CN102458460B - 纯化蛋白复合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于从源混合物纯化包括复合于肽或肽片段的应激蛋白的复合物的混合物的改良的方法，所述源混合物通常为细胞裂解物。本发明的方法提供了待利用基于离子交换色谱的方法纯化的蛋白复合物，其中使用了改良的缓冲液，产生比利用常规方法获得的蛋白复合物更具免疫原性的纯化的应激蛋白复合物。纯化的复合物可用来产生在被施用疫苗组合物的受治疗者中引起增强的免疫应答的改良的疫苗制备物。

Description

纯化蛋白复合物的方法

发明领域

本发明涉及纯化蛋白复合物的新颖方法。尤其是，提供了用于纯化包括复合于肽片段的热休克蛋白的蛋白复合物的方法。本发明还延伸到所纯化的蛋白复合物在制备疫苗组合物和使用所述疫苗组合物来预防和治疗传染病和癌症中的用途。

发明背景

接种疫苗被广泛地接受为应对传染病和癌症的全球医疗负担的有利方法。然而，虽然我们对与传染病和癌症有关的分子生物学的认识有显著的进展，但这些领域中的有效疫苗的开发还是有限的。所开发的最有效的疫苗使用活的、减毒的生物，然而，与这种减毒的病原体回复毒力有关的安全风险限制了它们的广泛应用。阻止更有效的疫苗的大规模开发和使用的其它主要阻碍是鉴定将以特定方式引起针对微生物病原体的突变菌株的宽泛的保护性免疫的候选病原体来源的蛋白的有限能力。

一种显示赋予宽泛的、保护性免疫的前景的特定方法是将应激蛋白复合物用作针对传染病和癌症的疫苗(Colaco等人，(2004)Biochem Soc Trans32：626-628和Zeng等人，(2006)Cancer Immunol Immunother 55：329-338)。已广泛记载了热休克蛋白/抗原肽复合物有效作为针对特定的癌症的疫苗(美国专利第5,997,873号；美国专利第5,935,576号，美国专利第5,750,119号，美国专利第5,961,979号和美国专利第5,837,251号)。已显示分离自热休克的BCG细胞的病原体来源的应激蛋白复合物在接种疫苗的宿主中诱导了辅助性T淋巴细胞1(Th1)介导的免疫应答，其在肺结核的小鼠气雾攻击模型中赋予了针对活体攻击(live challenge)的保护性免疫(国际PCT专利申请第WO 01/13944号)。并且，在WO 02/20045、WO 00/10597和WO 01/13943中已显示分离自病原体或病原体感染的细胞的应激蛋白复合物有效作为针对传染病的疫苗中的免疫原性决定物(immunogenicdeterminant)。

热休克蛋白(hsp，HSP)形成广泛遍布植物界和动物界的高度保守的蛋白家族。根据它们的分子量，将主要的热休克蛋白分为6种不同的家族：小型(hsp20-30kDa)；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90和hsp100。虽然热休克蛋白最初鉴定于经受热应激(heat stress)的细胞中，已发现它们与许多其它类型的应激有关，比如感染、渗透压应激、细胞因子应激和类似的应激。因此，根据其表达不仅由热应激所导致，也常将热休克蛋白称作应激蛋白(SP)。hsp60家族的成员包括主要伴侣分子GroEL。这些主要伴侣分子与诸如GroES的辅伴侣分子形成多聚体复合物。许多微生物病原体具有形成不同于GroEL的复合物的另外的hsp60家族，且一些hsp60家族成员可能更具免疫原性，比如分枝杆菌的hsp65。hsp70家族的成员包括DnaK，DnaK可与诸如DnaJ的辅伴侣分子形成多聚体复合物。其它主要hsp包括AAAATP酶、Clp蛋白、触发因子、Hip、HtpG、NAC、Clp、GrpE、SecB和前折叠素(prefoldin)。

应激蛋白普遍表达于原核细胞和真核细胞两者中，其中它们在多肽的折叠和解折叠中作为伴侣分子起作用。应激蛋白的另一个作用是陪伴肽从一个细胞区室到另一个细胞区室，以及，在患病细胞的情况下，已知应激蛋白还陪伴病毒肽或肿瘤相关肽至细胞表面。

应激蛋白的陪伴功能通过在应激蛋白和所陪伴的多肽之间形成复合物来实现。所陪伴的多肽可包括肽片段，且所述复合物的形成受到ATP依赖的核苷酸交换系统的控制，对于细菌Hsp70同系物DnaK已十分清楚地证明了这点(Szabo等人PNAS(1994)卷91.10345-10349)。简言之，在其静息细胞状态中，DnaK与ATP(三磷酸腺苷)结合且对底物具有低亲和力(Palleros等人PNAS(1991)卷88.5719-5723)。ATP水解导致DnaK转化为高亲和力ADP(二磷酸腺苷)状态，导致了DnaK-ADP-底物复合物的形成，其中所述底物通常是多肽或蛋白。ADP解离之后，ATP重新结合DnaK，导致构象改变，触发了正确折叠的底物蛋白从复合物的释放(Palleros等人J Biol Chem(1992)卷267，第8册，5279-5285；Palleros等人Nature(1993)365(6447)：664-6；Szabo等人PNAS(1994)卷91.10345-10349)。已显示导致底物释放的该最终步骤除结合ATP之外还需要钾(K⁺)和镁(Mg²⁺)(Palleros等人Nature(1993)365(6447)：664-6；Palleros等人FEBS Letters(1993)卷336，第1册，124-128)。

异源多肽或多肽片段与应激蛋白复合形成应激蛋白-肽复合物，可将其称作热休克蛋白复合物(HspC)。HspC被抗原呈递细胞(APC)捕获以提供抗原肽的来源，所述抗原肽可被装载到主要组织相容复合物(MHC)分子上以细胞表面呈递给免疫系统的T淋巴细胞。

热休克蛋白/抗原肽片段复合物(HspC)作为癌症疫苗已被广泛研究(参见，例如，美国专利第5,997,873号和美国专利第5,935,576号)且因此已开发了用于从肿瘤细胞中分离用作针对所述肿瘤的有效疫苗的HspC的方法。例如，WO 02/28407公开了基于热休克蛋白对于肝素的结合亲和力用于纯化蛋白复合物的方法。两步方法包括肝素亲和色谱和可选的后续离子交换色谱步骤，以获得应激蛋白复合物制备物。WO 02/34205涉及利用ConA琼脂糖凝胶纯化HSP70应激蛋白复合物。然而这些方法导致了单个热休克蛋白家族的分离，且因此忽略了多伴侣分子蛋白作为疫苗的使用。

HspC作为癌症疫苗的用途可通过使用多伴侣分子蛋白尤其是热休克蛋白(Bleifuss等人2008)来显著地改良，且因此已开发了用于纯化用于疫苗的多伴侣分子蛋白和伴侣分子蛋白复合物的方法。例如，美国专利第6,875,849号公开了使用非液相等电聚焦(FS-IEF)从肿瘤中纯化用作癌症疫苗的HspC。可使用自由流等电聚焦(FF-IEF)从病原体和感染的细胞中分离用作用于预防和治疗传染病的疫苗组合物中的免疫原性决定物的热休克蛋白/肽复合物。然而，该技术的关键限制是与开发大规模FF-IEF设备以产生大量热休克蛋白/肽复合物(HspC)有关的困难，大量热休克蛋白/肽复合物(HspC)是商业大规模的GMP疫苗生产所需要的。并且，使用两性电解质(安福灵(ampholines))来产生FF-IEF过程中需要的pH梯度导致了所得的纯化的含HspC的制备物中除离液剂之外另外污染物的引入。这样的污染物是管理机构不可接受的，为在含HspC的疫苗组合物的生产中使用FF-IEF方法设置了重要的阻碍。有趣地是，这些发明人甚至在使用离液剂时报道了HspC的稳定性，诸如在FF-IEF过程中甚至在处理缓冲液中不存在二价阳离子和ADP时使用尿素和去垢剂(Bleifuss等人2008)。此外，自由流等电聚焦的过程缓慢，典型的运行时间为4小时，在该过程中产生了高水平的蛋白降解，严重限制了纯化的蛋白复合物的大规模生产中FF-IEF的使用。

发明概述

大量实验后，本发明人已鉴定了用于纯化诸如热休克蛋白/肽复合物(HspC)的应激蛋白-肽复合物的改良的方法，所述方法可用来纯化可安全用于疫苗生产的多应激蛋白-肽复合物。该方法以表面电荷而非等电点为基础分离蛋白复合物。尤其是，已鉴定了允许包括复合于肽片段的应激蛋白的蛋白复合物的快速纯化的纯化方法，所述应激蛋白比如热休克蛋白，其中纯化的产物的产量足以允许制备用于制备疫苗组合物的商业上可接受的量的蛋白复合物。有利地，由于纯化过程中没有引入药学上不可接受的或不想要的添加剂或组分，纯化的蛋白复合物可用于制备疫苗制备物。特别地，本发明人已鉴定了对防止应激蛋白复合物的裂解或部分解离的特定缓冲条件的要求。因此，纯化方法有利地降低或改善了当纯化蛋白复合物用于疫苗组合物中以引起针对其的免疫应答时所述纯化蛋白复合物的解离和功能丧失，并同时消除了使用离液剂或其它化学物诸如表面活性剂以提高经历纯化的蛋白复合物的溶解度的需要。最令人惊讶的是，当与针对利用不使用本发明的缓冲条件的标准方法分离的相似复合物引起的免疫相比较时，利用本发明的方法纯化的热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)在接种疫苗的受治疗者中引起了显著增强的免疫。本发明人已进一步鉴定了，当细胞裂解物在含有二磷酸腺苷(ADP)和至少一种二价阳离子的缓冲液中被缓冲时，或在一些实施方案中仅使用至少一种二价阳离子时，可进一步增强本发明的纯化的蛋白复合物用于制备疫苗制备物的效用。并且，利用本发明的改良的方法纯化的热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)与包括至少一种二价阳离子和任选地二磷酸腺苷(ADP)的缓冲液相结合在施用所述复合物的受治疗者中引起了甚至更强的保护性免疫应答。

根据本发明的第一方面，提供了用于从源混合物中纯化在应激蛋白和多肽之间形成的应激蛋白复合物的方法，所述方法包括以下的步骤：

(i)提供包括至少一种靶应激蛋白复合物的源混合物，所述靶应激蛋白复合物包括复合于多肽的应激蛋白，

(ii)确定待从所述源混合物中纯化的至少一种靶应激蛋白复合物的等电点(pI)；

(iii)从包括所鉴定的靶应激蛋白复合物的所述源混合物中制备澄清的细胞裂解物；

(iv)使所述细胞裂解物经受利用离子交换的纯化，其中所述细胞裂解物被包括至少一种二价阳离子的第一缓冲液缓冲至靶应激蛋白复合物的pI的2个单位内的pH，并且其中第二缓冲液提供了用来洗脱包括靶应激蛋白复合物的混合物的盐梯度。

在某些实施方案中，第一缓冲液还包括二磷酸腺苷(ADP)和/或二磷酸腺苷模拟物。在某些另外的实施方案中，至少一种二价阳离子是镁盐，通常是氯化镁(MgCl₂)，或锰盐。在又一些另外的实施方案中，二价阳离子以从约0.1mM至约100mM的浓度被提供。在一个实施方案中，缓冲液仅包括作为二价阳离子的镁盐，通常为氯化镁(MgCl₂)。在某些实施方案中，二磷酸腺苷以从约0.1mM至约100mM的浓度被提供。

在某些实施方案中，第一缓冲液包括浓度为至少1mM的氯化镁(MgCl₂)和浓度为至少1mM的二磷酸腺苷(ADP)。在某些实施方案中，缓冲液还包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，其可以约50mM的浓度而存在。所述缓冲液可具有约pH6.8的pH。

在某些另外的实施方案中，第一缓冲液包括至少一种二价阳离子，但缺少二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶和/或、钾或钾盐中的至少一种。在一个实施方案中，缓冲液仅包括作为二价阳离子的镁盐，通常为氯化镁(MgCl₂)。

在某些另外的实施方案中，第一缓冲液缺少以下中的至少一种：离液剂、表面活性剂和/或两性电解质。离液剂(chaotrope)(也称作离液剂(chaotropic agent)或离液试剂)包括尿素、盐酸胍和高氯酸锂。已知离液剂用作蛋白变性剂，导致蛋白展开和最终的三维结构的改变。两性电解质是含有酸性基团和碱性基团两者的分子。它们在某些pH范围中主要作为两性离子(具有零静电荷的化合物)存在。表面活性剂可包括阴离子表面活性剂，比如SDS，阳离子表面活性剂，比如CTAC、HTAB和DTAB，非离子表面活性剂，比如Tween 20，和两性离子表面活性剂，比如DAPS。在某些实施方案中，第一缓冲液还缺少以下中的至少一种：三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾，或钾盐。

在某些实施方案中，被洗脱的靶应激蛋白复合物的混合物在制备物中提供，所述制备物包括不同热休克蛋白种类的多个应激蛋白。

因此，本发明的方法有利地提供了纯化的应激蛋白复合物的混合物，其中该应激蛋白的混合物包括不同的应激蛋白复合物。即，应激蛋白复合物的应激蛋白组分是来源于多个(即，一个以上)热休克蛋白种类或家族的混合物，例如，可以是来源于HSP60种类、HSP70种类和/或HSP90种类、或来自存在于真核细胞或病原细胞中的任何其他热休克蛋白种类的热休克蛋白的混合物。特别地，存在于病原细胞或感染病原体的细胞的细胞裂解物中的任何应激蛋白复合物可通过本发明的方法来纯化，并因此存在于最终的纯化产物中。该不同的热休克蛋白的混合物是重要的，因为随后作为疫苗组合物中的免疫原性决定物的纯化的复合物的施用导致由被免疫的宿主针对所述疫苗组合物而引起的增强的免疫应答。该增强的免疫应答赋予针对受治疗者被免疫接种的病原体的提高的长期保护性免疫。

因此，在某些方面，本发明延伸到从获自病原细胞、感染病原体的细胞或肿瘤细胞的细胞裂解物中纯化和/或分离多应激蛋白复合物的方法。通常，应激蛋白复合物包括不同应激蛋白种类的应激蛋白。所述纯化的和/或分离的应激蛋白复合物，或包括其的制备物或混合物则可常被用作疫苗组合物中的免疫原性决定物以引起针对所述裂解物来源的病原体或肿瘤细胞、或针对感染所述裂解物来源的细胞的病原体的免疫应答和相关保护性免疫。因此，所述方法将包括以下的步骤：

(i)从包括所鉴定的靶应激蛋白复合物的源混合物中提供澄清的细胞裂解物；

(ii)使所述细胞裂解物经受利用离子交换的纯化，其中所述细胞裂解物用包括至少一种二价阳离子的缓冲液缓冲至所述靶应激蛋白复合物的pI的2个单位内的pH，并且其中使用盐梯度来洗脱靶应激蛋白复合物，知

(iii)获得包括多应激蛋白复合物的富集的制备物。

在某些实施方案中，纯化和/或分离多应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物包括来源于不同应激蛋白家族的应激蛋白，因此纯化的产物含有应激蛋白复合物的混合物，其中所述应激蛋白可来源于不同的应激蛋白家族，例如，纯化的混合物可包括与肽形成复合物的多个不同的热休克蛋白类型。

在某些另外的方面，本发明延伸到纯化的级分或混合物作为疫苗组合物中的免疫原性决定物来制备疫苗组合物的用途，所述纯化的级分或混合物从纯化方法中获得，所述纯化方法通常为离子交换纯化，尤其是根据本发明的方法进行的离子交换色谱，或所述纯化方法使用根据本发明的缓冲液。

缓冲液

在某些另外的方面，本发明延伸到用于进行蛋白纯化方法的缓冲液，所述蛋白纯化方法尤其是离子交换，比如离子交换色谱，其中所述纯化方法基于对来源于细胞或细胞培养物的蛋白混合物的纯化、分离(isolation)和/或分离(separation)以分离和/或纯化来自其的多应激蛋白复合物，其中所述缓冲液包括至少一种二价阳离子。在某些实施方案中，至少一种二价阳离子是镁盐，通常是氯化镁。本文公开了另外适宜的二价阳离子。在某些实施方案中，缓冲液还包括二磷酸腺苷(ADP)。在某些实施方案中，缓冲液缺少以下中的至少一种或全部：三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾、或钾盐、离液剂、两性电解质和表面活性剂。

疫苗组合物

在不同的另外的方面，本发明延伸到疫苗组合物，或延伸到介导或引起免疫应答的组合物，其包括通过本发明的方法获得的纯化的HspC富集的裂解物或纯化的和/或分离的多应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物。通常将所述疫苗组合物施用给哺乳动物，尤其是人类，以赋予针对病原体的保护性免疫。然而，由于公知的来自不同物种的应激蛋白之间的高水平的同源性，疫苗组合物可用来接种多种动物。

因此，本发明的另一方面提供了疫苗组合物，所述疫苗组合物包括作为免疫原性决定物的通过本发明获得的纯化的HspC富集的洗脱级分或裂解物。在一个优选的实施方案中，本发明提供了疫苗组合物，其包括通过本发明的纯化方法获得的纯化的应激蛋白-多肽复合物(HspC)富集的洗脱级分或裂解物，其中所述裂解物在包括至少一种二价阳离子的缓冲液中被缓冲。该缓冲液还可包括二磷酸腺苷。在某些实施方案中，缓冲液缺少ATP和/或钾。

又一个另外的方面提供了用于在受治疗者中引起免疫应答的疫苗组合物，其中所述免疫原性决定物是利用本发明的纯化方法获得的纯化的和/或分离的多应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物。特别地，本发明的纯化方法包括等电色谱，其使用了本文所描述的缓冲液以提高从源蛋白混合物中纯化的应激蛋白复合物的稳定性并因此提高其免疫原性。

在某些实施方案中，纯化的多应激蛋白复合物可以是分离的，从而疫苗复合物包括作为免疫原性决定物的纯化的和分离的复合物作为疫苗组合物的免疫原性决定物。

在某些另外的方面本发明提供了根据本发明的疫苗组合物或利用本发明的方法获得的应激蛋白/肽复合物的纯化的和/或分离的混合物用于药物的用途。

在某些另外的方面，本发明提供了纯化的应激蛋白-肽复合物的混合物、或包括其的制备物在制备用于治疗传染病或癌性病症或恶性病症的药物中的用途。

在某些另外的方面，本发明提供了用于用来治疗或预防传染病或癌性病症或恶性病症的疫苗组合物的通过本发明的第一方面的方法纯化的多应激蛋白-肽复合物或包括其的制备物或混合物。

在某些实施方案中，纯化的和分离的应激蛋白复合物或含有其的疫苗组合物作为预防性疫苗来施用。在某些另外的实施方案中，纯化的应激蛋白复合物、包括其的制备物，或含有其的疫苗组合物作为治疗性疫苗来施用。

在不同的另外的方面，本发明延伸到纯化的和分离的应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物、或含有其的疫苗组合物作为加强疫苗以在宿主中增强针对病原体或癌性抗原产生的免疫应答的用途，先前已通过感染或由于初始疫苗的先前施用而使受治疗者暴露于所述病原体或癌性抗原。

本发明的组合物可以是冻干的形式或水性的形式，即，溶液或悬浮液。该类型的液体制剂允许直接从其包装形式中施用所述组合物，而不需要在水性介质中重新构成，且因此对于注射是理想的。组合物可存在于药瓶中，或它们可提供于即用的已填充的注射器中。注射器可以与针头一起提供或不与针头一起提供。注射器将包括单次剂量的组合物，而药瓶可包括单次剂量或多次剂量(例如，2剂量)。

在某些实施方案中，配制根据本发明的疫苗组合物以用于在体内施用给受治疗者，从而其对于可接受的百分比的人类受治疗者赋予了优于每种抗原组分的血清保护标准的抗体滴度。这是评估疫苗在群体中的效力的重要检验。抗原以及高于其时认为宿主针对抗原进行血清转变的相关抗体滴度是熟知的，且所述滴度由诸如WHO的机构所公布。在一个实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的80％以上是血清转变的，在另一个实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的90％以上是血清转变的，在又一个实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的93％以上是血清转变的，在又一个另外的实施方案中，具有统计学意义的受治疗者的样品的96％-100％是血清转变的。选择每个疫苗剂量中的抗原的量为诱导免疫保护应答而在典型的疫苗中无显著的、严重的副作用的量。所述量将根据所用的特定的免疫原而不同。在某些实施方案中，疫苗组合物还可引起Th1淋巴细胞介导的免疫应答。当针对胞内病原体保护受治疗者时所述免疫应答是需要的。在某些实施方案中，包括本发明的纯化的应激蛋白复合物的疫苗组合物在宿主中引起免疫应答，所述免疫应答包括细胞介导的免疫应答和体液(抗体介导的)免疫应答。

在不同的另外的方面，本发明提供了产生疫苗组合物的方法，所述方法包括将本发明的纯化的应激蛋白复合物或包括其的制备物或混合物与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂相混合的步骤。在本发明的一个实施方案中，提供了用于用来治疗或预防病原性疾病的药物的疫苗组合物，所述病原性疾病比如通过病原细菌的感染导致的，所述病原细菌选自包括但不限于以下的组：百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、流感嗜血杆菌b(Haemophilus influenzae b)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于用来治疗或预防病原性疾病的药物的疫苗组合物，所述病原性疾病比如通过致病病毒或致癌病毒的感染所导致的，所述致病病毒或致癌病毒选自包括但不限于以下的组：流感病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、HIV、HPV、RSV、多瘤病毒、CMV、EBV、轮状病毒、诺如病毒(Norovirus)和SARS病毒。在本发明的又一个实施方案中，提供了用于用来治疗或预防癌症和肿瘤性疾病的药物的疫苗组合物。

此外，还提供了针对由百日咳博德特氏菌、破伤风梭状芽孢杆菌、艰难梭菌、白喉棒状杆菌、流感嗜血杆菌b型、结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌和病原性病毒和致癌性病毒导致的疾病免疫接种受治疗者(通常是人类)的方法，所述方法包括向宿主施用免疫保护剂量的本发明的疫苗。

每个疫苗剂量中抗原(即，免疫原性决定物)的量被选择为在接种疫苗的受治疗者中引起免疫保护应答而无显著有害副作用的量。抗原的量根据所用的特异性抗原和其如何呈现而不同，然而，应理解针对本发明的纯化的复合物介导的增强的免疫应答将意味着，当与包括利用本领域中已知的纯化方法获得的相似的量的蛋白复合物的疫苗组合物相比时，将针对利用本发明方法纯化的某一量的复合物介导增强的免疫应答。

本发明还提供了纯化的HspC富集的裂解物，或来自其的分离的应激蛋白在接种受治疗者以引起针对病原体来源的传染病或癌症症状或恶性病症免疫的方法中的用途。

因此本发明的另一方面提供了针对病原体来源的传染病或癌性病症接种受治疗者的方法，所述方法包括以下步骤：

-提供疫苗组合物，所述疫苗组合物包括作为免疫原性决定物的根据本发明的方法获得的纯化的应激蛋白复合物富集的制备物，所述纯化的应激蛋白富集的制备物来源于癌细胞、病原体、或感染针对其需要进行保护性免疫的病原体的细胞，并且包括作为纯化的制备物中的混合物的不同的应激蛋白类型，和

-以足以在受治疗者中引起针对所述应激蛋白复合物富集的制备物的免疫应答的治疗有效量或预防有效量向受治疗者施用包括应激蛋白复合物富集的制备物的疫苗组合物。

如本文所用的，术语“疫苗组合物”意为含有免疫原性决定物的任何组合物，所述免疫原性决定物以能够更好地响应于随后的攻击、病原性感染或肿瘤生成的方式刺激免疫系统。将理解地是，疫苗通常含有免疫原性决定物和任选地含有佐剂，佐剂非特异性地起作用来增强对于免疫原性决定物的免疫应答。

在一些实施方案中，受治疗者是动物，通常是人。本发明的方法还可用来纯化用于用来治疗其他动物诸如马、牛、山羊、绵羊、猪和鸟的疫苗组合物的应激蛋白复合物。

在某些实施方案中，本发明的纯化的应激蛋白复合物(HspC富集的制备物)来源的微生物病原体可根据其导致疾病或感染而选择。本发明提供的疫苗组合物可预防性地或治疗性地来使用。然而，本发明人认识到因为其生产的经济性和其引起针对肽、或肽和应激蛋白来源的病原体的保护性免疫应答的能力，组合物可特别用作预防性疫苗。

本发明人已进一步地令人惊讶地鉴定了利用本发明的方法获得的应激蛋白-肽复合物可作为“加强”接种疫苗，所述加强接种疫苗在受治疗者中增强针对病原体或癌性病症提供的免疫，其中，通过利用活疫苗或减毒疫苗进行接种或通过其中免疫原性决定物为应激蛋白-肽复合物的疫苗组合物进行接种来赋予初始免疫。

因此，本发明的又一方面提供了加强在受治疗者中针对病原体来源的传染病或癌性病症的保护性免疫应答的方法，其中所述保护性免疫应答已通过先前施用活疫苗或减毒疫苗、或先前施用包括来源于针对其需要进行免疫的病原体的肽的应激蛋白-肽复合物来引起，所述方法包括以下步骤：

-提供包括根据本发明的方法获得的应激蛋白/肽复合物富集的制备物的组合物，所述纯化的应激蛋白/肽复合物富集的制备物来源于癌细胞、病原体感染的细胞或针对其需要进行保护性免疫的病原体，且包括作为纯化的制备物中的混合物的不同的应激蛋白类型，和

以足以在受治疗者引起针对应激蛋白/肽复合物富集的制备物的免疫应答的量向受治疗者施用包括应激蛋白/肽复合物富集的制备物的组合物。

在某些另外的实施方案中，含有应激蛋白/肽复合物的本发明的疫苗可用来在先前利用其他亚单位疫苗、多重亚单位(multi-subunit)疫苗、碳水化合物疫苗或轭合物疫苗被免疫的动物中加强免疫应答。在另一个实施方案中，本发明的应激蛋白/肽复合物疫苗可用来在先前已经利用核酸或活疫苗免疫的动物中加强针对靶抗原的免疫应答。在又一个实施方案中，含有应激蛋白/肽复合物的本发明的疫苗组合物提供在先前针对病原特异性抗原或癌症特异性抗原被免疫的受治疗者中介导的免疫应答的加强。

在某些另外的方面中，本发明延伸到用于在动物中加强免疫应答的包括通过本发明纯化的应激蛋白/肽复合物的疫苗组合物，其中所述动物先前已利用包括至少一种病原体来源的抗原、病原体，尤其是减毒病原体，或癌症特异性抗原的疫苗组合物来接种。通常，肽组分来源于相同的病原体或癌细胞，因此其提供了用于起始接种的免疫原性决定物。

在某些另外的方面中，本发明延伸到用于在动物中加强免疫应答的包括通过本发明纯化的应激蛋白/肽复合物的疫苗组合物，其中所述动物先前已暴露于存在于应激蛋白复合物中的病原体或癌症表达抗原。

在某些另外的实施方案中，本发明提供了用于制备诸如树突状细胞(DC)的细胞疫苗的组合物，所述树突状细胞已利用本发明的纯化的应激蛋白/肽复合物富集的制备物来脉冲。向受治疗者施用经脉冲的树突状细胞将导致针对应激蛋白/抗原细胞复合物的T细胞介导的反应。当治疗患有癌性病症或恶性病症的受治疗者时，所述治疗可以是特别有效的。在所述实施方案中，通常，所述应激蛋白/肽复合物来源于癌细胞。

在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物可用用于诱导免疫应答的组合物来替代，或被引起免疫应答的组合物替代，所述组合物通常包括与本文所描述的疫苗组合物中提供的那些免疫原性决定物相同的免疫原性决定物。

附图说明

图1显示了来自BCG细菌细胞裂解物的蛋白复合物的纯化的SDS-PAGE分析(A)和通过蛋白质印迹对这些样品的Hsp71蛋白和Hsp65蛋白的分析(B)。V1是来自BCG的亲代高速离心裂解物，其被进一步处理而产生V2——利用常规等电聚焦方法纯化的HspC，和V3——利用本发明的第一方法纯化的HEP。

图2显示了与亲代裂解物(LSS)和利用常规等电聚焦方法分离的HspC(IEF)相比较，利用本发明的第一方法分离自BCG的HEP(IEX)的免疫原性。

图3显示了通过逐步盐梯度来洗脱的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的蛋白复合物的纯化的SDS-PAGE分析(A)，和通过蛋白质印迹对这些样品的Hsp70蛋白、Hsp65蛋白和PorA蛋白的分析(B)。

图4显示了与利用常规等电聚焦方法从脑膜炎奈瑟氏球菌分离的HEP(IEF HspC)相比较，利用本发明的基于等电色谱的纯化方法分离自脑膜炎奈瑟氏球菌的HEP(IECHspC)的免疫原性。虽然两种HspC显示了比目前的外膜运载体疫苗(H44/76OMV)更好的针对异源菌株的调理活性，IEC HspC显示了比IEF HspC更好的跨菌株免疫原性。

图5A显示了在ADP+二价阳离子存在下从BCG细菌细胞裂解物纯化的HEP的蛋白质印迹分析。泳道1显示了考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE，而泳道2至4分别显示了通过蛋白质印迹对Hsp65、Hsp71和Ag85的识别。图5B显示了在二价阳离子(BCG 001/09)，加ADP(HspCVac)或ATP(BCG 002/09)存在下从BCG细菌细胞裂解物纯化的HEP的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。

图6显示了分离自BCG的HEP的免疫原性。图6A显示了在不存在ADP+二价阳离子(IEC(2疫苗接种))或存在ADP+二价阳离子(IEC(2疫苗接种)+ADP/Mg2+)时，由分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP疫苗诱导的细胞介导的免疫，与利用活BCG(BCG 8周)的接种与利用BCG初始免疫和HspC加强(BCG/IEC)的接种相比较。图6B显示了在ADP和二价阳离子(V1)存在下或ATP和二价阳离子(V2)存在下或单独的二价阳离子(V3)存在下，由分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP疫苗诱导的Th1偏向的体液免疫，和对于通过利用HspC疫苗加强的(BCG和V1)目前的活BCG疫苗(BCG)的抗体响应的显著增强。

图7A显示了在利用活TB攻击的HEP免疫的动物中肺部菌落计数的减少。利用作为阴性对照的盐水、活BCG细菌(BCG)、在不存在ADP+二价阳离子(IEC)或存在ADP+二价阳离子(IEC)时分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP对动物进行免疫，或利用活BGC进行初始免疫并利用通过本发明的改良的方法分离的HEP进行加强免疫(BCG+IEC)。图7B显示了在利用HEP免疫或加强并利用活TB攻击的动物中肺部菌落计数的减少。用作为阴性对照的盐水、活BCG疫苗(BCG)、在存在ADP加二价阳离子(V1)或单独的二价阳离子(V3)或二价阳离子加ATP以破坏HspC复合物(V2)时分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP来免疫动物，或用BCG进行起始免疫并用HEP疫苗进行加强免疫(BCG+V1)。

图8显示了不存在ADP和二价阳离子(泳道1至3)时和存在ADP和二价阳离子(泳道4至6)时，对从脑膜炎奈瑟氏球菌中纯化的HEP中的Hsp60和Hsp70的考马斯蓝染色的SDS-PAGE(泳道1，4)和蛋白质印迹分析。

图9显示了通过逐步盐梯度洗脱对来自CHO细胞的HEP的纯化的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析(A)，和通过蛋白质印迹对这些样品的Hsp70的分析(B)和Hsp60的分析(C)。泳道1：分子量标记物，泳道2：流经，泳道3：洗涤，泳道4：150mM洗脱，泳道5：150mM洗脱，泳道6：250mM洗脱，泳道7：250mM洗脱，泳道8：350mM洗脱，泳道9：350mM，泳道10：500mM洗脱，泳道11：500mM洗脱，泳道12：1M洗脱。

发明详述

本发明提供了用于纯化包括复合于来自通常为细胞裂解物的源混合物的肽或肽片段的应激蛋白的复合物的混合物的方法。本发明的改良的方法提供了利用基于离子交换的方法纯化的蛋白复合物，而在纯化方法中不需要利用诸如离液剂、表面活性剂和两性电解质(安福灵)的化学物质。所述方法是有利的，因为药物制备物中外来成分的存在一般是不希望的，因为其导致应激蛋白/肽复合物的不稳定性和解离，这可导致应激蛋白复合物具有较低的免疫原性。因此，利用本发明的方法获得的纯化的复合物可用来产生改良的疫苗制备物，其在施用所述疫苗组合物的受治疗者中引起增强的免疫应答。并且，已知ATP导致应激蛋白/肽复合物的解离。然而，在不存在ATP时，一般认为HspC是非常稳定的，即使在其纯化时使用了诸如去垢剂和7M尿素的离液剂。本发明人已令人惊讶地鉴定了在纯化过程中对于应激蛋白复合物的稳定性的需要，以产生比利用诸如传统等电聚焦(IEF)的纯化方法获得的相似的复合物更具免疫原性的HspC。本发明人已提供了改良的离子交换色谱方法，其不仅由于缓冲液中存在至少一种二价阳离子，比如镁盐而防止了应激蛋白复合物的解离，而且还任选地存在以使应激蛋白复合物的解离最小化的浓度存在于缓冲液中的腺苷二磷酸。稳定的应激蛋白复合物的存在，以及不同类型的应激蛋白的混合物的提供，提供了可在疫苗组合物中用作免疫原性决定物且将引起增强的免疫应答的混合物，所述增强的免疫应答超过利用本领域中已知的方法纯化的应激蛋白复合物引起的免疫应答。

本发明的方法还有利地在于，其提供了比先前所用的诸如等电聚焦的蛋白纯化技术具有更高容量的纯化方法，以用于纯化应激蛋白复合物，从而可实现大规模的、商业上可行的、成本有效的含有所述复合物的疫苗的产生。

并且，本发明人已令人惊讶地鉴定了利用本发明的方法纯化的应激蛋白复合物比利用诸如传统等电聚焦(IEF)的纯化技术获得的相似复合物更具免疫原性。本发明的改良的方法提供了待利用产生显示增强的免疫的HEP的特定缓冲液组成和条件纯化的蛋白复合物。因此，通过本发明的方法获得的HspC复合物比利用本领域中已知的标准纯化方法纯化的那些更具免疫原性，并可用来产生改良的疫苗制备物。

源混合物

本发明的应激蛋白通常从源混合物中纯化或分离。在某些实施方案中，源混合物是包括至少一种应激蛋白/肽片段复合物(需要对其进行纯化)和一种或多种污染物的混合物。存在于源混合物中的污染物的非限制性例子可包括：除应激蛋白或应激蛋白复合物之外的宿主细胞蛋白、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成型蛋白、核酸、内毒素、化学产物相关的污染物、脂质、培养基添加剂和培养基衍生物。

在某些实施方案中，源混合物是蛋白混合物，或来源于细胞裂解物或细胞匀浆物。在某些实施方案中，细胞裂解物或匀浆物来源于原核细胞、通常为病原性原核细胞，其中所述原核细胞可能是胞内病原性细菌或胞外病原性细菌。在某些另外的实施方案中，细胞裂解物可来源于感染原核细胞的细胞。在另外的实施方案中，细胞裂解物或匀浆物来源于真核细胞，比如感染病原体的真核细胞，所述病原体比如原核病原体。在某些实施方案中，细胞裂解物或匀浆物来源于肿瘤细胞、癌细胞团或组织，或来源于活检的细胞。在某些实施方案中，细胞为来源于细胞培养的细胞，其中细胞被转化或被转染。在某些另外的实施方案中，细胞裂解物或匀浆物可从宿主细胞或病原性生物中直接获得，或从感染病原性生物的细胞中直接获得。病原性生物可选自由以下组成的但不限于以下的组：(i)病毒，例如，流感病毒、乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒(甲型、乙型或丙型)、HIV、麻疹病毒和类似的病毒，(ii)胞内原生动物，比如锥虫；或(iii)感染原核生物的细胞，所述原核生物尤其是胞内细菌，比如分枝杆菌属物种或奈瑟氏球菌属物种的细菌。可利用本发明的方法纯化的源混合物的另外的例子包括，收获的细胞培养液体、细胞培养上清液和条件细胞培养上清液。并且，细胞裂解物可来源于肿瘤细胞。

在其中源混合物来源于细胞裂解物或包括细胞裂解物的实施方案中，裂解物可通过本领域中的技术人员已知的任何适宜的方式来获得，包括但不限于：(i)机械方式，比如超声处理、空化作用(cavitation)、冻融循环，和使用细胞匀浆器诸如弗氏细胞压碎器(French press)、Dounce匀浆器或马达驱动的玻璃/TEFLON匀浆器；(ii)利用去垢剂进行细胞裂解；或(iii)通过按需要将细胞与低渗缓冲液或高渗缓冲液相接触而进行渗透性裂解。在中使用细胞裂解来产生源混合物的某些实施方案中，还可将蛋白酶抑制物添加到源混合物中。

在某些实施方案中，其中源混合物来源于匀浆的细胞制备物，比如细胞裂解物或组织样品，可将匀浆物离心至少一次，例如，在10,000g下离心30分钟。然后可收集上清液并对其进行进一步离心，或准备利用本文所描述的基于离子交换的方法对其进行纯化。在某些另外的实施方案中，离心步骤可用过滤步骤来替换或完成。

在某些实施方案中，源混合物是蛋白的蛋白混合物，通常为包括多种蛋白的溶液。在某些另外的实施方案中，源混合物是来源于癌细胞、病原性生物、感染病原性生物的细胞、或包括病原性生物的细胞培养物或感染其的细胞的细胞裂解物。

在某些实施方案中，本发明的方法可用来从天然来源或生物合成来源提取、纯化和/或获得蛋白复合物。在某些另外的实施方案中，可使用该方法来从细胞培养或其它蛋白混合物中纯化合成的应激蛋白复合物或重组的应激蛋白复合物。

在某些实施方案中，纯化的复合物存在于至少一种级分中，比如洗脱级分。通常，所述至少一种级分包括一种或多种应激蛋白/肽复合物。所述级分可称作纯化的产物或纯化产物，且还可称作热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)。

不希望受理论束缚地，本发明人已鉴定，在施用疫苗组合物的受治疗者中可引起增强的免疫应答，所述疫苗组合物包括作为免疫原性决定物的应激蛋白/抗原肽片段复合物，所述应激蛋白/抗原肽片段复合物来源于癌细胞、病原性细胞、感染病原性生物的细胞、或经遗传修饰而表达来源于癌细胞或在宿主中导致传染病的病原体的异源蛋白的原核细胞或真核细胞，其中所述异源蛋白导致当向受治疗者施用时导致待针对其的免疫应答。因此，在某些实施方案中，纯化的产物通常包括抗原肽/热休克蛋白复合物的混合物。

应激蛋白

在某些实施方案中，应激蛋白复合物可以是包括复合于肽片段的热休克蛋白的热休克蛋白复合物(HspC)。

在某些实施方案中，热休克蛋白可以是来源于待纯化的细胞裂解物的任何适宜的热休克蛋白。在某些实施方案中，热休克蛋白可选自包括但不限于以下的组的种类中的任何一种：hsp20-30kD；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90和hsp100。在某些另外的实施方案中，应激蛋白可以是分类为伴侣蛋白的蛋白。所述蛋白可包括但不限于选自由以下组成的组的蛋白：DnaK、DnaJ、GroEL、GroES、hspX、acr2、AAA+、clpA/B、HtpG、TRIC、CCT、IbpA、IbpB、钙网织蛋白、hsp40、hsp70、hsp72、hsp90、grp94、grp75、BiP/grp78、grp75/mt、gp96和小型hsp。

在某些实施方案中，靶应激蛋白复合物包括来源于宿主细胞的热休克蛋白/抗原肽片段复合物，所述宿主细胞经遗传修饰以组成型地表达应激蛋白基因，和/或表达异源蛋白，比如抗原肽或肽片段。在某些另外的实施方案中，细胞可以是表达异源基因的宿主细胞，例如感染包括感兴趣的抗原基因的杆状病毒载体构建物的昆虫细胞。在另一些实施方案中，细胞可以是来源于人类或动物受治疗者的癌细胞。

在某些实施方案中，其中提供了复合物的混合物，这可包括一个特定家族的热休克蛋白，例如，hsp70家族或hsp60家族，尽管优选地是，混合物包括来源于不同家族的不同热休克蛋白复合物。本发明的方法将提供用于纯化包括复合于(抗原)肽片段的热休克蛋白的所有复合物的方法，而与抗原肽或肽片段的身份、分子量或大小无关。

在某些另外的实施方案中，热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)包括来自不同应激蛋白家族或种类的热休克蛋白，比如hsp60、hsp65、hsp70和hsp90，所述家族利用本发明的方法作为混合物被共纯化。

在某些另外的实施方案中，热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)可以是特定分子量的热休克蛋白/肽片段复合物。在某些实施方案中，应激蛋白复合物具有在50KDa至900KDa范围内的分子量。

抗原肽片段

在某些实施方案中，与应激蛋白结合以形成应激蛋白复合物(HspC)的多肽是肽片段，即，肽片段是较大的多肽或蛋白的片段。通常，肽是抗原性肽，即，在施用所述肽的宿主细胞中介导针对多肽的促炎反应。肽或抗原肽将适宜于在施用应激蛋白复合物的宿主中产生针对其的T细胞介导的(细胞介导的)免疫应答或抗体介导(体液)的免疫应答。通常，多肽来源于病原体，或感染需要针对其进行免疫应答的病原性细胞的细胞。在某些另外的实施方案中，多肽来源于恶性细胞或癌细胞，或含有其的细胞裂解物，其中多肽或肽片段是肿瘤特异性抗原。

在某些实施方案中，肽以非共价的方式复合于应激蛋白。在某些另外的实施方案中，通过共价键的方式将肽复合于应激蛋白。

在某些实施方案中，肽片段是来源于病原性生物的抗原性肽片段，其中所述病原性生物通常在宿主中导致传染病。在某些实施方案中，病原性细胞可以是原核细胞，比如革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌或胞内细菌病原体或胞外细菌病原体。在某些另外的实施方案中，病原体是病毒病原体，或来源于其的肽片段。在某些另外的实施方案中，病原体可以是原生动物，寄生虫或真菌，比如酵母。

在某些实施方案中，抗原性肽来源的病原性细胞可来源于原核生物，所述原核生物选自由以下组成但不限于以下的组：埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特氏菌属(Bordetella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、嗜血菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomycetes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Fancisella)、巴斯德杆菌属(Pasturella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链杆菌属(Streptobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、螺菌属(Spirillum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和枝原体属(Mycoplasma)的成员。

在某些实施方案中，抗原肽片段可以是病毒肽。肽可能来源的病毒可以选自由以下组成但不限于的组：人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、任何其他肝炎相关病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、尤其是高风险的原癌人类乳头瘤病毒类型、Kaposi氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)(还称作人类疱疹病毒-8(HHV-8))，单纯疱疹病毒(HSV)(任何亚型)、呼吸道合胞病毒(RSV)和相关的呼吸道病毒，流感病毒包括禽流感病毒和猪流感病毒，尤其是如果当这些可传染至人类时，冠状病毒包括SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、鼻病毒、腺病毒、SIV、轮状病毒、人乳头瘤病毒、虫媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、汉坦病毒和任何新兴病毒(emergent virus)，尤其是依波拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)，圣路易斯脑炎病毒(St Louis Encephalitis virus，SLEV)、裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus，RVFV)和布尼亚病毒科的其他成员。

在某些实施方案中，其中抗原肽片段来源于原生动物病原体，原生动物通常可以为胞内原生动物，比如利什曼虫或锥虫。

在其中抗原肽片段来源于酵母或真菌的实施方案中，所述真菌可来源于选自包括以下的组的属：枝顶孢属(Acremonium)、链格孢属(Alternaria)、淀粉霉属(Amylomyces)、Arthoderma、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、芽生裂殖菌属(Blastochizomyces)、葡萄孢属(Botrytis)、假丝酵母属(Candida)、枝孢属(Cladosporium)、隐球菌属(Crytococcus)、网柄菌属(Dictyostelium)、金孢子菌属(Emmonsia)、镰孢菌属(Fusarium)、地丝菌属(Geomyces)、地霉属(Geotrichum)、微孢子属(Microsporum)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、倚囊霉属(Pilaira)、马拉色菌属(Pityrosporum)、根霉属(Rhizopus)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、葡萄穗霉属(Stachybotrys)、毛藓菌属(Trichophyton)、丝孢酵母属(Trichoporon)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。

在某些实施方案中，抗原肽片段可来源于肿瘤细胞。在这样的实施方案中，通常抗原肽片段是肿瘤特异性抗原或肿瘤特异性抗原的片段。在某些实施方案中，肿瘤细胞可来源于癌性病症或恶性病症，所述癌性病症或恶性病症选自包括但不限于以下的组：急性和慢性骨髓性白血病(AML，CML)、滤泡性非霍奇金淋巴瘤、恶性黑素瘤、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、伴有类癌瘤综合征的类癌瘤和肝转移和淋巴结转移、AIDS相关Kaposi氏肉瘤、肾细胞癌、大肠腺癌、头颈鳞状细胞癌。并且，本领域中的技术人员熟知的是，一些传染病可在其感染的受治疗者中导致癌症。因此，根据本发明的方法纯化的复合物的施用可用来治疗或预防癌症，所述复合物中的多肽来源于传染病。例如，包括来源于人类乳头瘤病毒的多肽的复合物可用来在适宜的受治疗者中治疗或预防子宫颈癌。

在某些另外的实施方案中，复合于应激蛋白的抗原肽片段是通过重组方法在宿主细胞中表达的异源蛋白或肽片段，所述重组方法例如通过导入到载体或相似构建体的宿主细胞。在某些实施方案中，异源抗原可来源于细菌病原体、病毒病原体，或是肿瘤特异性抗原。

在某些另外的实施方案中，宿主细胞可以是被胞内病原体感染的真核细胞。在这样的实施方案中，应激蛋白复合物可包括来源于宿主细胞的热休克蛋白，其复合于来源于胞内病原体的抗原肽片段，或包括二者均来源于胞内病原体的应激蛋白和肽片段。

在本发明的某些实施方案中，源混合物是细胞裂解物，其产生自暴露于诱导适宜于导致应激蛋白(通常是热休克蛋白)的诱导型表达(与组成型表达相对)的刺激的应激下的细胞群体。在某些实施方案中，诱导刺激的应激选自包括但不限于以下的组：热休克、渗透压休克、压力和营养匮乏。在某些另外的实施方案中，应激诱导通过对细胞进行遗传修饰以导致热休克蛋白基因的组成型表达来实现。在一个这样的实施方案中，遗传修饰是在微生物病原体中阻抑应激蛋白表达的抑制基因的失活，所述抑制基因例如hspR和HrcA抑制基因。其它这样的遗传修饰描述于WO2002/020045和其中的参考文献中。

对于应激蛋白的非遗传诱导，诱导应激蛋白的最佳条件可易于通过简单试验来确定，且关于利用常规技术的应激蛋白生成水平来评价应激刺激改变的作用的误差，所述常规技术比如Current Protocols in Immunology(最新免疫学实验方案)，WileyInterscience，1997中描述的那些。其他这样的条件描述于WO 2001/013944和其中的参考文献中。

在一个实施方案中，利用本发明的方法纯化的至少一种热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)包括热休克蛋白/抗原肽片段复合物(HspC)，其包括但不限于hspC65、hspC70、hspC90和hspCl00。

离子交换条件

本发明的方法基于利用基于离子交换色谱的方法分离蛋白。然而，本文描述的方法已通过去除通常存在于缓冲液中的可能对蛋白结构和完整性具有不利影响、可导致蛋白复合物的解离或部分解离，或可导致纯化的级分中存在污染物的化学物而改良，超越了本领域中目前所用的标准离子交换色谱方案和方法。因此该方法使用了修改的离子交换方法以产生包括应激蛋白复合物的富集的制备物或纯化的制备物，其还可被称作HEP(HspC富集的制备物)。

离子交换色谱(IEC)基于存在于样品混合物(细胞裂解物)中的蛋白和固定于所用的树脂或基质上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。离子交换色谱可采取阳离子交换色谱的形式，其中带正电荷的离子与带负电荷的树脂结合，或采取阴离子交换色谱的形式，其中蛋白与具有负电荷的离子结合，并且固定的官能基质或树脂具有正电荷。将存在于样品混合物中的蛋白与树脂结合后，利用起始缓冲液洗涤柱子以使其平衡。通常该缓冲液是低离子强度的。在本发明的方法中，本发明人采用了使用包括至少一种二价阳离子的缓冲液，所述二价阳离子诸如镁或锰，其通常以盐形式来提供，比如氯化镁。缓冲液还可包括二磷酸腺苷，其以将显著抑制应激蛋白/肽复合物的解离的水平存在于缓冲液中。所述缓冲液已由本发明人鉴定为保护应激蛋白复合物的结构稳定性，因为所述缓冲液防止纯化过程中应激蛋白-肽复合物的解离。本发明的方法提供了，通过改变柱中存在的盐梯度将结合的应激蛋白复合物洗脱在级分中，所述改变通常通过使用第二缓冲液来进行，所述第二缓冲液比如氯化钠或基于氯化钠的溶液。收集洗脱的级分，且在不同的pI(等电点)下洗脱的级分含有不同应激蛋白复合物。因为已经鉴定了所期望的蛋白复合物的pI，含有感兴趣的复合物的洗脱级分将是可易于鉴定的。通常本发明的方法将导致应激蛋白复合物的纯化的(或分离的)混合物。与导致一个家族(比如HSP70)的应激蛋白复合物的回收的基于传统离子交换色谱的纯化方法不同，本发明的方法提供了纯化的产物(其也可称作分离的产物)，其中存在不同应激蛋白的混合物。例如，如果细胞裂解物来源于感染病原体的真核细胞，则所得的纯化的产物可包括应激蛋白复合物，其中应激蛋白为HSP60或HSP70中的至少2种。发现存在于细胞裂解物中的任何其他热休克蛋白也可存在于纯化的产物中。并且，如果在制备细胞裂解物的过程中还裂解了感染真核细胞的病原体，则本发明的方法还允许病原体来源的应激蛋白/肽复合物存在于纯化的产物中。例如，纯化的产物可包括应激蛋白复合物的混合物，其中应激蛋白可选自包括以下的组：HSP40、HSP60、HSP70、HSP84、HSP90、Dna-K和Dna-J。

等电点(pI)是特定分子诸如本发明的蛋白复合物没有净电荷时的pH。蛋白或蛋白复合物的pI值可从其一级序列来确定，或利用常规的等电聚焦技术和商业上可获得的设备经验获得。蛋白复合物的pI值可用来影响特定pH处的蛋白的溶解度。蛋白分子含有酸性官能团和碱性官能团二者。并且，氨基酸可以是带正电荷的、带负电荷的或中性的。这些因素赋予蛋白其整体电荷。在低于其pI的pH处，蛋白携带净正电荷。在高于其pI的pH处，蛋白携带净负电荷。蛋白在等于其pI的pH下在盐溶液中具有最小的溶解度。这可导致蛋白复合物从溶液中沉淀出来。因此可期望地是，当根据本发明的方法改变盐梯度时，pH不会从其起始pH下降，因为这可导致蛋白复合物从溶液中沉淀出来。因此，通常设定pH之后，将不再使其升高。在某些实施方案中，盐梯度的升高导致pH的升高。

这样，在一些实施方案中，方法包括改变柱基质中所用的缓冲液的盐浓度，例如通过使用包括氯化钠的缓冲液来进行改变。通常缓冲液中的盐梯度的此改变导致应激蛋白复合物被洗脱，通常被洗脱在与盐浓度的改变相对应的级分中。因此，在某些实施方案中，渐进式添加洗脱缓冲液提供了盐梯度。通常，洗脱缓冲液含有氯化钠(NaCl)，且可通过改变基质所暴露的洗脱缓冲液中的氯化钠的存在来改变盐梯度。在某些实施方案中，氯化钠可以150mM、250mM、350mM或500mM的浓度存在于缓冲液中。在某些实施方案中，洗脱缓冲液提供了pH梯度，其可随缓冲液的成分的改变而改变。在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括至少一种二价阳离子，和任选地二磷酸腺苷。

在某些实施方案中，应激蛋白复合物存在于被洗脱的收集的级分中，且具有从pI4到pI 8的范围内的pI。在某些实施方案中，可首先通过等电聚焦来确定待纯化的应激蛋白的pI。

在某些实施方案中，不在尿素或相似的化合物或溶液存在下进行纯化方法(即，在不存在尿素或相似的混合物或溶液时进行纯化方法)。在某些另外的实施方案中，在纯化方法中不使用两性电解质、离液剂和/或表面活性剂。在某些优选的实施方案中，缓冲液含有至少一种二价阳离子且还可含有二磷酸腺苷。

通常该方法包括以下步骤：(i)将源混合物应用于离子交换基质，(ii)调节pH，改变跨越离子交换基质的盐梯度，和(iii)收集洗脱的级分，其中所述级分包括纯化的或富集的应激蛋白复合物，所述纯化的或富集的应激蛋白复合物的洗脱通过在特定的条件下改变盐梯度而发生。在某些实施方案中，基质是树脂。在另外的实施方案中，基质是膜。通常基质包括带电粒子。

在某些实施方案中，离子交换利用离子交换膜吸附器(absorber)来进行，所述离子交换膜吸附器用来将复合蛋白混合物分离成碱性级分和酸性级分。本发明人已鉴定该离子交换的形式导致方便、快捷和可重复的方法，且因此所述方法可产生持续高产量的保持其完整性的稳定的应激蛋白复合物，这将是产生商业品质的疫苗制备物所需，所述疫苗制备物包括作为免疫原性决定物的蛋白组分，比如应激蛋白-肽复合物。并且，在某些实施方案中，其中应激蛋白复合物用作疫苗组合物的制备物中的免疫原性决定物，并且其中在包括至少一种二价阳离子、和在某些实施方案中包括二磷酸腺苷的缓冲液的存在下纯化应激蛋白复合物，本发明人已鉴定，所述应激蛋白复合物具有介导或增强通过使用上述疫苗引起的免疫应答的较强能力，因为复合物保持了更稳定的状态，即，复合物不会解离以变为分离的应激蛋白和肽片段。在某些实施方案中，缓冲液缺少三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾、或钾盐、离液剂、两性电解质和表面活性剂中的至少一种。

在一个实施方案中，利用技术人员已知的任何适宜的洗脱缓冲液可将热休克蛋白/抗原肽复合物(HspC)富集的制备物(HEP)从离子交换色谱介质中洗脱以维持蛋白完整性。通常洗脱缓冲液包括盐，比如如前文所描述的氯化钠。洗脱缓冲液还可包括磷酸缓冲液或基于TRIS的缓冲液，醋酸盐、柠檬酸盐或氢离子缓冲液。

如本文所用的，术语“离子交换”和“离子交换色谱”指色谱过程，其中在pH和电导率的适当条件下，将感兴趣的可离子化的溶质(例如，在细胞裂解物中提供的感兴趣的蛋白复合物)与连接于固相离子交换物质的带相反电荷的配体相互作用，从而感兴趣的溶质比混合物中的溶质杂质或污染物更多地或更少地与带电荷的化合物非特异性地相互作用。可将混合物中的污染溶质比感兴趣的溶质更快地或更慢地从离子交换物质的柱中洗涤，或结合至树脂或从树脂中排出。“离子交换色谱”特异性地包括阳离子交换色谱、阴离子交换色谱和混合型色谱。

在某些实施方案中，离子交换色谱介质包括离子交换柱。通常，离子交换柱包括高流动基质，比如琼脂糖或琼脂糖凝胶高流动基质。任选地，高流动基质包括表面延伸剂，比如无动物葡聚糖。适宜的离子交换介质包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂二者，以及包括用季铵盐和磺酸基团衍生的那些的柱，例如CAPTOQ^TM柱和CAPTOS^TM树脂(GEHealthcare Limited)。在另外的实施方案中，离子交换色谱介质包括混合的多重离子交换树脂，例如，Capto^TMMMC柱和CAPTO^TM粘附柱(Adhere column)(GE Healthcare)。

在某些实施方案中，细胞裂解物被缓冲交换到50mM的磷酸缓冲液pH6.8中。在某些实施方案中，离子交换柱包括高流动基质，优选地为琼脂糖高流动基质。在某些实施方案中，高流动基质包括表面延伸剂，例如，无动物葡聚糖，和Q配体，例如，季铵盐。

短语“离子交换物质”指带负电荷的固相(即，阳离子交换树脂)或带正电荷的固相(即，阴离子交换树脂)。在一个实施方案中，可通过将一个或多个带电荷的配体(或吸附剂)结合到固相上来提供电荷，例如，通过共价连接来结合。可选地，或另外地，电荷可以是固相的内在属性(例如，在二氧化硅的情况下，其具有总负电荷)。

在某些实施方案中，其中离子交换色谱是阳离子交换色谱，阳离子交换色谱步骤使用的配体选自包括但不限于以下的组：磺酸盐、羧酸盐、羧甲基磺酸、磺酸异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、sulphoxyethyl和正磷酸盐。

“阳离子交换树脂”指带负电荷的固相，且其具有游离的阳离子以用于与流过或经过固相的水溶液中的阳离子进行交换。可使用任何与固相连接的适宜于形成阳离子交换树脂的带负电荷的配体，例如，羧化物、磺酸盐和本文以下所描述的其他配体。商业上可获得的阳离子交换树脂包括，但不限于，例如，具有基于磺酸的基团的那些(例如，来自GEHealthcare的MonoS、MiniS、Source 15S和30S，SP Sepharose FAST FLOW^TM，SP琼脂糖高效液相(SP Sepharose High Performance)，来自Tosoh的Toyopearl SP-650S和SP-650M，来自BioRad的Macro-Prep High S、来自Pall Technologies的Ceramic HyperD S、TrisacrylM和LS SP和Spherodex LSSP)；基于磺基乙基的基团(例如，来自EMD的Fractogel SE，或来自Applied Biosystems的Poros S-10和S-20)；基于磺丙基的基团(例如，来自Tosoh的TSKGel SP 5PW和SP-5PW-HR，来自Applied Biosystems的Poros HS-20和HS 50)；基于磺异丁基的基团(例如，来自EMD的Fractogel EMD S03)；基于磺乙基的基团(例如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)，基于羧甲基的基团(例如，来自GE Healthcare的CMSepharose Fast Flow，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM，来自BioRad的Macro-Prep CM，来自Pall Technologies的Ceramic HyperD CM，Trisacryl M CM，Trisacryl LSCM，来自Millipore的Matrex Cellufine C500和C200，来自Whatman的CM52，CM32，CM23和Express-Ion C，来自Tosoh的Toyopearl CM-650S，CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如，来自J.T.Baker的BAKERBOND^TM Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如，来自J.TBaker的WP CBX，来自Dow Liquid Separations的DOWEX MAC-3，来自Sigma-Aldrich的两性电解质弱阳离子交换剂(Amberlite Weak Cation Exchangers)，DOWEXTM弱阳离子交换剂(DOWEXTM Weak Cation Exchanger)和Diaion弱阳离子交换剂(Diaion Weak CationExchangers)和来自EMD的Fractogel EMD COO-)；基于磺酸的基团(例如，来自BiochromLabs Inc.的Hydrocell SP，来自Dow Liquid Separations的DOWEXTM细筛目强酸阳离子树脂，来自J.T.Baker的UNOsphere S，WPSulfonic，来自Sartorius的Sartobind S膜，来自Sigma-Aldrich的Amberlite强阳离子交换剂，DOWEXTM强阳离子和Diaion强阳离子交换剂)；和基于正磷酸的基团(例如，来自Whatman的pI 1)。

如果需要的话，可用阳离子交换膜代替阳离子交换树脂，例如，Sartobind S(Sartorius；Edgewood，NY)。

在其中离子交换色谱是阴离子交换色谱的某些实施方案中，阴离子交换色谱步骤可使用选自由以下组成的组的配体：季铵或胺，二乙胺、二乙胺丙基、氨基、三甲基铵乙基、三甲苄基铵、二甲基乙醇苄基铵、多胺。

“阴离子交换树脂”指带正电荷的固相，从而具有与其连接的一个或多个带正电荷的配体。可使用与固相结合的适宜于形成阴离子交换树脂的任何带正电荷的配体，比如季铵基团。例如，AEC中所用的配体可以是季铵，比如季烷基胺和季烷醇胺，或胺、二乙胺、二乙胺丙基、氨基、三甲基铵乙基、三甲苄基铵、二甲基乙醇苄基铵、和多胺。可选地，对于AEC，可使用具有带正电荷配体的膜，比如以上所描述的配体来替代阴离子交换树脂。

商业上可获得的阴离子交换树脂包括但不限于，来自Applied Biosystems的DEAE纤维素、Poros PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50，来自GE Healthcare的MonoQ、MiniQ、Source 15Q和30Q、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose highPerformance、QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM，来自J.T.Baker的WP PEI、WP DEAM、WP QUAT，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell DEAE和Hydrocell QA，来自Biorad的UNOsphere Q、Macro-Prep DEAE和Macro-Prep High Q，来自Pall Technologies的CeramicHyperD Q、ceramicHyperD DEAE、Q HyperZ、Trisacryl M和LS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil M，来自Dow Liquid Separations的DOWEX细筛目强碱I型阴离子树脂和II型阴离子树脂和DOWEXMONOSPHER E 77、弱碱阴离子(weak baseanion)，来自Millipore的Matrex Cellufine A200、A500、Q500和Q800，来自EMD的Fractogel EMDTMAE3Fractogel EMD DEAE和Fractogel EMD DMAE，来自Sigma-Aldrich的EMD、Amberlite弱阴离子交换剂I型和II型、Amberlite强阴离子交换剂I型和II型、DOWEX弱阴离子交换剂I型和II型与Diaion强阴离子交换剂I型和II型、Diaion弱阴离子交换剂I型和II型与Diaion强阴离子交换剂I型和II型、Duolite，来自Tosoh的TSK凝胶Q和DEAE5PW和5PW-HR，Toyopearl SuperQ 650S、650M和650C3QAE-550C和650S，DEAE-65OM和650C，和来自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-Ion D和Q。

如果需要的话，可使用阴离子交换膜来替代阴离子交换树脂。商业上可获得的阴离子交换膜包括但不限于，来自Sartorius的SARTOBIND Q^TM，来自Pall Technologies的MUSTANG Q^TM和来自Millipore的INTERCEPTQ^TM膜。

在某些实施方案中，阴离子交换色谱在从约pH 5.0至约pH 9.0的pH下和从约0.5mS/cm至约5mS/cm的电导率下进行。在某些实施方案中，阳离子交换色谱在从约pH 4.0至约pH 9.0的pH下和在从约0.5mS/cm至约15mS/cm的电导率下进行。在某些实施方案中，混合型模式色谱在从约pH 4.0至约pH 9.0的pH下和从约0.5mS/cm至约15mS/cm的电导率下进行。

多肽的“pI”或“等电点”指多肽的正电荷抵消其负电荷时的pH。pI可根据不同的常规方法来计算，例如，由氨基酸和/或多肽上的唾液酸残基的净电荷，或利用等电聚焦技术经验确定。

选择色谱缓冲液的pH和电导率而使感兴趣的HspC与所用的IEC树脂结合。适用作洗脱缓冲液的缓冲液的例子可包括磷酸缓冲液或基于TRIS的缓冲液、醋酸盐、柠檬酸盐和氢离子缓冲液(Good等人，1966Biochemistry5：467-477)。

如本文所用的，术语“洗脱缓冲液”指用来从树脂洗脱感兴趣的蛋白复合物的缓冲液。选择洗脱缓冲液的pH和电导率而使感兴趣的蛋白复合物从过程中所用的CEC树脂中洗脱。适宜用作洗脱缓冲液的缓冲液的例子可包括磷酸缓冲液或基于TRIS的缓冲液、醋酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和Good缓冲液。

在某些实施方案中，洗脱缓冲液是氯化钠(NaCl)，其可以从约50mM至约1500mM的浓度来使用。在某些另外的实施方案中，洗脱缓冲液包括至少一种二价阳离子，和在某些实施方案中，洗脱缓冲液包括二磷酸腺苷。在某些实施方案中，缓冲液缺少三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、钾或钾盐、离液剂、两性电解质和表面活性剂中的至少一种。

洗脱缓冲液的pH可从约pH 3至约pH 10，更优选地为从约pH 4至约pH 9的pH。在某些实施方案中，缓冲液的pH为约pH 6.8。

本发明还延伸到HspC富集的裂解物(HEL)，其根据本发明的方法来纯化。所述HspC富集的裂解物还可称作HspC富集的级分(HEF)或称作HspC富集的组合物(HEC)。因此，本发明的另一方面提供了通过本发明的方法纯化的至少一种HspC富集的裂解物以用于准备疫苗组合物。通常HspC富集的裂解物来源于从本发明的离子交换方法获得的至少一种洗脱的级分。

在某些实施方案中，HspC富集的裂解物包括在应激蛋白(热休克蛋白)和多肽或肽片段尤其是抗原肽片段之间形成的复合物。在某些实施方案中，纯化的HspC富集的裂解物来源于微生物宿主、原核病原体、病毒病原体或原生动物病原体、感染病原体的真核宿主细胞，或来自恶性细胞或癌细胞。在一个优选的实施方案中，纯化的复合物是包括应激蛋白的混合物的应激蛋白/肽复合物，其中应激蛋白可选自由小型hsp、hsp65、hsp70、hsp90和hsp100组成的组。

离子交换色谱(IEC)基于样品中的蛋白和固定于所选择的树脂上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。一般，IEC可再细分为阳离子交换色谱或阴离子交换色谱。例如，当预测靶蛋白复合物在pH6.8处带负电荷时可使用CaptoQ^TM(带正电荷的阴离子交换剂)(参见表1)，和当预测靶蛋白复合物在pH6.8处带正电荷时可使用CaptoS^TM(带负电荷的阴离子交换剂)。

表1Hsp与CaptoQ柱的预测的结合

^*磷酸缓冲液pH6.8用于柱平衡

并且，蛋白质组中的蛋白的等电点(pI)的分布遍及所有原核生物，且可表示为双模分布或“蝴蝶效应”，从而约60％的蛋白pI≤7和蛋白质组的40％的pI≥8(参见表1)。例如，其中来自分枝杆菌培养物的应激蛋白复合物用来生成细胞裂解物，将预期地是，在pH6.8时，利用CaptoQ^TMIEC至少40％的分枝杆菌污染蛋白质组将易于从纯化的复合物中去除，且因此从疫苗产物中去除。技术人员将容易理解，本发明的方法可利用作为高效液相介质的任何适宜的离子交换介质来进行。

当开发稳健的蛋白纯化策略时，考虑的重要的技术问题包括短的过程运行时间和对缓冲液组成的仔细考虑。本发明人已提供了用于纯化蛋白复合物的方法，且这样做时已克服了纯化过程中与蛋白降解、修饰或蛋白复合物的破坏有关的问题。虽然已利用自由流动等电聚焦(FF-IEF)制备了免疫原HspC富集的疫苗，通常运行时间为4小时，并需要利用诸如尿素的离液剂来维持蛋白溶解度。已显示离液剂对巨分子结构和蛋白功能二者具有去稳定作用。鼓舞人心地是，CaptoQ^TM由于高流动“蛋白友好型”基质的化学稳定性而导致了较短的运行时间并提供了缓冲液选择的较大灵活性。本发明已令人惊讶地将从10mg的起始裂解物制备3mg的HspC(应激蛋白复合物)富集的制备物所用的时间减少至约2小时。并且，维持了蛋白溶解度而不需要离液剂或表面活性剂。此外，降低了蛋白降解水平。本发明的缓冲液组成使纯化过程中的蛋白复合物的破坏最小化且通过本发明的方法产生的HEP显示了增强的免疫原性和针对感染的保护。优选的缓冲液包括至少一种二价阳离子和任选地包括二磷酸腺苷。

已将本发明的方法用来制备针对结核(TB)、脑膜炎和流感的潜在的疫苗，并且其是简单的、可预测的和易懂的，且过程性能几乎排他性地由靶蛋白的等电点和缓冲液pH确定。疫苗组合物可包括被认为在宿主中引起保护性免疫中是重要的主要热休克蛋白中的至少两种，尤其是Hsp60或GroEL、和Hsp70或DnaK家族和同系物。

本发明的方法具有可放大和快速的优点，具有处理几升裂解物以产生Kg量的纯化的蛋白复合物和疫苗组合物的可能性。

疫苗组合物的施用

在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物还可包括至少一种佐剂。在某些实施方案中，佐剂选自由以下组成但不限于以下的组：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOM和角鲨烯。另外的适宜的佐剂包括矿物凝胶或铝盐比如氢氧化铝或磷酸铝，但还可以是钙、铁或锌的盐，或可以是酰化的酪氨酸或酰化的糖类的不溶的悬浮液，或可以是阳离子或阴离子衍生的糖类、聚磷腈、可生物降解的微球体、单磷酰脂质A(MPL)、脂质A衍生物(例如，具有降低的毒性)，3-0-脱酰基的MPL，quil A、皂角苷、QS21、弗氏不完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)、Merck佐剂65(Merck和Company，Inc.，USA)、AS-2、AS01、AS03、ASO4、AS15(GSK，USA)、MF59(Chiron，Sienna，Italy)、CpG寡核苷酸、生物黏附剂和粘膜粘着剂、微粒、脂质体、外膜运载体、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁肽或咪唑并喹诺酮(imidazoquinolone)化合物。

本发明的疫苗组合物或纯化的和/或分离的应激蛋白复合物可经由任何适宜的途径施用给需要治疗的受治疗者。通常组合物是胃肠外施用的。用于胃肠外施用的其他可能途径的例子包括，但不限于，静脉内施用、心脏内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肌内施用、腔内施用、皮下施用、透粘膜施用、吸入施用或透皮施用。施用的途径还可包括局部施用和肠内施用，例如，粘膜施用(包括肺粘膜)、口腔施用、鼻施用、直肠施用。制备物可以是液体，例如，含有pH6.8-7.6非磷酸缓冲液的生理盐溶液，或冻干或冷冻干燥的粉末。

在某些实施方案中，组合物作为可注射组合物是可递送的。对于静脉内注射，应激蛋白复合物将为胃肠外可接受的水溶液形式，其无热原且具有适宜的pH、等渗性和稳定性。本领域中具有相关技术的人员将能够利用例如等渗运载体诸如氯化钠注射液、林格氏注射液或乳酸林格氏注射液制备适宜的溶液。按照所需可包括防腐剂、稳定剂、缓冲液、抗氧化剂和/或其他添加剂。

在某些实施方案中，注射方法可以是无针头的，或可使用穿透真皮的针头。在某些另外的实施方案中，疫苗适宜于口腔施用，或可透皮施用，或通过肺部递送来施用。在某些实施方案中，疫苗组合物作为预防性疫苗来施用。在某些实施方案中，疫苗组合物作为治疗性疫苗来施用。在另外的实施方案中，疫苗组合物作为对于通过初始免疫计划介导的任何先前施用的疫苗的加强疫苗来施用。

用于口腔施用的药物组合物可以是片剂形式、胶囊形式、粉末形式或液体形式。片剂可包括固体载体比如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包括液体载体诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包括生理盐水溶液、葡聚糖或其它糖溶液或二醇诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

上述技术和方案的例子和可根据本发明使用的其它技术和方案可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第18版，Gennaro，A.R.，Lippincott Williams & Wilkins；第20版ISBN 0-912734-04-3和Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems(药物剂型和药物递送系统)；Ansel，N.C.等人第7版ISBN 0-68330572-7，其全部内容在此通过引用并入。

本发明的疫苗组合物或纯化的和/或分离的应激蛋白复合物还可经由置于包括血液的某些组织中的微球体、脂质体、其它微粒递送系统或持续释放制剂来施用。

剂量方案可包括本发明的组合物的单次施用，或组合物的多次施用剂量。组合物还可与用于治疗施用本发明的组合物来治疗的病症的其它治疗剂和药物一起顺序地施用或分别地施用。

施用的实际量，和施用的速率和时程将取决于待治疗疾病的性质和严重度。治疗的处方，例如，剂量的决策等，最终将在全科医师和其他内科医生的职责和决定中，且通常考虑待治疗的疾患，个体患者的状态，递送的位点，施用的方法和医师已知的其它因素。

定义

除非另外定义，本文所用的所有技术术语和科学术语具有本发明的领域中的技术人员所通常理解的含义。

贯穿说明书，除非上下文另外规定，术语“包括(comprise)”或“包括(include)”，或变化形式诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”“包括(includes)”“包括(including)”将被理解为意指包括指定的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。

如本文所用的，除非上下文另外清楚规定，术语诸如“一个”、“一种”和“该”包括单数指代和复数指代。因此，例如，提及“活性剂”或“药理学活性剂”包括单一活性剂以及两种或多种不同的活性剂的组合，而提及“载体”包括两种或多种载体的混合物以及单一的载体，和类似物。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互换地使用来描述由肽键或修饰的肽键诸如同电子排列体共价连接的一串至少两个氨基酸。对于可构成肽或蛋白的氨基酸的最大数目没有限制。并且，术语多肽延伸到肽的片段、类似物和衍生物，其中所述片段、类似物或衍生物保持与所述片段、衍生物或同源物所来源的肽相同的生物功能活性。

如本文所用的，术语“治疗(treatment)”和相关的术语诸如“治疗(treat)”和“治疗(treating)”意为引起针对免疫原性决定物的保护性免疫应答以赋予针对疫苗组合物的免疫原性决定物所来源的病原体或癌细胞的长期保护性免疫。因此术语“治疗”指可有利于受治疗者的任何方案。治疗可以关于现有的病症来进行或可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可包括治愈性作用、减轻性作用或预防性作用。

如本文所用的，术语“治疗有效量”意思是诱导针对传染病或癌性病症的保护性免疫应答所需要的本发明的应激蛋白复合物或疫苗组合物的量。如本文所用的，术语“预防有效量”涉及防止传染病或癌性病症的起始发作、进程或复发所需要的多种应激蛋白复合物或疫苗组合物的量。术语“治疗性”不必意为治疗受治疗者直至完全恢复。相似地，“预防性”不必意为受治疗者将不会最终感染疾病病症。

本发明上下文中的“受治疗者”包括和涵盖哺乳动物诸如人类、灵长类和家畜动物(例如，绵羊、猪、牛、马、驴)；实验室检验动物比如小鼠、兔、大鼠和豚鼠；和宠物比如狗和猫。对于本发明的目的优选的哺乳动物是人类。如本文所用的，术语“受治疗者”与术语“患者”可互换地使用。

如本文所用的，术语“发生(mount)”、“发生(mounted)”、“引起(elicit)”、“引起(elicited)”当与免疫应答相关使用时意为产生针对被施用给受治疗者的疫苗组合物的免疫原性决定物的免疫应答。通常疫苗组合物的免疫原性决定物包括利用本发明的方法获得的分离的和/或纯化的应激蛋白复合物。

如本文所用的，术语“免疫应答”包括受T细胞共同刺激的调节影响的T细胞介导的免疫应答和B细胞介导的免疫应答。术语免疫应答还包括不直接受T细胞激活影响的免疫应答诸如抗体产生(体液反应)和不直接受细胞因子反应性细胞诸如巨噬细胞的激活影响的免疫应答。

实施例

现将参照以下的实施例描述本发明，所述实施例的提供用于示例的目的而非意在被解释为限制本发明。

实施例1：从BCG细胞裂解物制备HspC富集的制备物

裂解来自对数中期热休克培养物的BCG细胞沉淀物，并通过离心使其澄清。在含有无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物的无菌PBS中重悬细胞沉淀物。利用超声、Beadbeater或通过Emulsiflex C5高压匀浆器来裂解重悬的细胞并将其收集在无菌袋中。将Benzonase(250U/mL)添加到裂解物中。然后再对样品匀浆两次，将细胞裂解物转移到离心管中并通过在6000g下离心20分钟去除细胞碎片。收集澄清的裂解物并在14000g下再离心60分钟，并移去上清液且被称为高速澄清裂解物。对10ml澄清的裂解物进行脱盐并缓冲液交换到50mM磷酸缓冲液pH6.8中。确定样品的蛋白浓度，如下通过柱色谱制备IEC(离子交换色谱)HspC富集的制备物。以0.5ml/分钟的流速将10mg的蛋白加载到CaptoQ^TM柱上。利用50mM的磷酸缓冲液，pH6.8充分洗涤柱后之后，利用渐增浓度的NaCl(150mM，300mM，500mM和1M)分批洗脱蛋白。利用SDS-PAGE和蛋白质印迹使用商业的针对DnaK和GroEL的抗血清分析含有Hsp70和Hsp65的洗脱的级分。所制备的HEP的例子在图1A(SDS-PAGE)和1B(蛋白质印迹)中示出。在一些制备中，使用了混合形式的MMC柱，在pH5下在50mM醋酸盐、1M NaCl、1mM MgCl₂中加载，并在pH8.0下在同样的缓冲液中洗脱。

实施例2：增强从BCG细胞裂解物制备HspC富集的制备物中复合物的稳定性

裂解来自对数中期热休克培养物的BCG细胞沉淀物，并通过离心使其澄清。在含无EDTA蛋白酶抑制剂混合物的无菌PBS中重悬细胞沉淀物。利用超声、Beadbeater或通过Emulsiflex C5高压匀浆器裂解重悬的细胞并将其收集在无菌袋中。将Benzonase(250U/mL)添加到裂解物中。然后再将样品匀浆两次，将细胞裂解物转移到离心管中并通过在6000g下离心20分钟去除细胞碎片。收集澄清的裂解物并在14000g下再离心60分钟，和去除上清液并称为高速离心澄清的裂解物。将10ml澄清的裂解物进行脱盐并被缓冲液交换到含有或不含1mM ADP的50mM HEPES、1mMMgCl₂，pH 6.8中。利用在CaptoQ^TM柱上进行柱色谱来分离HspC富集的制备物。用含有或不含1mMADP的50mM HEPES、1mM MgCl₂，pH 6.8，充分洗涤柱之后，利用渐增浓度的NaCl(150mM，350mM，500mM和1M)分批洗脱蛋白。利用SDS-PAGE和蛋白质印迹利用商业的针对DnaK(Hsp70)、GroEL(Hsp65)和Ag85的抗血清分析含Hsp70和Hsp65的洗脱级分。所制备的HEP的例子在图5A中示出。利用以ATP替代ADP的缓冲液组合物来制备含破坏的HspC复合物的对照HEP(图5B)。虽然在不同的缓冲液中制备的HEP没有显示出考马斯蓝染色的蛋白图谱的显著差异(图5B)，但它们的免疫原性显著不同，如以下实施例3中所示。

实施例3：BCG来源的HspC富集的制备物的免疫原性

使用BCG HEP来免疫BalbC小鼠并在免疫28天之后从被免疫的动物收获脾。将脾收集到RPMI-1640中，并通过利用5ml注射器将脾加压通过70μm细胞滤过器(strainer)进入到50ml的Falcon管中来制备单细胞悬浮液。在KOVA玻璃载玻片血细胞计数器上利用台盼蓝排除法计数细胞，并在针对TB抗原的回忆应答中测定干扰素γ(IFN-γ)的产生。

将2×10⁶个脾细胞添加到24孔组织培养板(Nunc)的每个孔的1mL培养基中，并将以下抗原之一添加到每个孔：BSA(10μg/ml)，Con A(104/ml)，TB全细胞裂解物(WCL，50至1.56μg/mL)，HEP，IEF HspC或Ag85(10μg/mL)。

利用鼠ELISA试剂盒根据生产商的方案(R&D系统)检验来自再刺激的孔的培养物上清液的IFN-γ，IL-2，IL-4和IL-5。图2显示了利用来自用WCL体外再刺激的免疫的小鼠的脾细胞获得的典型结果。结果显示分离自BCG(IEX)的HEP在免疫的动物中诱导了强IFN-γ反应，比亲代BCG裂解物(LSS)更强且比利用先前所描述的用于分离多个HspC家族的常规自由流等电聚焦方法(IEF)分离的HspC强得多。对于WCL的回忆应答与利用Con A所见的那些回忆应答具有可比性，针对Ag85所见的应答显著但较弱。在小鼠气雾攻击模型中，将体外IFN-γ应答转换为针对活TB攻击的体内保护。图6显示了分离自BCG的HEP的详细的免疫原性。图6A显示了利用来自用WCL体外再刺激的免疫小鼠的脾细胞进行测定获得的细胞介导的免疫的典型结果。结果显示如实施例2中分离自BCG的HEP在ADP和二价阳离子(IEC(2疫苗接种)和ADP/Mg)存在下，在免疫的动物中诱导了强IFN-γ反应，比实施例1中分离自BCG的HEP更强且与利用活BCG免疫并利用这些HEP(BCG/IEC(2疫苗接种))加强的动物中所见的应答相似。

图6B显示了在ADP+二价阳离子(V1)、ATP+二价阳离子(V2)或单独的二价阳离子(V3)存在下，通过分离自BCG细菌细胞裂解物的HEP疫苗诱导的体液免疫的Th1偏向(Th1bias)，且证明利用本发明的改良的缓冲液组合物分离的HEP的增强的免疫原性。图6B还显示通过用通过本发明的改良的方法制备的HspC疫苗(BCG+V1)加强，针对现有的活BCG疫苗(BCG)的Th1诱导的IgG2a抗体应答的显著增强。

实施例4：通过BCG HspC疫苗诱导的保护性免疫

使用如实施例1中分离自BCG的HEP(IEC)和如实施例2中分离自BCG的HEP(修改的IEC)来免疫8-10只天然的BalbC小鼠或活BCG初始免疫的BalbC小鼠的免疫组。利用盐水或活BCG疫苗(Statens Serum Institue)免疫对照动物。在初始疫苗接种和加强疫苗接种之间以4周的间隔以75μg来施用HspC疫苗，并在最终免疫之后4周用50-100CFU的活TB菌株H37Rv来攻击动物。在攻击之后28天从免疫的动物中收获肺，并将肺匀浆物重复三份铺板以定量TB的肺定植。图7显示从肺攻击后4周回收的典型的CFU。如通过活体攻击的降低的肺Cfu所评估的，利用用本发明的改良的缓冲液组合物纯化的HEP免疫的动物显示了显著增强的保护(图7A，修改的IEC对比IEC)并且还加强了通过现有的活BCG疫苗诱导的保护(图7A，BCG对比BCG和IEC)。如通过肺部菌落计数的减少所测定的，在ADP和二价阳离子(修改的IEC)存在下，利用如实施例2中分离的HspC制备的HEP疫苗表现了显著的保护，甚至优于活BCG疫苗(BCG)产生的保护。如通过H37Rv攻击之后进一步的肺部菌落计数的减少所评估的，利用HspC疫苗对用活BCG免疫的动物进行加强(BCG和IEC)与接受单独BCG的那些(BCG)相比较显示了显著提高的保护。

为证明对于观察到增强的保护性免疫原性稳定HspC复合物的绝对必要条件，将利用本发明的改良的缓冲组合物分离的HEP与在ATP存在下以破坏HspC复合物而分离的HEP相比较。图7B中显示了获得的结果，并显示了与在ATP存在下以破坏HspC复合物而纯化的那些(V2)相比较，在利用在二价阳离子(V3)和ADP(V1)存在下分离的HEP免疫的动物中的显著的保护。结果还显示用HEP疫苗(BCG和V1)免疫对用现有的BCG活疫苗(BCG)初始免疫的动物的增强。

实施例5：从奈瑟氏球菌属制备HEP

在44℃下对脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的无荚膜变体(MolMicrobiol.1995年11月；18(4)：741-54)的培养物进行热休克，并通过用抗生素庆大霉素进行处理来杀灭。处理细胞以产生如实施例1和2中所描述的HEP。简言之，通过冻融循环或超声来裂解细胞并通过在6000g下离心20分钟来使其澄清。将澄清的提取物加载到装备有CaptoQ离子交换树脂的柱上。在用50mM，pH6.8的磷酸缓冲液充分洗涤柱之后，利用渐增浓度的NaCl(150mM，350mM，500mM)分批洗脱蛋白。利用SDS-PAGE分析含有Hsp70和Hsp65的洗脱级分(图3A)。将通过150mM NaCl和350mM NaCl洗脱的级分合并并透析到PBS。通过凝胶电泳和蛋白质印迹评估疫苗的主要hsp家族和外膜孔蛋白PorA的存在。结果显示于图3B中。

图8显示了根据实施例1中的方法，在不存在ADP和二价阳离子(A)时纯化的来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的HEP，和根据实施例2中的方法，在ADP和二价阳离子(B)存在下纯化的来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58的HEP，以及蛋白质印迹以用于检测GroEL(hsp60)和DnaK(hsp70)的存在。

实施例6：奈瑟氏球菌属HEP的免疫原性

将根据实施例3的方法从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株MC58或乳酰胺奈瑟氏球菌制备的HEP用来免疫小鼠以生成用于评估交叉菌株反应的血清。收集来自免疫动物的血清并利用以下的临床奈瑟氏球菌菌株评估它们引起交叉菌株抗体介导的调理吞噬的能力：MC58、H44/76-SL、M01-240101、M01-240013、M01-240149、M01-240185和M01-240355。对于测定，用杀灭的荧光标记的细菌和IgG消除的幼兔补体孵育血清样品，在37℃下持续7.5分钟。添加利用0.8％DMF分化的HL60细胞，且孵育样品7.5分钟，然后添加冰冷的DPBS以停止反应。通过流式细胞术分析样品并将数据表示为荧光指数值(FI-C’)。对于所有菌株，从利用MC58来源的HEP免疫接种的小鼠获得的血清诱导了显著高于用来自非免疫接种的对照的血清获得的那些和用来自利用常规等电聚焦方法纯化的hspC免疫的、或利用商业上的外膜运载体(H44/76OMV)疫苗候选物免疫的动物的血清获得的那些。利用异源菌株M01-240101获得的结果显示于图4中，并显示了利用HEP(IEC HspC)、常规纯化的hspC(IEF HspC)和OMV疫苗(H44/76OMV)获得的交叉菌株保护。针对OMV疫苗来源的MC58和H44/76两种菌株，HEP疫苗还产生了高于IEF HspC疫苗的调理作用值。在致死攻击研究中，利用实施例1和2中的方法分离自共生的奈瑟氏球菌、乳酰胺奈瑟氏球菌的HEP显示了对小鼠显著的交叉血清型保护，且所有小鼠针对活MC58的腹膜注射全部存活。

实施例7：来自肺炎链球菌的HEP的纯化和免疫原性

在Hoeprich氏培养基中培养肺炎链球菌菌株D39，在42℃下进行45分钟热休克，并在56℃下进行15分钟热灭活。通过离心收获细胞，重悬于50mM HEPES、1mM MgCl₂、1mM ADPpH 6.8中，并在Emulsiflex C5中进行破坏。通过离心使裂解物澄清，并加载到CaptoQ柱上，并洗脱于含300mM NaCl的裂解缓冲液。使用纯化的HEP免疫BalbC小鼠，并通过ELISA对针对不同的肺炎链球菌菌株的抗体进行血清分析。HEP疫苗诱导了针对免疫菌株D39的良好抗体和与菌株23F和菌株TIGR4的交叉反应。诱导的体液反应进一步显示了Th1淋巴细胞偏向，且IgG2a亚型抗体的产生高于IgG1亚型抗体的产生。

实施例8：来自杆状病毒感染的昆虫细胞的HEP的纯化和免疫原性

将表达流感病毒H3巴拿马血凝素和与人类IgG Fc片段作为融合蛋白的丙型肝炎病毒E1多肽和E2多肽的重组杆状病毒用来感染Sf9昆虫细胞。在Insect-Xpress无蛋白培养基中培养感染的细胞72小时，并在Jouan GR422离心机中在4,500rpm下沉淀细胞10分钟。重悬细胞沉淀物并利用Dounce匀浆器在含0.2％NP40、1mg/ml抑胃肽和0.2mM PMSF的10mMTris-HCl中在冰上使其裂解。将裂解物在12,000g下离心15分钟并在100,000g下离心上清液30分钟以产生澄清的裂解物，然后将其加载到CaptoQ^TM柱上。在含100mM NaCl的10mMTris-HCl，pH 6.8中洗涤柱，并利用150-350mM NaCl盐梯度洗脱HEP。使用纯化的HEP来免疫小鼠和兔，并通过蛋白质印迹和血凝素的抑制来测定来自免疫的动物的血清。

实施例9：对来自肿瘤细胞的HEP的纯化和其免疫原性

将EL4细胞和A20细胞培养于RPMI培养基中，利用Potter匀浆器在含有非离子的缓冲液中裂解，并纯化肿瘤细胞HEP和通过如实施例6中的蛋白质印迹检验其免疫原性。

实施例10：来自表达异源抗原的CHO细胞的HEP的纯化和免疫原性

将CHO细胞和表达Fc-融合蛋白的CHO细胞培养于CHO CD培养基(Gibco)中。收获CHO细胞，在PBS中洗涤，重悬于含有或不含1mMADP和1mM MgCl的50mM HEPES、150mM NaClpH6.8，并通过超声裂解。通过离心使裂解物澄清，然后通过经过0.8μM滤器，且然后经过0.2μM滤器来过滤，在50mM HEPES pH6.8中稀释10倍，并在1ml CaptoQ柱上利用AKTA色谱系统来纯化HEP。用添加或未添加1mM ADP和1mMMgCl的含有50mM HEPES pH6.8和B，50mM HEPES，20mM NaCl pH6.8的20ml缓冲液洗涤柱，且在含有渐增盐浓度的150mM NaCl、250mMNaCl、350mM和500mM NaCl的洗涤缓冲液中洗脱HEP。在SDS-PAGE凝胶上电泳HEP，并用考马斯蓝对蛋白进行染色(图9A)或对于hsp60(抗体SPA-875，Stresgene)或Hsp70(抗体SPA-811，Stressgene)进行蛋白质印迹(分别为图9B和9C)。考马斯蓝染色证明了通过CaptoQ树脂从CHO裂解物中捕捉的蛋白和通过逐步梯度洗脱对这些蛋白的良好分离。蛋白质印迹证明了利用150mM NaCl从CaptoQ柱中洗脱HEP。

本说明书中涉及的所有文献通过引用并入本文。对于所描述的本发明的实施方案的不同的修改和变化对于本领域中的技术人员将是明显的而不脱离本发明的范围。虽然已结合特定的优选的实施方案描述了本发明，应理解，所主张的本发明不应过度地局限于这些特定的实施方案。事实上，所描述的实施本发明的方式的不同的修改对于本领域中的技术人员是明显的，意在为本发明所覆盖。本说明书中涉及的任何现有技术不被视作且不应被视作承认或以任何形式表示该现有技术在任何国家中形成公知常识的部分。

Claims (37)

1.一种用于纯化应激蛋白和多肽之间形成的复合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供源混合物，所述源混合物包括由与多肽复合的应激蛋白形成的至少一种靶应激蛋白复合物，

(ii)确定待从所述源混合物纯化的所述至少一种靶应激蛋白复合物的等电点(pI)；

(iii)从包括所鉴定的应激蛋白复合物的所述源混合物制备澄清的细胞裂解物；

(iv)使步骤(iii)的所述澄清的细胞裂解物经受利用离子交换的纯化，其中在离子交换过程中所述澄清的细胞裂解物被包括至少一种二价阳离子的第一缓冲液缓冲至所述靶应激蛋白复合物的pI的2个单位内的pH，并且其中使用提供盐梯度的第二缓冲液来洗脱靶应激蛋白复合物的混合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中被洗脱的靶应激蛋白复合物以制备物提供，所述制备物包括不同热休克蛋白种类的多个应激蛋白。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(iv)的第一缓冲液还包括二磷酸腺苷。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述二磷酸腺苷以从0.1mM至100mM的浓度来提供，并且其中所述二价阳离子以0.1mM至100mM的浓度来提供。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种二价阳离子是镁盐和/或锰盐。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一缓冲液缺少三磷酸腺苷(ATP)、ATP酶、和/或钾或钾盐中的至少一种。

7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一缓冲液不包括离液剂、表面活性剂、尿素或两性电解质。

8.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第二缓冲液是提供盐梯度的洗脱缓冲液。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括氯化钠。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述氯化钠以50mM至500mM的浓度在所述洗脱缓冲液中被提供。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH从pH3至pH10。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH从pH4至pH9。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH为pH6.8。

14.如权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换是离子交换色谱。

15.如权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换是阳离子交换色谱。

16.如权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换是阴离子交换色谱。

17.如权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换是混合型色谱。

18.如权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换利用离子交换膜吸附器来进行，所述离子交换膜吸附器用来将复合蛋白混合物分成碱性级分和酸性级分。

19.如权利要求1或2所述的方法，其中所述离子交换的固相是树脂或膜。

20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述应激蛋白复合物被洗脱在包括具有4.5至6.5的pI的复合物的级分中。

21.如权利要求16所述的方法，其中所述阴离子交换色谱在从5.0至9.0的pH下和从0.5mS/cm至5mS/cm的电导率下进行。

22.如权利要求15所述的方法，其中所述阳离子交换色谱在从4.0至9.0的pH下和从0.5mS/cm至15mS/cm的电导率下进行。

23.如权利要求1或2所述的方法，其中所述应激蛋白是热休克蛋白。

24.如权利要求18所述的方法，其中所述复合蛋白混合物包括选自由以下组成的组的一个或多个热休克蛋白：hsp20-30kD、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90、hsp100、钙网织蛋白、hsp72、grp94、grp75BiP/grp78、grp75/mt和gp96。

25.如权利要求1或2所述的方法，其中所述应激蛋白复合物来源于由以下组成的组：癌细胞、病原细胞、被病原性生物感染的细胞、经遗传修饰从而其表达来源于癌细胞的异源蛋白的细胞、和经遗传修饰从而其表达来源于在宿主中导致传染病的病原体的异源蛋白的细胞。

26.如权利要求1或2所述的方法，其中所述应激蛋白复合物具有50KDa至900KDa的范围内的分子量。

27.如权利要求1或2所述的方法，其中所述应激蛋白复合物的多肽来源于通常导致传染病的病原性生物。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述病原性生物选自由原核细胞、原生动物、病毒、寄生虫和真菌组成的组。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述病原性生物是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述细菌选自由以下组成的组的种：埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特氏菌属(Bordetella)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、嗜血菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomycetes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Fancisella)、巴斯德杆菌属(Pasturella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链杆菌属(Streptobacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、螺菌属(Spirillum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和支原体属(Mycoplasma)。

31.如权利要求27所述的方法，其中所述多肽来源于病毒。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述病毒选自由以下组成的组：人类免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、单纯疱疹病毒(HSV)、呼吸道合胞病毒、依波拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒(WNV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、裂谷热病毒(RVFV)、流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒、SIV、轮状病毒、虫媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、汉坦病毒和巨细胞病毒。

33.如权利要求27所述的方法，其中所述多肽来源于原生动物病原体。

34.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽是肿瘤特异性抗原。

35.如权利要求5所述的方法，其中所述至少一种二价阳离子是镁盐。

36.如权利要求3所述的方法，其中所述至少一种二价阳离子是镁盐。

37.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括通过权利要求1至36中任一项所述的方法获得的纯化的应激蛋白复合物洗脱级分或裂解物。