ml)处理细胞18h特异性诱导p21Waf1/Cip1而不是p15lnk4a或p27Kipl的mRNA表达。B，LL-37的24小时处理明显增加p21Waf1/Cip1蛋白表达。C，p21Cip1/Waf1-siRNA下调LL-37(20μg/ml)诱导的p21Waf1/Cip1mRNA表达。细胞转染30h，随后用LL-37(20μg/ml)处理24小时。转染后30小时提取信使RNA。D，p21Cip1/Waf1-siRNA消除了LL-37(20μg/ml)的抗有丝分裂作用.**，P＜0.01，与各自的对照组差异显著；
Figure BPA00001499215300091
P＜0.01，与用LL-37处理的对照siRNA-转染组差异显著。
图5.BMP受体参与LL-37对TMK1细胞的抗有丝分裂作用。A，原始凝胶图像显示由RT-PCR测定的BMP受体IA型(BMPRIA)，BMPRIB和BMPRII的mRNA表达。B，转染效率通过用荧光标记的RNA双链体转染TMK1细胞来测定。C，BMPRII-siRNA显著减少BMPRII的mRNA表达。D，siRNA-介导的BMPRII敲低消除了Smad1/5磷酸化和p21Waf1/Cip1表达的增加。将1×105细胞用100pmol BMPRII-siRNA转染24h，随后在提取蛋白前用LL-37(20μg/ml)处理24h。结果是3次独立实验的代表。E，BMPRII敲低部分消除了LL-37(20μg/ml)对TMK1细胞的抗有丝分裂作用。F，实时PCR揭示，用LL-37(20μg/ml)处理TMK1细胞8h显著增加BMP4和BMP7的表达。**，P＜0.01，与各自对照组差异显著；
Figure BPA00001499215300092
P＜0.01，与用LL-37处理的对照siRNA-转染组差异显著。
图6.LL-37对20S蛋白酶体活性的影响。A，利用化学发光法来测定用或没用20μg/ml LL-37处理8h的TMK1细胞中蛋白酶体的胰蛋白酶-样、糜蛋白酶-样和半胱天冬酶-样活性。MG-132(1μmol/L)用作阳性对照。B，用MG-132(1μmol/L)处理4小时显著上调BMP4的mRNA表达。C，用MG-132(1μmol/L)处理4小时显著增加Smad1/5磷酸化。
图7.LL-37/hCAP-18和p21Waf1/Cip1mRNA在人胃癌组织中的表达。A，将每种癌组织样品与对应的周围非恶性组织中的LL-37/hCAP-18和p21Waf1/Cip1mRNA表达进行比较，通过实时PCR来测定。来自10例患者的正常-癌组织对的结果显示，LL-37/hCAP-18和p21Waf1/Cip1在胃癌组织中显著下调。B，在组织对中观察到LL-37/hCAP-18和p21Waf1/Cip1表达间存在统计学上显著的正相关。
图8.该研究的实验流程。野生型和Cnlp-/-小鼠饲喂3％DSS 5天以诱导急性结肠炎。通过补充(A)每天给予合成肽或者(B)单次给予mCRAMP-表达质粒来确定mCRAMP的保护作用。
图9mCRAMP-表达质粒给药诱导的结肠mCRAMP表达。mCRAMP-表达质粒pcDNA3.1/mCRAMP(200μg/每只小鼠)经直肠内给予野生型小鼠。2天后收集结肠组织。对结肠蛋白提取物进行Western印迹以检测mCRAMP的表达。
图10.野生型和Cnlp-/-小鼠的代表性组织学结果。来自用不同DSS和mCRAMP处理的小鼠的结肠组织固定在10％福尔马林中。制备切片(5μm)，并用苏木精-曙红染色(原始放大倍数100x)。5-天DSS处理完全破坏了Cnlp-/-小鼠的粘膜结构，并且减少了隐窝形成。肽或质粒处理保存了粘膜隐窝结构。
图11.mCRAMP补充物对正常和结肠炎小鼠的炎症标志物的影响。(A)第5天，测量正常和结肠炎小鼠的从结盲肠交界处到肛门边缘的结肠长度。(B)MPO活性计算为酶单位并通过蛋白量来标准化。通过ELISA测量从结肠组织制备的蛋白匀浆液中的(C)IL-1β和(D)TNF-α的量。将细胞因子的水平表示为pg特定细胞因子/mg蛋白。值是平均值±标准误(n＝8/组)。与指定的组比较时，*P＜0.05和**P＜0.01。
图12.mCRAMP补充物对结肠炎小鼠结肠组织中的MMP-9活性的影响。(A)来自野生型和Cnlp-/-小鼠的结肠组织匀浆液通过明胶酶谱法分析。每一泳道代表来自有或无mCRAM补充物的个体小鼠的15μg蛋白。MMP-9的明胶分解条带以箭头指出。(B)在多重分析仪中半定量计算结肠MMP-9活性。通过增加的无色条带密度显示较高的活性。当与其他组比较时，**P＜0.01。
图13.mCRAMP补充物对来自正常和结肠炎小鼠的结肠组织凋亡的影响。结果表示为每一视野的凋亡细胞的总数(原始放大倍数200x)。值是平均值±标准误(n＝8/组)。当与指定组比较时，*P＜0.05。
图14.mCRAMP补充物对正常和结肠炎小鼠的排泄物微生物菌落群的影响。(A)需氧微生物菌落。(B)厌氧微生物菌落。实验结束时(即第5天)，在新排除的粪便中检查定量。微生物菌落量计算为在每一干重量(克)排泄物中发现的CFU总数的log10。值是平均值±标准误(n＝8/组)。当与指定组比较时，*P＜0.05。
图15.mCRAMP补充物对正常和结肠炎小鼠的粘液分泌层和粘蛋白表达的影响。(A)测量粘液分泌层的长度和总粘膜厚度。(B)MUC1，(C)MUC2，(D)MUC3和(E)MUC4基因表达通过实时PCR测定，并以β-肌动蛋白的表达进行标准化。值是平均值±标准误(n＝8/组)。当与指定组比较时，*P＜0.05和**P＜0.01。
图16图示了如在实施例中描述的那样处理的小鼠的MPO活性。a：p＜0.05，与DSS Ctrl相比。b：p＜0.01，与DSS Ctrl相比。c：p＜0.01，与水Ctrl组相比。d：p＜0.01，与N4相比。缩写词如下：水Ctrl：水对照(n＝8)；DSS Ctrl：葡聚糖硫酸钠(n＝8)；N：DSS+乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ3900(n＝7)；N4：DSS+转化了导管素的NZ3900(n＝7)；N4I：DSS+转化了导管素加上乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的NZ3900(n＝8)。
图17图示了如实施例中描述的那样处理的小鼠的MPO活性，如下所示：C：只有水(n＝8)；N：水+乳酸乳球菌NZ3900(n＝4)；N4：水+转化了导管素基因的NZ3900(n＝4)；以及N4I：水+转化了导管素基因加上乳酸链球菌肽诱导(0.25ng/mL)的NZ3900(n＝4)。
图18显示了LL-37及其片段在所示的浓度对TMK1细胞增殖的影响。
图19显示了小鼠经历图16所示的不同处理后隐窝的损失。与DSSctrl相比，*p＜0.05。
图20.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，小鼠的疾病活动指数(基于体重减少、粪便硬度和出血)。*p＜0.05，***p＜0.001，与DSS相比；^p＜0.01与DSS+N0I相比；+++p＜0.001，与DSS+CMC-Na相比。(N＝9-10只小鼠)。
图21.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010 cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，粘液分泌层与粘膜厚度之比。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与DSS相比；p＜0.05，与DSS+N0相比；^p＜0.001，与DSS+N0I相比。(N＝8-10只小鼠)。
图22.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)(每天一次，经口给予)处理7天后的隐窝评分(基于粘膜隐窝损伤)。*p＜0.05，***p＜0.001，与DSS相比；p＜0.001，与DSS+N0I相比；+p＜0.05，与DSS+CMC-Na相比。(N＝8-9只小鼠)。
图23.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，每一视野的凋亡细胞的数目。***p＜0.001，与DSS相比；p＜0.001，与DSS+N0I相比；^p＜0.001，与DSS+8 log cfu N4I相比。(N＝8-12只小鼠)。
图24.用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)7天后，结肠粘膜的基础髓过氧物酶(MPO)的活性。(N＝4-5只小鼠)。
图25.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，髓过氧物酶(MPO)的活性。***p＜0.001，与DSS相比，^p＜0.01，与DSS+N0I相比。(N＝8-12只小鼠)。
图26.用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)7天后，基础丙二醛(MDA)的水平。(N＝4-5只小鼠)。
图27.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，丙二醛(MDA)的水平，**p＜0.01，与DSS相比；++p＜0.01，与DSS+CMC-Na相比。(N＝9-13只小鼠)。
图28.用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)7天后，每一干重排泄物中需氧菌的基础数目。(N＝4-5只小鼠)。
图29.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，每一干重排泄物中需氧菌的数目。*p＜0.05，**p＜0.01，与DSS相比。(N＝9-12只小鼠)。
图30.用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)7天后，每一干重排泄物中厌氧菌的基础数目。(N＝4-5只小鼠)。
图31.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，每一干重排泄物中厌氧菌的数目。*p＜0.05，**p＜0.01，与DSS相比。(N＝9-12只小鼠)。
图32.用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)7天后，基础的结肠长度与体重之比。(N＝4-5只小鼠)。
图33.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)，以及用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理，或者用悬浮在羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的600mg/kg柳氮磺胺吡啶(SASP)处理(每天一次，经口给予)7天后，结肠长度与体重之比。***p＜0.001，与DSS相比；^p＜0.01，与DSS+N4相比；+++p＜0.001，与DSS+CMC-Na相比。(n＝9-12只小鼠)。
图34.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)7天，随后用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)4天后，结肠长度与体重之比。*p＜0.05，***p＜0.001，与DSS相比。(N＝9只小鼠)。
图35.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)7天，随后用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)4天后，髓过氧化物酶(MPO)的活性。***p＜0.001，与DSS相比。(N＝9-11只小鼠)。
图36.葡聚糖硫酸钠(DSS)给药(3％，w/v在饮用水中)7天，随后用没添加(N0)或添加了(N0I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)的1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理、或者用没有(N4)或有(N4I)乳酸链球菌肽(0.25ng/mL)诱导的转化了mCRAMP的1×108cfu或1×1010cfu乳酸乳球菌NZ3900处理(每天一次，经口给予)4天后，丙二醛(MDA)的水平。(N＝8-9只小鼠)。
图37.利用裸鼠的原位胃癌模型，对编码有LL-37的乳酸乳球菌的抗癌活性的研究。隔天一次口服编码LL-37的乳酸乳球菌(1×1010CFU/mL)持续2周，分别使肿瘤重量显著降低70％(P＝0.0176，相对于对照组)，使肿瘤重量/体重显著降低71％(P＝0.0092，相对于对照组)。对照组的动物接受蒸馏水。在处死动物当天测量肿瘤的重量和体重。数据表示为平均值±标准误(n＝4-5只小鼠)。
详细描述
I.前言
本发明部分基于以下发现：表达导管素的益生乳酸菌的给药有效减轻小鼠疾病模型中诱导的结肠炎。本发明人惊喜地发现，益生菌能够有效地递送足量的具有抗细菌活性的导管素以减轻结肠炎。导管素还减缓了胃肿瘤生长。预期使用表达导管素的益生菌在包括本文特别描述的那些在内的其它胃肠病中是有效的。
II.表达导管素的细菌
本发明提供了能够定殖在哺乳动物肠道的乳酸或其他益生菌，这些益生菌被重组修饰以表达生物活性的导管素多肽。多种乳酸菌是本领域已知的，并且可以用于本发明中。示例性乳酸菌包括但不限于乳酸球菌属(Lactococcus sp.)(包括但不限于乳酸乳球菌(L.lactis)、格氏乳球菌(L.garivae)、棉籽糖乳球菌(L.raffinolactis)、植物乳球菌(L.plantarum))、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)(包括但不限于干酪乳杆菌(L.casei)、植物乳杆菌(L.palntarum)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophillus))、或双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)(包括但不限于，长双歧杆菌(B.longum)、细长双歧杆菌(B.subtitle)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、乳双歧杆菌(B.lactis))。在一些实施方案中，使用的细菌是公认的食物或益生添加剂。
本发明的细菌包含编码生物活性导管素多肽(如本文描述的)的表达盒。导管素多肽的表达可以受控于与导管素多肽编码序列可操作连接的启动子。因此，本发明的表达盒可以包含调节本发明多肽的表达和定位的多种组件。例如，表达盒可以包含启动子元件、序列编码信号序列和感兴趣多肽的编码序列。
多种启动子可以用于调控导管素表达，包括组成型和诱导型启动子。示例性组成型启动子包括但不限于P59(Van der Vossen et al.，Appl.Environ.Microbiol.58：3142-3149(1992))、P23(Elliot et al.，Cell 36：211-219(1984))、P32或P44(Drouault et al.，Appl.Environ.Microbiol.66(2)：588-598(2000))启动子。
可选择地，表达可以受诱导型启动子的调控。诱导型启动子具有调控过表达至理想点和时间的优势。这在导管素表达中特别有用，因为该肽具有抗微生物活性。在本发明中，理想的情况是使导管素的表达受诱导型启动子的调控，所述启动子在与可溶性诱导子接触时被激活。理想地，诱导子至少是相对无毒的，并且对于向哺乳动物胃肠道的递送是足够稳定的。这允许仅在诱导子递送时激活导管素的表达。诱导子的递送可以与细菌的递送同时发生，或者可以发生细菌递送之后，或者在一些实施方案中发生在细菌递送之前。
示例性诱导型启动子包括但不限于芽胞杆菌淀粉酶(Weickert et al.，J.Bacteriol.171：3656-3666(1989))或木糖(Kim et al.Gene 181：71-76(1996))启动子以及乳球菌乳酸链球菌肽启动子(Eichenbaum et al，Appl.Environ.Microbiol.64：2763-2769(1998))。在乳酸链球菌肽启动子的情况下，诱导子是乳酸链球菌肽，一种具有34个氨基酸残基的多环肽抗菌剂，常用作食物防腐剂。乳酸链球菌肽含有稀有氨基酸羊毛硫氨酸(lanthionine(Lan))、甲基羊毛硫氨酸(methyllanthionine(MeLan))、双脱氢丙氨酸(didehydroalanine(Dha))和双脱氢氨基丁酸(didehydroaminobutyricacid(Dhb))。乳酸链球菌肽的合成描述于例如，K.Fukase et al.，Tetrahedron Lett.29(7)：795(1988)和G.W.Buchman et al.，J.Biol.Chem.263(31)：16260(1988)中。
另一种诱导型启动子是P170启动子，其是来自乳酸乳球菌的启动子。它受葡萄糖生长培养物从指数后向稳定期过渡期间的pH下降(pH＜6)的诱导。它通过生长期间培养基中乳酸的累积自我诱导(E Morello et al.，JMol Microbiol Biotechnol.14(1-3)：48-58(2008))。
此外，还可以使用酸诱导的启动子。例如，可以使用在肠道相对酸性的环境下有活性的启动子。示例性的酸诱导的启动子有酸诱导的RcfB启动子(Madson et al.，Mol Microbiol 56(3)735-746(2005)。
已知有多种信号序列指导导管素多肽的分泌。示例性信号序列包括，例如usp45(Van Asseldonk，Mol.Gen Genet.240(3)：428-434(1993))、SP310(Ravn et al.，Microbiology 149：2193-2201(2003))和Exp4(Morello et al.，J.Mol.Microbiol.Biotechhnol.14(1-3)：48-58(2008)。信号序列通常位于多肽的氨基末端。
在一些实施方案中，除导管素多肽的生物活性氨基酸序列外，还包含其他“前蛋白”氨基酸。一般地，选择这种序列以使序列在递送至理想部位时被切割产生活性蛋白。例如，如下文讨论的，天然的导管素最初以前蛋白产生，然后被切割为活性蛋白。因此，在一些实施方案中，hCAP-18前蛋白被表达盒编码，以及LL-37或hCAP-18的另一活性片段通过hCAP-18的切割产生。
当设计某一基因用于在宿主细胞中提高表达时，理想的是，设计该基因使得它的密码子使用频率接近宿主细胞中优选密码子使用的频率。合成基因的偏爱密码子使用频率与宿主细胞利用的密码子的使用频率的偏差百分比通过以下来计算：首先确定单个密码子的使用频率与宿主细胞中的频率的偏差百分比，然后获得所有密码子的平均偏差。
可以改变编码特定多肽的多核苷酸序列，从而与特定宿主的密码子使用相一致。“密码子改良的”编码序列包含至少一个与天然密码子相比已经符合宿主细胞密码子频率的密码子，所述天然密码子即是衍生编码序列的物种DNA基因组中使用的密码子。理想地，将多个密码子改变为宿主细胞偏爱的密码子以便提高在宿主细胞中的表达。例如，乳酸杆菌属的密码子使用可以用于衍生编码本发明多肽并包含乳酸杆菌属偏爱密码子的多核苷酸。宿主细胞展示的偏爱密码子使用频率可以通过求出宿主细胞表达的大量基因的偏爱密码子使用频率的平均数来计算。在一些情形下，这种分析受限于宿主细胞高表达的基因。例如，Pouwels et al.(Nucleic Acids Res.22：929-936(1994))提供了多种乳酸杆菌种类展示的高表达基因的密码子使用频率。乳酸球菌属密码子使用描述于例如Gupta，etal.，J.Biomolecular Structure and Dynamics 21(4)：1-9(2004)中。密码子使用表还可以通过因特网获得。
根据需要可以使用能够调控表达的任一表达载体。示例性表达载体包括例如在van de Guchte，et al.，Appl Environ Microbiol.55(1)：224-228(1989)；Jeong et al.，Food Microbiology 23(5)：468-475(2006)；Sorving，etal.，FEMS Microbiology Letters，229(1)：119-126(2006)；美国专利号5,529,908；以及美国专利公开号2008/0286833中描述的那些。商用载体包括，例如
Figure BPA00001499215300181
表达系统(BOCA Scientific，Boca Raton，FL)，其使用乳酸链球菌肽启动子。
可以使用本领域已知的任一种细菌转化方法。在一些实施方案中，利用诸如氯化铷方法或电穿孔(参见，例如，Wei，et al.，J.Microbiol.Meth.21：97-109(1995))的标准技术使细菌宿主处于转化感受态。
本发明依赖于重组遗传学领域的常规技术。公开了本发明使用的通用方法的基础教科书包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(分子克隆：实验手册)(3rd ed.2001)；Kriegler，GeneTransfer and Expression：A Laboratory Manual(基因转移和表达：实验手册)(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学技术)(Ausubel et al.，eds.，2002))。
III.导管素
本发明提供了生物活性导管素多肽在本文描述的乳酸菌或其他益生菌中的表达。生物活性导管素多肽包括生物活性LL-37或其活性片段(参见，例如美国专利公开号2009/0088382)或者来自其他物种的其直系同源物(例如，m-CRAMP等)。LL-37具有如下氨基酸序列：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(SEQ ID NO：1)。本发明提供了LL-37的活性片段如LL-37的至少20、25、30或35个氨基酸的片段，所述活性片段任选地还包含融合到N-或C-末端的一个或多个其他氨基酸。例如，本发明人发现肽HN2-IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH和HN2-FKRIVQRIKDFLRNLV-COOH具有与LL-37相似的活性。参见，例如图18。因此，本发明提供了包含FKRIVQRIKDFLRNLV(SEQ ID NO：2)的生物活性导管素多肽。本发明还提供了SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的生物活性变体，例如包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2变体的多肽，其中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的1、2、3、4、5、6、7或更多个氨基酸被不同的氨基酸替代，例如保守性氨基酸取代。
IV.给药和剂量
本发明的细菌用于治疗或减轻多种胃肠道病症和疾病。在一些实施方案中，将细菌给予患有例如结肠炎、炎性肠病或克罗恩氏病的哺乳动物(例如人)，从而减轻所述疾病或其症状。在一些实施方案中，将细菌给予患有例如结直肠癌或胃癌(包括但不限于与螺旋杆菌感染相关的胃癌)的哺乳动物(例如人)，从而减轻所述癌症或其症状。在一些实施方案中，将细菌给予患有例如胃炎、胃溃疡或胃食管反流病(GERD)的哺乳动物(例如人)，从而减轻所述疾病或其症状。在这些实施方案的任一个中，启动子调控的导管素表达可以是可诱导的，如上文所述。在这些实施方案中，诱导子(例如，在乳酸链球菌肽-诱导型启动子的情况下，是乳酸链球菌肽)可以与细菌同时或分开给药。任选地，可以在给药前诱导细菌。例如，在细菌给药前，可以将细菌与诱导子(例如，乳酸链球菌肽)接触(使用例如约10ng/ml的乳酸链球菌肽)，孵育一段时间以允许诱导或表达，然后再给药。任选地，在细菌给药前，可以从细菌洗去过多的诱导子。
可以取决于使用目的(例如，待治疗或减轻的疾病)选择和确定细菌量。示例性剂量包括例如约106-1014CFU，例如108-1012CFU、1010-1012CFU、108-1011CFU等的日剂量。这种日剂量可以一天一次给药或者可以在一天内分为两次或更多次剂量。任选地，可以根据需要(例如，用于健康的一般维持等)使用较小或较大剂量。
在一些实施方案中，通过细菌在限定性体外培养条件下产生的导管素的量来确定剂量。体外导管素产量可以用于计算待给药的细菌的必需量以递送有效剂量。如在实施例中所解释的，本发明人已经发现在体外限定条件下表达低至1pg/天的导管素量的细菌在小鼠体内治疗结肠炎中是有效的。对于人给药而言，这种量相当于至少10pg/天。因此，在一些实施方案中，将足够量的细菌给予人，其中该量的细菌在体外限定条件下每天产生1-5000pg，例如10-2000pg的导管素。本发明人已经发现这种水平并非高到足以影响生产细菌的活力，由此避免了产生导管素的细菌的潜在毒性。本文所用的描述确定导管素多肽量的测定条件的“限定性体外培养条件”指将讨论中的细菌的过夜培养物以1/25稀释度接种在新鲜培养基中，随后是在30℃下孵育30分钟，然后是启动子的诱导(如果使用了诱导型启动子的话)，以及进一步用诱导子孵育约3小时直至OD600达到～0.4。然后通过例如ELISA来测定导管素的量。
根据必要或需要的时间长度给予剂量。在一些实施方案中，细菌每日给药不超过30、20或10天。在一些实施方案中，剂量给药至少4、5、6或更多天，例如4-7、4-10、4-20、4-30天或更长等。
本发明的细菌(编码导管素蛋白)可以根据需要或如本领域已知的那样给药。本发明的细菌是给药至胃肠道。在一些实施方案中，给药途径是经口或直肠。在一些实施方案中，本发明的细菌在凝胶、悬浮液、喷雾剂、胶囊、片剂、粉末或半固定制剂(例如，栓剂)中给药。任选地，哺乳动物(包括但不限于，成年人或人类的婴儿或幼童)消耗的任一种食物或饮料都可以用于制备包含本发明细菌的制剂。示例性食物包括具有半液体稠度的那些以使本发明的细菌容易分散和分散均匀。然而，其他稠度(例如，粉末、液体等)也可以无限制使用。因此，这种食品包括但不限于乳制品诸如奶酪、松软干酪、酸乳和冰淇淋。加工过的水果和蔬菜，包括但不限于目标群为婴儿/幼童的那些如苹果泥或过滤的豌豆和胡萝卜，也适用于与本发明的细菌组合。除了用于人类消费的食物外，动物饲料中也可以补充本发明的细菌。
可选地，本发明的细菌可以用于补充到饮料中。这类饮料的实例包括但不限于乳、发酵乳、果汁、水果饮料、运动饮料、婴儿配方奶(infantformula)、较大婴儿配方奶(follow-on formula)和幼童饮料。本发明组合物的其他有益制剂包括动物乳如牛乳的补充剂。
可选地，本发明的细菌可以配制为丸剂或片剂或封装在胶囊中，诸如明胶胶囊。片剂形式可以任选地包含，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、增味剂、染料、崩解剂和药学上相容载体中的一种或多种。锭剂或糖果形式可以在调味剂如蔗糖中包含组合物，以及糖果锭剂在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖以及阿拉伯树胶乳剂、凝胶等中包含组合物，除活性成分外，还含有本领域已知的载体。细菌制剂还可以包含常规食物补充填充剂和增补剂诸如例如米粉。
在一些实施方案中，本发明的细菌在稳定剂存在下被干燥以保存活力，如被冷冻干燥。冷冻干燥制剂可以被消费者添加到食物或饮料。
在一些实施方案中，细菌组合物还包含牛(或其他非人类)乳蛋白、大豆蛋白、水稻蛋白、β乳球蛋白、乳清、豆油或淀粉。
实施例
提供下面的实施例来示例而不是限制要求保护的发明。
实施例1：导管素的递送减轻了胃癌
材料&方法
试剂和药物-合成的LL-37肽购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。Smad1抗体和phospho-Smad1/5抗体购自细胞信号转导技术公司(CellSignaling Technology)(Beverley，MA，USA)。其他一抗购自Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz，CA，USA)。1α，25-双羟基维生素D3购自WakoChemicals(Osaka，Japan)。除非另有所指，所有其他的化学制品和试剂购自Sigma(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。
临床样品-获得了10例胃腺癌患者的外科手术样本，所述患者已被香港玛丽皇后医院的外科部确认进行胃切除术。在化疗或任何其他形式治疗之前收集样品。有6名男性和4名女性，年龄中位数为67。5例患者被诊断为肠型腺癌，3例被诊断为弥散型，以及2例被诊断为混合型。该研究已经得到香港玛丽皇后医院伦理委员会的批准。
细胞培养和活力测定-人类胃腺癌细胞系AGS购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA，USA)。胃腺癌细胞TMK1获自Dr.Eiichi Tahara(日本广岛市广岛大学(University ofHiroshima，Hiroshima，Japan))。AGS和TMK1细胞维持在含10％胎牛血清(Invitrogen)、100U/mL青霉素G、100μg/mL链霉素的RPMI 1640(Invitrogen)中，以及维持在37℃，95％湿度和5％二氧化碳的条件下。通过乳酸脱氢酶释放测定法来测定细胞活力(Roche，Indianapolis，IN，USA)。
细胞增殖测定和细胞周期分析-利用以前描述的改良的[3H]胸苷掺入测定法(Yang，Y.H.，et al.(2006)J.Pharmacol.Exp.Ther，318，547-554)，将细胞增殖测量为DNA合成的量。简言之，细胞用不同剂量的LL-37处理24h，然后与0.5μCi/mL[3H]-胸苷(Amersham Corporation，ArlingtonHeights，IL USA)再孵育4h。[3H]-胸苷掺入细胞的最终量用液体闪烁计数器(LS-6500，贝克曼仪器公司(Beckman Instruments，Inc.)，Pullerton，CA)来测量。对于细胞周期分析，将细胞用磷酸缓冲盐(PBS)中冰冷的70％乙醇固定，随后用50μg/ml碘化丙啶、3.8mmol/L柠檬酸钠和0.5μg/ml RNaseA在4℃孵育3h，然后通过流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter)，Fullerton，CA，USA)进行分析。从利用WinMDI 2.8软件产生的DNA直方图计算细胞周期相位分布。
裸鼠异种移植物模型-为了评价LL-37对体内癌生长的直接抑制作用，采用了TMK1胃癌异种移植物模型。简言之，TMK1细胞用胰酶消化后收集，重悬在PBS(2×107细胞/ml)中。基于台盼蓝染色确认细胞活力在95％以上。然后将0.2ml PBS中的3×106 TMKl细胞皮下注射入4-6周龄雌性BALB/c nu/nu小鼠的右侧腹或背侧区域。接种后，小鼠维持在无菌条件下，隔天一次用测径器测量所形成的肿瘤大小。根据下式估计肿瘤体积(V)：V＝L×W2/2，其中L是中轴长度，以及W是中轴宽度。在肿瘤达到100-200mm3的平均大小后(第10天)，将溶于PBS的40μgLL-37给予裸鼠，隔天一次。对照组的动物接受等体积的PBS。通过皮下注射入邻近小鼠肿瘤的2个部位，给予所有处理。在实验结束时，处死小鼠，并将肿瘤切除和称重。
常规和定量逆转录聚合酶链反应-如以前所述(Yang，Y.H.，et al.(2006)J.Pharmacol.Exp.Ther，318，547-554)，分离总RNA并且合成cDNA。然后利用以下引物对进行PCR：BMPRIA，正义引物5′-ATGCGTGAGGTTGTGTGTGT-3′以及反义引物5′-ACCCAGAGCTTGACTGGAGA-3′(产物大小503bp)；BMPRIB，正义引物5′-AGGTCGCTATGGGGAAGTTT-3′以及反义引物5′-TAGCAACCTCCCAAAGGATG-3′(产物大小599bp)；BMPRII，正义引物5′-CCATGAGGCTGACTGGAAAT-3′以及反义引物5′-AGGACCAATTTTTGGCACAC-3′(严物大小563bp)；LL-37/hCAP18，正义引物5’-GCTTTTGCATCAGGCTCAG-3’以及反义引物5’-GGGTAGGGCACACACTAGGA-3’(产物大小598bp)。用于PCR的条件为：94℃5分钟，35个循环的94℃30秒，55℃30秒以及72℃1分钟。最后的延伸步骤是在72℃进行7分钟。然后将PCR产物在含0.5μg/mL溴化乙锭的1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。对于半定量，用购自Qiagen(Valencia，CA，USA)或SuperArray Bioscience(Frederick，MD，USA)的特异性预设计引物组进行实时PCR，b-肌动蛋白作为内对照。定量PCR的条件是：94℃5分钟，40个循环的94℃30秒，55℃30秒和72℃30秒。利用iQ SYBR绿色超混合物(iQ SYBR Green Supermix)(Bio-Rad，Hercules，USA)和多色实时PCR检测系统(Multicolor Real-Time PCRDetection System)(Bio-Rad)实施定量PCR。利用比较循环阈值(CT)法(Livak，K.J.and Schmittgen，T.D.(2001)Methods，25，402-408)来分析结果。
RNA干扰-利用购自Qiagen的经验证的靶标特异性siRNA分子降低hCAP18/LL-37、BMPRII以及p21Waf1/Cip1的表达。利用LipofectamineTM2000试剂(Invitrogen)，按照生产商的说明书，将200皮摩尔的基因特异性siRNA或对照siRNA转染入40-60％汇合的TMK1细胞。通过TMK1细胞中转染的荧光标记的RNA双链体(Invitorgen)来确定siRNA的转染效率。
免疫沉淀和Western印迹分析-如以前所述，在含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀缓冲液中收获TMK1细胞(Yang，Y.H.，et al.J.Pharmacol.Exp.Ther，318，547-554(2006))。将等量的蛋白(40μg/泳道)通过SDS-PAGE分离，并转移到Hybond C硝酸纤维素膜(AmershamCorporation)。膜用一抗在4℃过夜探测，然后用过氧化物酶偶联的二抗孵育1h。用增强的化学发光系统(Amersham公司)显色并暴露于X-射线胶片(FUJI Photo Film Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)。
蛋白酶体活性测定-蛋白酶体胰蛋白酶样活性、糜蛋白酶样活性、半胱天冬酶样活性通过蛋白酶体-GloTM测定系统(Promega，Madison，WI)来测定。简言之，将细胞收获在含10mM DTT，1mM PMSF和0.1mM EDTA的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中。按照生产商的说明书，在冰上超声30秒并在4℃以12,000g离心15分钟后，收集上清液用于蛋白酶体活性测定。通过ChemiDoc XRS成像系统(Bio-Rad)检测化学发光信号。
统计学分析-结果表示为平均值±标准误。用方差分析(ANOVA)及随后的Turkey’s t-检验或Pearson相关性分析进行统计学分析。P值小于0.05被视为是统计学上显著的。
结果
LL-37在体外抑制胃癌细胞增殖以及诱导G0/G1-期细胞周期阻滞。为了研究LL-37对胃癌细胞增殖的影响，我们检测了响应LL-37处理时，在培养的胃癌细胞系AGS和TMK1中[3H]胸苷掺入的变化。如图1A显示的，用LL-37孵育24h以浓度依赖的方式显著减少了[3H]胸苷在两种细胞系中的掺入。在20μg/ml剂量时，LL-37将TMK1细胞增殖抑制了约60％。AGS细胞显示了对LL-37处理相似的响应。然而，AGS的响应弱于TMK1细胞，在20μg/ml的剂量仅显示10％的抑制。所有处理组的细胞活力经确认未受到影响，如通过乳酸脱氢酶释放测定所测定的。来自RT-PCR的结果还揭示，LL-37/hCAP18 mRNA表达在AGS和TMK1(Fig.1B)中。为了进一步确认LL-37的抗有丝分裂作用，LL-37在TMK1细胞中的内源性表达被siRNA抑制，或者被LL-37的已知诱导剂1α，25-双羟基维生素D3(Liu，P.T.，et al.(2006)Science，311，1770-1773)诱导。结果表明，内源性LL-37的敲低或诱导分别增加或抑制了细胞增殖(Fig.1C)。这些数据支持调整LL-37在生理水平的表达调节细胞增殖。通过流式细胞仪的进一步分析证实了LL-37诱导TMK1细胞在G0/G1期的积聚(对照组的66％相对于20μg/ml LL-37-处理组的77％)。在LL-37-处理的细胞中还观测到处于S和G2/M期的细胞比例的相应减少(Fig.1D)。具体地，在20μg/ml LL-37-处理组中，处于S和G2/M期的细胞总数降低了33％。
LL-37在体内抑制了胃癌异种移植物的生长。利用裸鼠的胃癌异种移植物模型评价LL-37在体内直接的抗癌活性。接种TMK1细胞10天后，肿瘤达到150mm3的平均大小。然后将动物随机分组并如在材料和方法中提及的那样进行处理。将LL-37隔天皮下注射至邻近肿瘤处，总共4次注射后，与对照相比使肿瘤体积显著降低了49％(Fig.2A)。在切除时，肿瘤质量在LL-37-注射组减小了40％(Fig.2B)。
LL-37增加了Smad1/5磷酸化和Smad6/7表达，同时伴随着Smad2/3磷酸化的抑制。已经表明，TGF-β/BMP信号转导调节胃癌细胞增殖(Wen，X.Z.，et al.(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun，316，100-106；Liu，P.T.，et al.(2006)Science，311，1770-1773)。为了探究LL-37和TGF-β/BMP信号转导间的关系，测定了TGF-β-响应的Smad2/3和BMP-响应的Smad1/5的磷酸化水平。结果表明，LL-37以时间和剂量依赖的方式显著增加了Smad1/5磷酸化但减少了Smad2/3磷酸化。总Smad1和Smad2/3的蛋白表达水平没有受到影响(Fig.3A)。用LL-37处理后，早至12小时观测到Smad1/5磷酸化的诱导。而且，已知可被BMP信号转导诱导的Smad6和Smad7的mRNA表达(Nakao，A.，et al.(1997)Nature，389，631-635；Wang，Q.，et al.(2007)J.Biol.Chem，282，10742-10748)通过LL-37处理显著增加(Fig.3B)。
LL-37诱导细胞周期素-依赖的激酶抑制剂p21Waf1/Cip1而不是p15Ink4a或p27Kip1的表达。已表明，BMP信号转导的激活通过诱导特异性CDK抑制剂如p21Waf1/Cip1和p27Kip1抑制细胞周期进程(Wen，X.Z.，et al.(2004)Biochem.Biophys.Res.Commun，316，100-106；Franzen，A.and Heldin，N.E.(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun，285，773-781)。在本研究中，结果表明，BMP信号转导的激活增加了p21Waf1/Cip1的mRNA(Fig.4A)和蛋白(Fig.4B)表达。然而，p15Ink4a或p27Kip1的mRNA表达没有受到明显影响(Fig.4A)。为了进一步证实在胃癌中，p21Waf1/Cip1在LL-37的抗有丝分裂作用中的角色，LL-37诱导的p21Waf1/Cip1mRNA表达通过siRNA敲低。如在Fig.4C中所示，RNA干扰将p21Waf1/Cip1mRNA在LL-37-处理的细胞中的表达几乎降低回对照水平，并且部分取消了LL-37的抗有丝分裂作用(Fig.4D)。
BMPRII的敲低减弱了LL-37诱导的抗有丝分裂信号转导。尽管到目前为止呈现的结果表明LL-37激活BMP信号转导，但该现象是否是由受体介导的尚未确认。因此我们测定了BMPR在TMK1细胞中的表达，BMPR正常以异二聚体存在(Koenig，B.B.，et al.(1994)Mol.Cell.Biol，14，5961-5974)。RT-PCR显示TMK1细胞表达BMPRIA，IB和II(Fig.5A)。因此我们应用siRNA敲低BMPRII，BMPRII与BMPRIA或IB相互作用形成功能受体。TMK1细胞的siRNA转染效率大于95％(Fig.5B)。BMPRII-siRNA显著降低了BMPRII的表达(Fig.5C)以及抑制LL-37引发的抗有丝分裂信号转导。在这方面，siRNA-介导的BMPRII的下调消除了LL-37诱导的Smad1/5磷酸化和p21Waf1/Cip1表达(Fig.5D)。细胞周期素依赖的激酶(CDK)抑制剂p21Waf1/Cip1是CDK2/细胞周期素E复合物的已知抑制剂。除通过BMP信号转导的激活诱导p21Waf1/Cip1外，我们的结果表明，LL-37通过BMPR-非依赖机制下调细胞周期素E2(Fig.5D)。为了进一步确认BMP/p21Waf1/Cip1通路参与了LL-37的抗有丝分裂作用，在不存在或存在LL-37的情况下，测定了在用对照siRNA或BMRRII siRNA转染的细胞中的细胞增殖。结果显示，LL-37诱导的细胞增殖的抑制部分被BMPRII敲低逆转(Fig.5E)。
LL-37诱导BMP4表达。BMP信号转导的活性依赖于内源性BMP配体表达的复杂调节。在这方面，我们证实了TMK1表达从BMP1至BMP7的所有BMP配体，除BMP3外。定量PCR还揭示，用LL-37处理8h后，BMP4以及BMP7(较低程度)显著上调(Fig.5F)。然而，其他BMPs的表达没有显著变化。
LL-37抑制蛋白酶体的糜蛋白酶-样活性和半胱天冬酶-样活性。之前，我们证实了BMP4的转录和BMP信号转导活性在胃癌细胞中受泛素-蛋白酶体途径的调节(Wu，W.K.，et al.(2008)Biochem.Biophys.Res.Commun，371，209-214)。本文我们证实了处理TMK1细胞8h显著降低20S蛋白酶体的糜蛋白酶-样活性和半胱天冬酶-样活性，而不是胰蛋白酶-样活性(Fig.6A)。而且，用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞剂量依赖性地增加BMP4 mRNA表达(Fig.6B)和Smad1/5磷酸化(Fig.6C)。
LL-37/hCAP18和p21waf1/cip1mRNA在人胃癌组织中都下调。为了确定来自我们目前为止所做的细胞系实验的结果是否具有临床相关性，我们通过定量RT-PCR比较了LL-37/hCAP18和p21Waf1/Cip1mRNA在正常胃组织和获自人胃患者的癌性胃组织中的表达。结果显示，LL-37/hCAP18和p21Waf1/Cip1mRNA水平在胃癌组织中都显著下调，其中它们的表达水平与周围非恶性组织相比将近下调60％(Fig.7A)。而且，在LL-37/hCAP18和p21Waf1/Cip1表达之间存在中度但统计学上显著的相关性(Fig.7B)，这表明人胃癌中p21Waf1/Cip1表达可能部分受LL-37/hCAP18的支配。
讨论
在哺乳动物中，许多宿主防御肽诸如β-防御素和导管素通过提供第一线抗感染的防御发挥重要的天然免疫功能。这些肽在循环免疫细胞中以及在皮肤和胃肠道的上皮细胞表面表达，并且在感染时上调(Hase，K.，et al.(2003)Gastroenterology，125，1613-1625)。后来的研究揭示，这些肽发挥其他关键作用诸如调节炎症和促进组织修复(Mookherjee，N.，et al.(2006)J.Immunol，176，2455-2464；Yang，Y.H.，et al.(2006)J.Pharmacol.Exp.Ther，318，547-554；Tai，E.K.，et al.(2007)Exp.Biol.Med，232，799-808)。一项最近的报道显示，人类中唯一的导管素即LL-37在胃癌组织中看起来是下调的(Hase，K.，et al.(2003)Gastroenterology，125，1613-1625)。
在本研究中，我们证实了合成的LL-37肽在体外通过延迟细胞周期进程中的G1-S期过渡显著降低胃癌细胞增殖，并在体内抑制胃癌异种移植物的生长。通过siRNA或1α，25-双羟基维生素D3分别敲低或诱导内源性LL-37表达增加或抑制了胃癌细胞增殖。这些发现表明，LL-37在胃癌中是细胞生长的负性调节子。迄今为止，仅有一篇报道表明LL-37在癌细胞中具有抗有丝分裂作用。在那项研究中，LL-37抑制了两种人口腔表皮样癌细胞系的生长(Li，X.，et al.(2006)J.Am.Chem.Soc，128，5776-5785)。该发现与我们的以下结论是一致的：LL-37在人类癌症中可能起肿瘤抑制剂的作用。然而，在文献中也存在反证，其中LL-37促进培养的乳腺癌细胞的增殖，并且在高等级的乳腺癌组织中高度表达(Heilborn，J.D.，et al.Int.J.Cancer，114，713-719)。在并非意图限制本发明的范围的条件下，我们推测LL-37在癌症中的抗有丝分裂作用可能是高度组织特异性的。
已经表明，BMP信号转导的激活抑制胃癌细胞增殖。例如，BMP2通过诱导CDK抑制剂p21Waf1/Cip抑制胃癌生长并诱导G0/G1细胞周期阻滞。更后的研究进一步阐明BMP2在胃癌中通过表观遗传沉默(epigeneticsilencing)被下调。而且，最近的研究证实了通过条件性灭活小鼠的BMPRIA消除BMP信号转导促进胃癌形成(Bleuming，S.A.，et al.(2007)Cancer Res，67，8149-8155)。所有这些发现提示，BMP信号转导可能在胃癌形成中发挥抑制作用。在这方面，我们的结果表明，BMP信号转导被LL-37激活，其中能够观测到BMP响应的Smad1/5磷酸化的时间-和剂量依赖性增加。而且，LL-37诱导了BMP-响应的转录靶标的表达。为此，p21Waf1/Cip1和Smad6 mRNA表达大幅增加。功能性BMPR常见亚单位BMPRII的敲低消除了LL-37诱导的Smad1/5磷酸化和p21Waf1/Cip1表达，这表明LL-37激活的BMP信号转导是受体介导的，以及p21Waf1/Cip1表达受到胃癌细胞中BMP信号转导通路的调控。人胃癌组织中LL-37/hCAP-18和p21Waf1/Cip1的mRNA表达之间的正相关进一步支持p21Waf1/Cip1的表达至少部分受LL-37的支配。重要的是，siRNA介导的BMPRII的敲低对BMP信号转导的减弱部分消除了LL-37对胃癌细胞的抗有丝分裂作用，这进一步证实了BMP信号转导作为负性生长调节通路的作用(Wu，W.K.，et al.(2010)J.Cell.Physiol.223，178-186)。
在本研究中，TGF-β和BMP信号转导的活性受到LL-37不同的调节，其中TGF-β-响应的Smad2/3的磷酸化水平降低，而BMP-响应的Smad1/5是增加的。BMP4诱导在Smad1/5的磷酸化之前，这表明该配体可能负责BMP信号转导的激活。与这一发现一致，据报道BMP4抑制肺腺癌细胞的转化表型。当用BMP4处理时，这些细胞生长减慢，侵袭性减弱，并且对凋亡更为敏感。而且，BMP4和其他BMPR配体抑制人恶性胶质瘤干细胞的致瘤潜力。Garrett等和我们组已经报道，BMP信号转导在成骨细胞以及胃和结肠癌细胞中受泛素-蛋白酶体系统的调节(Wu，W.K.，etal.(2008)Biochem.Biophys.Res.Commun，371，209-214；Garrett，I.R.，et al.J.Clin.Invest，111，1771-1782；Wu，W.K.，et al.(2008)Br.J.Pharmacol，154，632-638)。与这些发现一致，我们发现LL-37抑制蛋白酶体的糜蛋白酶-样活性和半胱天冬酶-样活性。蛋白酶体抑制剂还通过上调BMP4表达和Smad1/5磷酸化反映了LL-37的作用。蛋白酶体抑制剂和LL-37间的模拟表明，LL-37通过抑制蛋白酶体活性激活了抗有丝分裂的BMP信号转导(Wu，W.K.，et al.(2010)J.Cell.Physiol.223，178-186)。关于TGF-β信号转导，Smad6的诱导可以在BMP信号转导激活时抑制Smad2/3磷酸化，该Smad6通过抑制两条通路作为TGF-β/BMP信号转导的自调节子。TGF-β和BMP信号转导的差异调节可以部分解释为什么Smad7的表达被诱导的程度低于Smad6。在这方面，Smad6基因的转录活性主要受BMP信号转导的调节，而Smad7的转录活性受两者调节。BMP信号转导比TGF-β信号转导在上皮细胞中能够诱导更高的p21Waf1/Cip1表达这一事实也可以解释为什么该CDK抑制剂的表达被LL-37特异性地诱导。
细胞周期进程需要不同细胞周期调节剂诸如细胞周期素、CDK和CDK抑制剂的协调表达。我们的结果表明，已知抑制细胞周期素E/CDK-2复合物活性的p21Waf1/Cip1表达受LL-37诱导，并伴随着细胞周期素E2表达的抑制。已知细胞周期素E的表达和CDK-2活性随后的增加对于细胞周期进程通过晚G1期是必需的。这些发现提示，LL-37引发的抗有丝分裂信号转导通过同时上调p21Waf1/Cip1和下调细胞周期素E2的双重CDK-2抑制可以精确定位到细胞周期的晚G1-期。事实上，p21Waf1/Cip1表达的缺失与胃癌增加的肿瘤大小和淋巴结转移有关。而且，细胞周期素E表达还与胃癌患者中的组织学分级和缩短的存活相关。这些临床发现以及我们的实验数据表明，LL-37表达的缺失参与胃癌的进程。
我们目前的研究证实了LL-37的mRNA表达在胃癌组织中下调。该发现与Hase等报道的LL-37免疫染色在人腺癌中减少的观测结果相符。然而，LL-37在胃癌组织中下调的机制是未知的。因此，LL-37/hCAP-18基因定位的基因座3p21在胃癌中频繁地缺失，以及许多胃癌细胞系具有纯合的3p缺失，这表明遗传机制可能与LL-37在胃癌中的下调有关。除了染色体水平的基因缺失外，胃癌组织中维生素D代谢的失调是LL-37下调的另一可能机制。关于胃肿瘤形成，CYP24基因的拷贝数在大量胃癌病例中是增加的，其中CYP24基因编码的酶负责25-羟基维生素D3和1α，25-双羟基维生素D3的代谢。这提出了以下可能性：1a，25-双羟基维生素D3减少的从头合成和增加的降解可能发生在胃癌中，从而导致在局部组织环境中的自分泌刺激不足以驱动LL-37的表达。
综合起来，我们的实验结果不仅首次揭露了LL-37发挥它在胃癌形成中的抗有丝分裂功能所利用的机制途径，而且对先天性免疫在胃癌发病机理中的作用进行了新的阐述。
实施例2：导管素的递送减轻了结肠炎
通过靶向破坏Cnlp基因产生导管素-敲除小鼠，Cnlp基因编码小鼠导管素mCRAMP。在Cnlp-/-和野生型小鼠中通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导实验性结肠炎。通过临床病理评分以及促炎细胞因子水平和髓过氧化物酶(MPO)活性的测量来评价结肠炎的严重程度。排泄物微生物群通过定量培养来测定。粘液分泌和粘蛋白基因表达分别通过高碘酸希夫染色(Periodic acid-Schiff staining)和实时PCR来测量。通过明胶酶谱法来测定基质金属蛋白酶(MMP)-9的活性。结果：Cnlp-/-小鼠在响应DSS刺激时，比野生型小鼠表现出更严重的症状和粘膜破坏。白介素-1β和肿瘤坏死因子-α的组织水平、MPO活性和凋亡细胞的数目在DSS-刺激的Cnlp-/-小鼠的结肠中是增加的，在所述结肠中生存有更大量的需氧菌和厌氧菌。而且，粘液分泌和粘蛋白基因表达受损，而MMP-9活性在Cnlp-/-小鼠中上调。所有这些异常都被mCRAMP肽或mCRMAP编码质粒的直肠内给药逆转。结论：我们提供了导管素防御溃疡性结肠炎的在体证据。
方法学
动物
如以前所述，产生129/VJ野生型小鼠和导管素-敲除(Cnlp-/-)小鼠(Nizet，V.et al.，Nature 414：454-7(2001))。雄性(6-8-周龄)小鼠用于以下实验。它们被允许自由接触标准的实验室食物(Ralston Purina，Chicago，IL)和自来水。所有动物均饲养在备有空调装置的房间，具有可控的温度(22℃±1℃)、湿度(65％-70％)和白天/夜晚循环(12：12-h光照：黑暗)。本研究经香港中文大学关于使用活体动物用于教学和科研的委员会批准。
结肠炎的诱导
根据Liu等改进的方法(Liu，E.S.et al.，Carcinogenesis 24：1407-1413.Epub 2003 Jun 1405(2003)，通过给予3％葡聚糖硫酸钠(DSS)(分子量，36-50kDa；ICN Pharmaceuticals，Costa Mesa，CA)诱导小鼠的急性结肠炎。给予饮用水中的3％DSS 5天(从第0天至第5天)。在整个实验中接受自来水的小鼠用作正常对照组。
mCRAMP治疗
将小鼠分为两大组：野生型组和Cnlp-/-组。每组包含仅接受自来水的正常对照组以及接受3％DSS的疾病组。为了评价mCRAMP对小鼠溃疡的保护作用，患结肠炎的Cnlp-/-小鼠被进一步分为三个亚组：一组没有任何治疗，两组给予mCRAMP补充物。全长的成熟mCRAMP购自Innovagen(Lund，Sweden)，并将该肽溶于磷酸缓冲盐(PBS)中用于直肠给药。如前所述，每天给予5mg/kg的该肽(Tai，E.K.et al.，Exp Biol Med(Maywood)232：799-808(2007))。疾病对照小鼠经直肠内接受等体积的PBS。
质粒治疗
按照Kanbe等报道的方法，实现了向结肠上皮细胞的有效基因转移(Kanbe，T.et al.，Biochem Biophys Res Commun 345：1517-1525(2006))。mCRAMP-表达质粒pcDNA3.1/mcramp通过将全长mCRAMP cDNA克隆入pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)来构建。靶基因表达受巨细胞病毒启动子调控。没有mCRAMP插入物的相同质粒用作阴性对照。所有质粒均在DH5α大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen)中扩增，并用无内毒素质粒抽提试剂盒(endo-free plasmid mega-kit，Qiagen，Valencia，CA)来纯化。在结肠炎诱导开始时(即，第0天)，将200μg的质粒DNA经直肠内给药。给药后将小鼠保持在倒立位置1分钟以防止质粒从肛门漏出。
临床症状
对于所有动物，在实验结束时记录体重、粪便硬度和显性出血(grossbleeding)的出现。取出结肠后，测量结肠从结盲肠交界到肛门边缘的长度。根据Cooper等描述的方法计算疾病活动指数(DAI)(Cooper，H.S.et al.，Lab Invest 69：238-249(1993)。简言之，体重减轻、粪便硬度和显性出血评分为0至4，以及DAI是组合分数除以3。
形态学分析
将所有小鼠的结肠切片固定在10％福尔马林溶液(pH 7.4)中。制备结肠的纵向切片后，用石蜡切片中的苏木精-伊红染色进行组织学检查。如以前所述，测量指示结肠完整性的隐窝长度(Tai，E.K.et al.，Exp BiolMed(Maywood)232：799-808(2007))。
结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)活性
如前所述，测量结肠MPO活性(Guo，X.et al.，Gastroenterology117：884-892(1999))。简单来说，将结肠组织在含0.5％十六烷基三甲基溴化胺的50mmol/ml冰冷PBS(pH 6.0)溶液中匀浆。匀浆液冻融三次，随后每次都重复超声60秒，并在4℃以14000rpm离心20分钟。通过分光光度法测量450nm处的上清液活性。最终值表示为每mg蛋白的酶单位。
排泄物微生物菌落计数
对新鲜排出的粪便进行定量的排泄物微生物菌落研究。将收集的排泄物重悬在无菌PBS中。进行系列稀释得到10-4，10-5，10-6和10-7的终浓度后，将每一稀释物的一部分(100μl)分别涂布在脑心浸液琼脂(Sigma，St.Louis，MO)和血琼脂(哥伦比亚琼脂基中的5％去纤维蛋白的绵羊血液，Sigma)上进行需氧菌和厌氧菌微生物菌落分析。用于需氧菌的接种平板于37℃在空气中孵育24h。用于厌氧菌计数的培养基在厌氧室(80％氮气，10％氢气和10％二氧化碳)中于37℃下孵育48h。微生物菌落的总数表示成每一干重粪便中发现的菌落形成单位(CFU)总数的对数。
凋亡的评价
以前所述的末端脱氧核糖核酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)方法用于染色凋亡细胞(Gavrieli，Y.et al.，J Cell Biol 119：493-501(1992)。在200×放大倍数下4-6个随机选择的视野中对凋亡细胞数进行计数。
粘液厚度的评价
将结肠样品在福尔马林中过夜固定，并包埋在石蜡中。制备5微米切片，并如以前所述的那样用高碘酸希夫(PAS)技术进行染色(Ma，L.et al.，Gut 47：170-177(2000))。切片用Harris苏木精进行复染，并在Permount(Fisher Scientific，Philadelphia，US)中封片。含粘液的细胞被染为紫红色。在100×放大倍数的图像分析仪(Q500IW；Leica Image Systems)下，从上皮边缘到粘液层最外面部分垂直于粘膜表面测量粘液层的厚度。每一视野进行三次测量，并且每一切片测量约六个连续视野，结果表示为粘液层的厚度与总粘膜厚度的比值。
粘蛋白基因表达的定量分析
按照生产商的说明书，利用TRIzol试剂(Invitrogen)从小鼠结肠组织分离总RNA。利用Thermoscript逆转录-聚合酶链式反应系统(Invitrogen)，将总计2.5μg提取的RNA用作互补DNA(cDNA)合成的模板。利用以前发表的引物对，进行MUC1，MUC2，MUC3，MUC4和β-肌动蛋白的定量实时PCR(Tai，E.K.et al.，Exp Biol Med(Maywood)232：799-808(2007))。利用iQ SYBR绿色超混合物(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在iCycler热循环仪(Bio-Rad)上扩增cDNA，设定程序如下：95℃10分钟，然后为40个循环的变性(95℃15秒)，退火(59℃15秒)和延伸(72℃15秒)。利用iQ5实时PCR检测系统检测和分析扩增结果。将基因信号针对对应的β-肌动蛋白信号进行标准化，并且结果表示为每一分子与β-肌动蛋白的比值。
明胶酶谱法
在非还原条件下，通过酶谱法测量MMP-9的活性(Snoek-van Beurden，P.A.et al.，Biotechniques 38：73-83(2005))。简言之，将结肠组织在裂解液(1∶10)中匀浆，所述裂解液含50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐和0.1％SDS。通过明胶酶谱法，在与1mg/ml明胶共聚合的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析样品缓冲液(10％SDS，0.25M Tris-HCl和0.1％溴酚蓝，pH 6.8)中的等量的可溶提取物。电泳后，将凝胶在2.5％曲拉通(Triton)X-100中洗涤两次，每次15分钟，37℃下在50mM Tris-HCl和10mM CaCl2(pH 7.6)中孵育16小时，然后用考马斯亮蓝染色并用50％甲醇脱色。通过负染色的存在来确定活性蛋白酶条带。然后在多用分析仪(Bio-Rad)中半定量分析凝胶照片。
结肠组织中细胞因子的测量
按照生产商的方案，利用商购的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，USA的Quantikine小鼠IL-1β/IL-1F2和TNF-α/TNFSF 1A免疫测定)测量结肠组织中白介素-1β(IL-1β)和TNF-α两种细胞因子的量。生产商确定的最小可检测浓度分别是3pg/ml和5.1pg/ml。所有样品一式两份进行，并将结肠中产生的细胞因子水平计算为每mg蛋白的量。
统计学分析
所有数据表示为平均值±标准误(S.E.)。通过利用ANOVA比较平均值，以及P值＜0.05被视为是统计学上显著的。
结果
Cnlp-/-小鼠更易患DSS-诱导的结肠炎。
在本研究中，使用Cnlp-/-小鼠以特别研究mCRAMP在胃肠保护中的体内功能。发现Cnlp-/-小鼠对DSS-诱导的结肠炎更为敏感。DSS处理5天时，与呈现轻微反应的野生型动物相比，Cnlp-/-小鼠出现了更为严重的临床症状，诸如显性出血、腹泻和体重减轻(表1)。代表疾病严重程度的DAI和隐窝评分在Cnlp-/-小鼠中明显更高。
mCRAMP补充物防止结肠炎发展
临床症状为了进一步检查mCRAMP对结肠炎的保护作用，按照实验计划，将合成肽(5.0mg/kg/天)或mCRAMP-表达质粒经直肠内给予小鼠(Fig.8)。单次剂量的(200μg)的质粒给药有效地上调了mCRAMP的结肠表达(Fig.9)。这种上调在10天后逐渐降低(数据未显示)。Cnlp-/-小鼠患更为严重的结肠炎，而在野生型小鼠观测到可忽略的症状(表1)。重要的是，两种mCRAMP补充物均显著减轻了Cnlp-/-小鼠中DSS-诱导的结肠炎。与没有经过任何治疗的结肠炎Cnlp-/-小鼠相比，mCRAMP-治疗的小鼠显示了增加的体重，减轻的疾病症状、结肠粘膜损伤、降低的DAI和隐窝评分。
表1-mCRAMP裸基因疗法对急性结肠炎症状的影响
Figure BPA00001499215300351
注释：(1)n＝每组3只。
(2)体重减轻被定义为体重降低≥1％。
(3)
Figure BPA00001499215300352
P＜0.05，与正常对照组相比。
(4)*P＜0.05，与载体对照组相比。
组织学评价结果显示，在未处理的野生型和Cnlp-/-小鼠间，没有结肠形态学的差异。尽管DSS对野生型小鼠发挥了可以忽略的影响，但是DSS-处理的Cnlp-/-小鼠显示了结肠炎症和组织破坏的显著迹象(Fig.10)。这些小鼠表现出红血细胞的积聚、上皮溃疡形成和隐窝结构的丧失。通过隐窝评分的明显改变进一步说明这些情况(表1)。对比之下，对来自患结肠炎的mCRAMP-处理的Cnlp-/-小鼠的切片进行组织学分析显示出组织学炎症的明显减轻，以及这些动物免受DSS-诱导的粘膜损伤，有较轻的上皮变形。mCRAMP补充物还增加了结肠粘膜的隐窝再生和恢复，使其可与正常Cnlp-/-小鼠相比较。
结肠长度结肠长度缩短是炎症的一个参数(Okayasu，I.et al.，Gastroenterology 98：694-702(1990))，与临床症状相关。5天DSS处理对野生型小鼠的结肠长度没有影响(Fig.11A)。然而，没有经过mCRAMP治疗的结肠炎Cnlp-/-小鼠的结肠长度明显短于正常Cnlp-/-小鼠和患结肠炎的野生型小鼠。两种mCRAMP补充物有效地抑制了DSS-刺激的Cnlp-/-小鼠的结肠缩短。
MPO活性通过测量MPO活性对嗜中性粒细胞向结肠的浸润进行定量。正常Cnlp-/-小鼠中的结肠MPO活性倾向于高于野生型小鼠，尽管不显著(图11B)。该活性在结肠炎动物中大幅增加，其中Cnlp-/-小鼠展示出比野生型小鼠高得多的活性。在这一方面，mCRAMP补充物使结肠炎Cnlp-/-小鼠的MPO活性明显正常化以接近那些没有用DSS诱导的小鼠。
结肠的细胞因子水平来自所有测试动物的结肠组织中的IL-1β和TNF-α两种促炎性细胞因子水平通过ELISA来测量。5天DSS处理显著提升了两种细胞因子在野生型和Cnlp-/-小鼠中的量(图11C&D)。特别地，与野生型动物相比，Cnlp-/-小鼠中的水平增加的程度最大。这一发现与疾病严重程度类似，其中Cnlp-/-小鼠展示出更为严重的结肠炎症状。结肠炎Cnlp-/-小鼠中的这些增加被两种mCRAMP补充物有效逆转。
MMP-9活性利用明胶酶谱法，分析来自结肠炎动物的蛋白提取物中的结肠MMP-9活性。代表性酶谱和计算的活性显示在图12中。在从结肠炎野生型小鼠制备的提取物中检测到非常低的MMP-9活性。相比之下，结肠炎Cnlp-/-小鼠的结肠MMP-9活性急剧增加。在结肠炎Cnlp-/-小鼠中观测到超过3倍的增加。结肠炎诱导期间补充mCRAMP明显将MMP-9活性降低到接近野生型的水平。
凋亡的评估TUNEL染色显示，凋亡细胞数目在两种类型小鼠炎症期间显著增加(Fig.13)。特别地，Cnlp-/-小鼠中的增加比野生型动物高得多。mCRAMP补充物将凋亡细胞数目大幅降回基础水平。
排泄物微生物菌落群排泄物微生物菌落检查显示，诱导结肠炎后，Cnlp-/-小鼠中需氧菌群(Fig.14A)和厌氧菌群(Fig.14B)明显增加。mCRAMP补充物逆转了这些增加，以及需氧菌和厌氧菌的数量可以与正常Cnlp-/-小鼠中的数量相当。在野生型动物中，尽管DSS处理倾向于增加排泄物需氧菌群和厌氧菌群，但没有检测到明显变化。
粘液厚度如通过PAS染色所显示的，野生型和Cnlp-/-小鼠中结肠粘液分泌层的厚度在结肠炎时明显降低(Fig.15A)。特别地，结肠炎Cnlp-/-小鼠中的厚度降低程度最大，与正常Cnlp-/-小鼠相比，降低了39％。饲喂DSS期间，mCRAMP的直肠内补充显著增加了粘液分泌层的厚度。
粘蛋白基因表达利用实时PCR，监测粘液的基本组成部分MUC1，MUC2，MUC3和MUC4的结肠基因表达，并在组间进行比较。这些结果与我们前面的报道是一致的，并总结于Fig.15B-E中。所有检测的粘蛋白基因在野生型和Cnlp-/-小鼠炎症期间均显著减少。特别是，Cnlp-/-小鼠的基因表达下调程度最大。mCRAMP补充物显著逆转了炎症期间下调的表达。
讨论
内源性抗微生物肽，诸如β-防御素和导管素在哺乳动物天然免疫系统中发挥必要的作用。特别是导管素在过去的几十年中受到了大量的关注，因为它对炎症和伤口愈合的显著影响(Tai，E.K.et al.，Ulcer research33：54-61(2006)。我们之前已经证实，合成的小鼠导管素直肠内给药能够有效地减轻鼠科模型中的实验性结肠炎(Tai，E.K.et al.，Exp Biol Med(Maywood)232：799-808(2007))。为了充分研究导管素在胃肠保护中的功能，评价了编码mCRAMP的基因Cnlp靶向缺失的小鼠和野生型小鼠由DSS诱导的结肠炎的症状表现和组织病理学表现。在本研究中还研究了通过直肠内途径的外源性mCRAMP和mCRAMP基因转移的保护作用。
在正常情况下，Cnlp-/-小鼠倾向于具有比野生型小鼠更短的结肠长度、更高的MPO活性、更高的排泄物微生物菌落群以及更薄的结肠粘液，尽管没有检测到明显差异。这些可以部分地解释Cnlp-/-小鼠中对DSS-诱导的结肠炎增加的敏感性。组织学发现表明，Cnlp缺失没有导致结肠上皮结构的明显变化(Fig.10)。直肠内mCRAMP肽治疗的功效已在我们以前的研究得以证实(Tai，E.K.et al.，Exp Biol Med(Maywood)232：799-808(2007))。然而，肽的高生产成本限制了导管素在人IBD中的临床应用。为了克服该问题，我们已经采用了Kanbe等报道的新型基因递送策略来上调mCRAMP在结肠上皮中的表达(Kanbe，T.et al.，Biochem Biophys ResCommun 345：1517-1525(2006))。构建mCRAMP-表达质粒，以及该质粒的直肠内给药能够成功地促进mCRAMP在结肠中的蛋白表达多达10天(Fig.9)。本文的结果巩固了以下观点：裸DNA的直肠内给药可以是人类溃疡性结肠炎的有效疗法。
本研究强调了导管素在胃肠保护中的重要性。Cnlp-/-小鼠表现出对DSS-诱导的结肠炎显著增加的敏感性。动物的特征为结肠炎症的出现，表现为明显的体重减轻、腹泻、显性出血、隐窝破坏、粘膜损伤和上皮侵蚀。相比之下，野生型小鼠在5天DSS诱导后仅显示了轻微的反应。令人感兴趣的是，注意到两种mCRAMP补充物能够有效地保护Cnlp-/-小鼠免于DSS-相关的粘膜损伤，有轻微的结肠炎症状和较少的上皮破坏。mCRAMP治疗减轻了嗜中性粒细胞在炎性结肠组织中的浸润，如结肠的MPO活性大幅下降所显示的(Fig.11)。这部分解释了mCRAMP在炎症中的保护作用。此外，凋亡是胃肠道粘膜溃疡形成过程的一个因素(Liu，E.S.et al.，Digestion 62：232-239(2000))，扰乱结肠粘膜中的这一过程可能与IBD的发病机理有关。因此，mCRAMP可以通过抑制结肠组织中的凋亡防止DSS-诱导的结肠炎(Fig.13)。
在过去的几十年中，注意到了肠道细菌对IBD的有害作用。IBD患者中，肠道微生物菌落的量高于健康个体，并且随着疾病的严重程度逐渐增加(Swidsinski，A.et al.，Gastroenterology 122：44-54(2002))。如所预期的，在结肠炎Cnlp-/-小鼠中观测到排泄物需氧菌群和厌氧菌群的大幅增加，而mCRAMP补充物能够逆转该变化，尽管在野生型小鼠中没有发现明显变化。该结果与我们以前的以下发现是一致的：mCRAMP肽的直肠内给药通过消除炎症期间微生物菌落增加从而中止了结肠炎的发展。
与以前的报道(Tai，E.K.et al.，Exp Biol Med(Maywood)232：799-808(2007))相符，在结肠粘液分泌层的厚度中发现了相似的观测结果。Cnlp-/-小鼠在结肠炎诱导后显示出粘液层厚度的明显下降，以及重要的是，mCRAMP补充物保持了粘液分泌层，并且有效地逆转了粘液厚度的减少(Fig.14)。实时PCR的结果表明，导管素通过上调包括MUC1，MUC2，MUC3和MUC4的粘蛋白类的mRNA表达刺激结肠粘膜的粘液合成。越来越多的证据表明，异常的粘液分泌是IBD的致病标志。结肠粘液厚度的明显减少与溃疡性结肠炎的起始或存在有关(Corfield，A.P.et al.，InfectImmun 60：3971-3978(1992))。在溃疡性结肠炎的急性期，粘液层被严重破坏并且是不连续的，有60-70％的厚度(Pullan，R.D.et al.，Gut 35：353-359(1994))。最近的MUC2-敲除小鼠模型已经进一步确证了粘液合成的破坏能够加剧DSS诱导的实验性结肠炎(Van der Sluis，M.et al.，Gastroenterology 131：117-129(2006))。这些发现证实了以下观点：导管素可以通过提高粘蛋白基因表达和增加结肠粘膜中的粘液合成作为治疗溃疡性结肠炎的治疗工具，发现所述粘蛋白基因表达和粘液合成在溃疡性结肠炎患者中是被扰乱的。
为了进一步阐明导管素的作用机制，我们集中在MMP-9的活性上，MMP-9是在Cnlp-/-和野生型小鼠急性结肠炎时在肠道粘膜中主要表达的蛋白酶。MMP-9由几种细胞类型产生，包括巨噬细胞、上皮细胞和成纤维细胞(Gan，X.et al.，J Interferon Cytokine Res 21：93-98(2001)；McCarthy，G.M.et al.，Ann Rheum Dis 57：56-60(1998))。已表明，肠上皮细胞在响应炎症时分泌MMP-9(Gan，X.et al.，J Interferon Cytokine Res 21：93-98(2001))。此外，MMP-9-缺陷小鼠对实验性结肠炎的抗性已经指明MMP-9参与肠炎症(Castaneda，F.E.et al.，Gastroenterology 129：1991-2008(2005))。本文呈现的结果首次说明了结肠炎Cnlp-/-小鼠的结肠MMP-9活性明显增加，以及令人感兴趣的是，mCRAMP补充物能够完全使这种增加正常化(Fig.12)。看起来，导管素能够通过调节MMP-9活性加强针对炎症的粘膜防御，MMP-9活性控制组织重塑和与IBD有关的溃疡。MMP-9活性导致的改变与指示嗜中性粒细胞浸润的结肠MPO活性降低有关。Castaneda等已经说明了MMP-9在嗜中性粒细胞募集中的重要性(Castaneda，F.E.et al.，Gastroenterology 129：1991-2008(2005))。MMP-9-缺陷小鼠在结肠粘膜和固有层具有最少的炎症浸润物。事实上，一些基底膜成分是MMP-9的底物，并且已经提出MMP-9能够促进嗜中性粒细胞的迁移。
已确立，促炎性细胞因子在肠粘膜炎症中发挥关键作用(Bouma，G.etal.Nat Rev Immunol 3：521-533(2003)；Pullman，W.E.et al.，Gastroenterology 102：529-537(1992))。在来自IBD患者的粘膜组织样品中已经检测到提高水平的多种细胞因子(Murata，Y.et al.，J Gastroenterol30 Suppl 8：56-60(1995))。它们有助于嗜中性粒细胞和单核细胞向IBD病损处的增加迁移以及有助于激活炎症细胞。特别地，已经提出，IL-1β，IL-6和TNF-α参与IBD的发病机理(Fiocchi C.Gastroenterology 115：182-205(1998)；Stevens，C.et al.，Dig Dis Sci 37：818-826(1992))。这些细胞因子导致炎症级联的放大以及导致组织损伤的更多炎症介质、破坏性酶和自由基的分泌(Sartor，R.B.Gastroenterology 106：533-539(1994))。野生型和Cnlp-/-小鼠的结肠组织分析显示在DSS-诱导的结肠炎时IL-1β和TNF-α水平的显著增加。更显著地，Cnlp-/-小鼠中的增加比野生型小鼠高约40-50％。与上述观测结果一致，mCRAMP补充物能够有效地消除结肠细胞因子水平的变化。实时PCR数据显示，小鼠中IL-6水平没有可观测到的变化(数据未显示)。结合起来，这些结果支持我们的假设，即导管素能够通过调节促炎性细胞因子的分泌来减轻肠道炎症。
另外，导管素对细胞因子的调节作用可以解释它对MMP-9活性的抑制作用。逐渐增加的证据揭示，促炎性细胞因子增加了MMP产生(Mott，J.D.et al.，Curr Opin Cell Biol 16：558-564(2004))。TNF-α通过激活丝裂原激活的蛋白激酶大幅刺激了人单核细胞中的MMP-9表达。通过孵育抗TNF-α的中和抗体还取消了组成性MMP-9分泌(Heidinger，M.et al.，BiolChem 387：69-78(2006))。此外，Xie等进一步表明IL-1β一致地刺激成年大鼠心脏成纤维细胞中的MMP-2和MMP-9活性(Xie，Z.et al.，J BiolChem 278：48546-48552(2003))。看起来，本文的细胞因子数据暗示导管素对MMP-9活性的非直接作用。导管素可能干扰IL-1β和TNF-α的分泌，并最终导致MMP-9活性的下降。
目前为止呈现的结果提供了导管素对结肠炎症保护作用的直接证据。Cnlp-/-小鼠展示了对DSS-诱导的结肠炎增加的敏感性，并且导管素补充或基因疗法能够有效减轻肠道炎症。mCRAMP-治疗的结肠炎小鼠显示了更轻微的炎症反应，具有减轻的临床症状和较少的粘膜损伤。除了抗微生物作用和对结肠粘液合成的刺激作用，我们还证实了它对结肠内促炎性细胞因子分泌以及MMP-9活性的抑制作用。导管素可以通过阻断细胞因子的有害炎症级联以及通过降低MMP-9的细胞外基质降解来防止结肠炎的发展。我们以前已经报道了肠粘膜损伤和修复的反复循环能够增加结肠癌风险(Liu，E.S.et al.，Carcinogenesis 24：1407-1413.Epub2003 Jun 1405(2003))。溃疡性结肠炎的预防治疗也许能够克服IBD患者发生癌症的风险。导管素的多重作用使它成为IBD和结肠炎相关的结肠癌的预防疗法。
实施例3：表达导管素的乳球菌的递送减轻炎症和结肠炎
本发明提供了治疗胃肠道多因素细菌相关疾病的药剂。导管素是抗菌肽，其内源性地存在于胃肠道的上皮，但在癌症组织中是缺乏的并且在炎症组织中是上调的。此处，我们描述了利用基因工程技术用编码导管素的DNA片段转导益生乳酸乳球菌以延长该功能肽在胃肠道中的表达。这一多靶标制剂用于例如预防和治疗胃肠道的炎性病症和癌性病症。
利用下述的生物技术，我们构建和开发了分泌导管素的益生菌，即乳酸乳球菌。
乳酸链球菌肽调控导管素在乳酸乳球菌中的分泌
重组质粒构建
基于乳酸乳球菌的偏爱密码子通过化学方法合成编码导管素(LL-37或如下更详细讨论的小鼠导管素)的DNA片段，并在5′-和3′-端分别具有两个限制酶位点。我们使用待并入乳酸乳球菌密码子的编码人导管素(LL-37)和小鼠导管素(mCRAMP)的DNA片段。对于最终的重组质粒pNZ8149-usp-Cath，LL-37或者mCRAMP分别用于确定细菌中的LL-37合成或者用于研究小鼠的溃疡性结肠炎。为了在食品级乳酸菌乳酸乳球菌中产生分泌性导管素，将编码usp45基因的信号肽和9-残基前肽LEISSTCDA(LEISS)的DNA片段直接并入导管素的上游。将DNA片段克隆入乳酸链球菌肽-调控的基因表达(NICE系统)载体pNZ8149中以产生重组质粒pNZ8149-usp-Cath。重组质粒通过DNA测序来确认。
乳酸链球菌肽调控导管素在乳酸乳球菌中的分泌性表达
pNZ8149质粒和乳酸乳球菌购自NIZO Food Research B.V.(TheNetherlands)。pNZ8149(空载体)是一种由食品级lacF基因取代cat-基因作为选择标志物的载体。它与乳酸乳球菌NZ3900联合使用。我们使用乳酸乳球菌NZ3900的宿主菌株，其是基于nisR和nisK基因整合入染色体的模型菌株MG1363。它是乳酸链球菌肽诱导型载体的宿主菌株。在缺失lacF基因的染色体上有乳糖操纵子。它可以与载体pNZ8149联合用于食品级过量生产。我们分别将PNZ8149-usp-Cath和pNZ8149质粒转化入乳酸乳球菌NZ3900。pNZ8149用作空载体对照。
通过电穿孔法将pNZ8149-usp-Cath质粒转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900。含pNZ8149-usp-Cath质粒的NZ3900阳性克隆通过PCR来筛选。我们获得了两个阳性克隆，如通过PCR和酶消化法所确认的。将5毫升含pNZ8149-usp-Cath重组质粒的NZ3900细菌在30℃培养过夜。然后将转导的乳酸乳球菌在2×50ml新鲜M17培养基中以1/25稀释，并在30℃孵育直至OD600＝～0.4-0.5，并将10ml培养物用10ng/ml乳酸链球菌肽(Sigma)再诱导3小时。另外的10ml用作阴性对照。然后将细胞以4500×g离心15分钟，并将上清液转移至新的50ml管中。将15毫升上清液添加至超滤过滤元件(amicon ultra-15 filter unit)(Millipore，ULTRACE-3K)中。将加盖的过滤装置置于摆动桶离心机转子中并以4000×g旋转45分钟。将吸液管插入过滤元件底部，将样品取出至1.5ml Eppendorf管中。剩余的体积约为500μl。
通过ELISA检测分泌的导管素
按照使用者手册，通过ELISA(人LL-37 ELISA检测试剂盒，HbtHK321，Hycult Biotechnology(HBT)，Netherlands))检测诱导的培养物和阴性对照的上清液和浓缩样品中导管素肽的量。30×浓缩样品的导管素浓度如下：克隆2-1：570pg/ml；克隆2-2：540pg/ml。上清液导管素浓度为：克隆2-1：58pg/ml，克隆2-2：48pg/ml。
表达LL-37的乳酸乳球菌减轻小鼠的结肠炎
6-8周龄的雄性Balb/c小鼠用于以下实验中。它们被允许自由接触标准的实验室食物和自来水。所有动物饲养在备有空调装置的房间，有可控的温度(22℃±1℃)、湿度(65％-70％)和白天/夜晚循环(12∶12-hr光照：黑暗)。通过给予制备在饮用水中的3％葡聚糖硫酸钠(DSS，分子量，35-50kDa)7天(从第0天至第7天)，诱导小鼠的急性结肠炎。正常对照小鼠在整个实验过程中接受自来水。乳酸乳球菌NZ3900或转化了小鼠导管素的NZ3900分别在添加了0.5％葡萄糖和0.5％乳糖的M17肉汤中于30℃在无曝气条件下孵育过夜，然后在新鲜肉汤中以1∶25比稀释，并孵育至OD600达到0.4-0.5。在不同组转化的NZ3900中，添加0.25ng/ml的乳酸链球菌肽，并进一步孵育3h。然后通过离心(5000rpm，15min)收获细菌，并用无菌PBS(pH 7.4)洗涤两次，然后重悬在无菌水中得到2×1010cfu/ml。在开始饲喂DSS时，一天一次经胃内(i.g.)给予小鼠0.5ml(1×1010cfu)细菌。7天DSS饮水和细菌饲喂结束时处死动物。
如以前所描述的，进行结肠髓过氧化物酶(MPO)的测量(Guo X，et al.Gastroenterology 117，884-892(1999))。简言之，将结肠组织在含0.5％十六烷基三甲基溴化铵的50M冰冷PBS(pH 6.0)溶液中匀浆。将匀浆液冻融三次，随后每次都重复超声60秒，并以每分钟14,000的转数在4℃离心20分钟。通过分光光度法，在450nm处测定上清液的活性。最终值表示为每毫克蛋白的酶单位。
导管素转染以及乳酸链球菌肽诱导的乳酸乳球菌的口服给药保护小鼠免受葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎。MPO测定的结果显示在图16和图17的两组实验中。发现该作用是显著的并是剂量依赖的(从108至1010CFU)。注意到最有效的剂量是1010CFU每天给予一次，共7天。预期高于这一剂量10倍会对人类溃疡性结肠炎有效。
隐窝损失是结肠炎中的组织学发现。因此，对给予图16每一制剂的小鼠进行了组织学分析。依据如下的4个分级标准对隐窝进行分级：0级：完整的隐窝；1级：隐窝基底1/3损失；2级：隐窝基底2/3损失；3级：完整隐窝损失，表面上皮保持完整；4级：完整隐窝和表面上皮都损失。图19显示了分析的结果，并且表明，与对照相比，给药经诱导表达导管素的细菌显著降低了隐窝损失。
利用导管素转染以及乳酸链球菌肽诱导的乳酸乳球菌的口服给药更详细地重复了这些实验以检测针对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎的保护。实验结果可以在图20-36中发现并可以总结如下：
1.当每天口服给药一次，给药7天时，有或没有转化mCRAMP的乳酸乳球菌NZ3900没有不利地影响小鼠结肠粘膜和结肠中微生物的数目。
2.然而，给予饮用水中的DSS 7天诱导小鼠的人-样溃疡性结肠炎。DSS增加疾病活动性(体重下降、腹泻和带血粪便)、隐窝损伤、粘液耗竭、嗜中性粒细胞浸润(反映为增加的MPO活性)、脂质过氧化(反映为增加的MDA水平)以及结肠粘膜中的凋亡细胞，还增加了排泄物中的微生物数目。DSS还减少了结肠长度与体重比，这是结肠炎症的典型和良好指征。
3.转染了mCRAMP、尤其是用乳酸链球菌肽诱导的乳酸乳球菌NZ3900显著逆转了所有上述作用。所有这些发现表明，转化了导管素的益生菌可能对于预防溃疡性结肠炎具有治疗潜力。
4.用于溃疡性结肠炎的原型药柳氮磺胺吡啶产生了相似的预防作用。然而，不像编码导管素的乳酸乳球菌，柳氮磺胺吡啶没有影响结肠中微生物的数目、MPO活性、粘液水平和结肠粘膜中的凋亡细胞数目。这些发现提示，乳酸乳球菌在治疗溃疡性结肠炎中比柳氮磺胺吡啶具有更好的治疗作用。
5.停止DSS 4天后，DSS给药继续降低结肠长度/体重比(结肠炎症的指征)。转染了mCRAMP加上乳酸链球菌肽诱导处理4天的乳酸乳球菌NZ3900显著逆转了这一作用。
6.停止DSS给药后4天，DSS还继续增加MPO活性，但这一作用不受所有测试的制剂影响。
7.DSS给药结束4天后，MDA水平的增加是不明显的。同样，这不受本研究中测试的制剂的影响。
实施例4：表达导管素的乳球菌的递送减轻了胃癌
胃癌诱导
MKN-45癌细胞用胰酶消化、收集并在冰上重悬在磷酸缓冲盐(PBS，pH＝7.2)中。然后将0.2mL的1×107细胞经皮下注射入4-6周龄雌性BALB/c nu/nu小鼠的左腋窝区。体内第二代培养后，将皮下肿瘤无菌取出，切割成约1mm3的块，并在冰上保持在PBS中。在受体小鼠中，用锉刀小心地使具有丰富血管的胃大弯的浆液层破裂直至看得见出血，然后植入一块肿瘤。动物维持在无菌环境中。
益生菌治疗
植入后7天，将小鼠随机分为两组：接受0.25mL蒸馏水的对照组和接受0.25mL 1×1010CFU/mL转化了人导管素LL-37的乳酸乳球菌NZ3900(编码LL-37的乳酸乳球菌)的治疗组，所述乳酸乳球菌NZ3900已用0.25ng/mL乳酸链球菌肽孵育3小时。每隔一天，小鼠用这些制剂通过口服途径治疗，总共2周。实验结束时，处死小鼠，并切除肿瘤用于进一步的测定。
结果：
用编码有LL-37并经乳酸链球菌肽诱导的乳酸乳球菌治疗2周使肿瘤生长显著降低70％。参见图37。
小结
已经在体外和体内确立了导管素对大鼠胃部的溃疡愈合作用，包括通过TGFα和EGF受体的作用机制。已经明确小鼠结肠中的抗炎作用，包括体外和体内增加粘液分泌和减少炎性细胞因子如TNF-α和IL-1β、增加抗炎性细胞因子例如IL-10的机制。导管素在炎性肠病中的重要性在该疾病明显加重的导管素敲除小鼠中得到确认。还发现了在人胃癌细胞中的抗癌作用，以及信号转导通路被确定通过骨形态发生蛋白(BMP)通路。
将编码导管素的DNA导入质粒中，该质粒用于使该肽在胃和结肠组织中的表达延长至少7天，从而导致了胃和结肠中的溃疡愈合和抗炎作用。乳酸乳球菌被发现在胃和结肠粘膜和腔中存在并得到确认。因此，将导管素合并入乳酸乳球菌作为单一制剂已经被成功地建立。因为导管素在体内是组成性表达的，以及益生菌在人体中被消耗用于胃肠道病症的营养用途，预期这种表达导管素的益生菌是安全的并且能够口服给药用于胃肠道慢性疾病诸如炎症(包括但不限于结肠炎)和癌症。
我们以前的研究显示，经直肠内给药的导管素通过减少炎性细胞因子(TNF-α和IL-1β)、MMP-9和增加抗炎细胞因子(IL-10)以及粘液产生来减轻由葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠中的炎症反应。它还降低结肠中细菌的过度生长。在导管素敲除的小鼠中，炎症恶化但被编码导管素的质粒阻止。此外，编码导管素的乳酸乳球菌的口服给药产生了对抗结肠炎症的相似保护作用。因为结肠中的炎症与结直肠癌正相关，我们提出，表达导管素的乳酸乳球菌用于治疗炎性肠病和结直肠癌。
导管素作为抗菌肽通过激活BMP信号转导的肿瘤抑制途径在体外降低了人胃癌细胞增殖。编码导管素的乳酸乳球菌降低了小鼠的胃肿瘤生长。所有这些发现都支持将编码导管素的乳酸乳球菌用作治疗胃癌的治疗剂，例如与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染有关的胃癌的治疗剂。
编码导管素的质粒通过增加细胞增殖和血管生成促进大鼠胃部的胃溃疡愈合。在分离的大鼠胃上皮细胞中，该肽通过转化生长因子和表皮生长因子受体激活直接刺激胃上皮细胞增殖。因此表达导管素的乳酸乳球菌可用于胃溃疡愈合。
应该理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于示例目的，据此的各种变型或变化都是本领域技术人员应当想到的，并且都包括在本申请的精神和权限内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式以其整体并入本文用于所有目的。

Claims (31)

1.乳酸菌，其被转化以分泌生物活性导管素。
2.如权利要求1所述的细菌，其中所述乳酸菌选自乳球菌属(Lactococcus sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)和双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)。
3.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌是乳球菌(Lactococcus)。
4.如权利要求1或2所述的细菌，其中所述导管素的表达受诱导型启动子的调控。
5.如权利要求1所述的细菌，其中所述细菌包含所述导管素的核酸编码序列，并且所述编码序列的密码子已被改良用于所述细菌种类。
6.如权利要求1所述的细菌，其中所述导管素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少80％一致。
7.减少哺乳动物胃肠道炎症的方法，所述方法包括给予足以减少所述哺乳动物胃肠道中的炎症的量的权利要求1-6中任一项所述的乳酸菌。
8.如权利要求7所述的方法，其中每天给予所述哺乳动物108至1012CFU的所述细菌。
9.如权利要求7所述的方法，其中每天给予所述哺乳动物大于1010CFU的所述细菌。
10.如权利要求7或8或9所述的方法，其中给予所述细菌至少3天。
11.如权利要求10所述的方法，其中每天给予所述细菌不超过7天。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌在限定性体外培养条件下以至少1pg/天的量分泌导管素。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述乳酸菌选自乳球菌属、乳杆菌属和双歧杆菌属。
14.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物患结肠炎或肠炎性疾病。
15.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物患克罗恩氏病。
16.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物患结直肠癌或胃癌。
17.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物患有选自胃炎、胃溃疡或胃食管反流病(GERD)的疾病状态。
18.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌是乳球菌。
19.如权利要求7或10所述的方法，其中所述导管素的表达受诱导型启动子的调控，以及所述方法还包括给予足量的诱导子以诱导所述启动子在动物肠道内的表达。
20.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌经口给药。
21.如权利要求7所述的方法，其中所述细菌与导管素肽共给药。
22.如权利要求7所述的方法，其中所述导管素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少80％一致。
23.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
24.食品，其包含足以减少哺乳动物胃肠道中的炎症的量的权利要求1-6中任一项所述的乳酸菌。
25.如权利要求24所述的食品，其中所述食品是饮料或半固体产品。
26.如权利要求25所述的食品，其中所述半固体产品是酸乳。
27.如权利要求25所述的食品，其中所述导管素的表达受诱导型启动子的调控，以及所述食品还包含足量的诱导子以诱导所述启动子的表达。
28.分离的核酸，其包含生物活性导管素的核酸编码序列，其中所述编码序列的密码子已被改良用于在乳酸菌中表达。
29.如权利要求28所述的核酸，其还包含与所述编码序列可操作连接的启动子。
30.如权利要求29所述的核酸，其中所述启动子是诱导型启动子。
31.如权利要求28所述的核酸，其中所述编码序列包含至少一个改良的密码子，用于在乳球菌属、乳杆菌属或双歧杆菌属中表达。
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