CN102458445A

CN102458445A - Fviii衍生肽

Info

Publication number: CN102458445A
Application number: CN2010800323370A
Authority: CN
Inventors: D.赖思
Original assignee: Apitope Technology Bristol Ltd
Current assignee: Hasselt Universiteit
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2010-05-17
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-05-17
Also published as: NZ596300A; HRP20141182T1; RS53671B1; ES2525448T3; PL2465523T3; UA110921C2; SI2465523T1; CN102458445B; EA201171430A1; US20120121625A1; EA027229B1; JP2012527440A; CA2762020C; SG176138A1; HK1173358A1; DK2465523T3; IL216199A; KR20120023023A; SG190573A1; CA2762020A1

Abstract

本发明提供至少部分地衍生自FVIII的肽，所述肽无需进一步的抗原加工就能够结合II类MHC分子，并能由因子VIII特异性T细胞所识别。具体地说，本发明提供一种肽，其包括序列EDNIMVTFRNQASR或由序列EDNIMVTFRNQASR组成。本发明还涉及这样的肽用于防止或阻遏A型血友病和/或获得性血友病中抑制剂抗体形成的用途。

Description

FVIII衍生肽

技术领域

本发明涉及一种肽。具体地说，本发明涉及至少其核心序列可衍生自因子VIII(FVIII)的肽。这些肽可以用来减少或阻止因子VIII抑制剂抗体(factor VIII inhibitor antibody)的形成，例如在A型血友病治疗和获得性血友病中。

发明背景

血友病

血友病(haemophilia)属于一组遗传性血液病症，包括A型血友病、B型血友病(克里斯马斯病(Christmas disease))和血管性血友病(Von Willebrand’sdisease)。

在血友病中，血液凝固能力由于某种关键的凝血因子的部分或全部缺失而严重降低，导致出血时间增加。A型血友病是一种凝血因子VIII缺陷，而B型血友病是一种凝血因子IX缺陷。在这两种疾病中，出问题的基因均存在于X染色体上，因此这些症候是X连锁的。A型血友病的常见程度是B型血友病的五倍。

血友病是一种终身性、遗传性的基因疾病，其影响女性(作为携带者)和遗传了这种症候的男性。大约三分之一的新确诊病例没有过往家族史。这种疾病在全世界都有出现，在所有种族中均有发生。在英国大约有6000人受血友病影响。

血友病人(haemophiliacs)在受伤后发生长时间的出血。外部损伤，如切割伤或擦伤，通常不会造成严重问题：往往可以通过施加一定程度的压力和包覆受伤区域(例如用石膏)即可止血。

主要的问题是向关节、肌肉和软组织中的内出血，这些可能自发发生。内出血，例如向脑中的出血，非常难以处理，且可能致命。关节中的重复出血会导致急性疼痛，并可导致致残的长期性关节损伤和/或关节炎。

血友病的治疗通常是通过替代(replacement)缺失的凝血因子。在轻度或中度的血友病中，可以在发生出血时提供注射(应求式(on-demand)疗法)。但是，在严重血友病中，则有规律地提供预防性注射，以帮助血液凝固并尽可能减小长期性关节损伤的可能性。

A型血友病凝血因子(coagulation factor)替代治疗的一个潜在的严重并发症是会产生可中和因子VIII的促凝血功能的抗体。因子VIII抑制剂在大约25％的严重A型血友病人中出现。由于先天性A型血友病人可能具有FVIII的遗传缺陷，抑制剂的合成是一种针对为了预防或治疗出血事件而施用的外来蛋白的同种异体免疫应答。

CD4+T细胞在针对FVIII的免疫应答中扮演着中枢角色。FVIII被抗原呈递细胞(APC)掺入后，经过蛋白水解性降解成为肽片段(Reding等(2006)Haemophilia 12(supp 6)30-36)。然后这些肽与II类MHC分子结合呈递在APC的表面。然后，该复合物由对FVIII特异性的CD4+细胞的T细胞受体所识别。在合适的共刺激信号的存在下，这种识别作用最终导致CD4+细胞去指导B细胞合成抗体。

抑制剂形成的频度最开始随着因子VIII治疗的次数增加而增加，但是在暴露50-100天后似乎达到平台。抑制剂形成在严重血友病中比在中度或轻度的病中常见得多，而且某些分子缺陷，最明显的是因子VIII轻链中的大段缺失和无义突变，似乎引起抑制剂形成的倾向。替代因子的浓度、类型(纯化的或重组的)、以及治疗历史等参数也可能影响抗体产生的可能性。

管理携带抑制剂的血友病患者是正在面临的挑战。使用脱敏技术的免疫耐受诱导(ITI)在一些携带抗因子VIII的同种抗体的患者中获得了成功。这种治疗手段要求正在暴露于因子替代治疗，因此是一种长期性的策略。

虽然ITI可能取得成功，但有相当比例(大约30％)的患者对ITI无应答。抑制剂效价高的患者对治疗应答的可能性低得多。另一个明显起作用的因素是开始ITI时的年龄，当患者大于20岁时成功率大大降低(Hay等(2005)Seminars in Thrombosis and Hemostasis 32：15-21)。

当ITI疗法不成功时，抑制剂一般会持续终身，而由于这样的患者通常是高应答者，需要使用FVIII旁路产品，如活化的凝血酶原复合物浓缩物(FEIBA^TM)和重组-活化的FVII，来治疗出血事件。然而，使用此类药剂与弥漫性血管内凝血、急性心肌梗死、肺栓塞和血栓等不良事件相关(Acharya和DiMichele(2006)Best Practice&Research Clinical Haematology 19：51-66)。

对于不应答ITI的患者有时使用免疫抑制疗法。治疗包括施用非特异性地靶向免疫系统的免疫抑制药如环磷酰胺(cyclophosphamide)、强的松(prednisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)和环孢菌素(cyclosporine)。这些治疗可能具有与普遍性免疫抑制相关的副作用。

人们对利用利妥昔单抗(Rituximab^TM)——一种针对B细胞CD20抗原的人源化单克隆抗体——进行的选择性B细胞耗竭又产生了兴趣。但是，用这种药物治疗一些儿童时，发生了输注反应、血清病和机会性感染(DiMichele(2007)J Thromb Haemost 5：143-50)。

获得性血友病

获得性血友病是一种罕见的自身免疫病症，在每100万人中有1至4人罹患此病。在此病症中，生来不具有血友病的受试者产生对抗一种凝血因子如因子VIII的抗体。人们认为妊娠和自身免疫疾病如类风湿性关节炎及癌症可能增加发生获得性血友病的风险。虽然在导致其产生的潜在免疫机制方面有所不同，但应答于凝血因子替代治疗而产生的FVIII抑制剂与获得性血友病中产生的FVIII抑制剂的临床表现是相似的。

获得性血友病患者的死亡率接近25％，部分地是由于获得的抑制剂与严重的出血并发症有关联。对获得性自身抗体抑制剂的治疗，主要是根据控制或阻止急性出血性并发症的需要(这些并发症常常危及生命和四肢)，其次是去除自身抗体以恢复正常凝血的需要。

对于某些伴随有低效价自身抗体抑制剂(＜5个Bethesda单位)的出血，可以通过高剂量施用FVIII浓缩物来有效治疗。先前，猪FVIII浓缩物被看作针对获得性血友病相关出血的关键的一线治疗，因为它是唯一提供了在实验室中实际测量输注后FVIII凝血活性水平的机会的替代治疗。由于猪血浆池被猪细小病毒污染，该产品于2004年下市。目前，最常用的是“旁路(bypassing)”药物，但存在产生血栓的潜在风险，而且每种产品的效力仅有约80％。可能需要通过血浆去除术和体外免疫吸附进行血浆交换，以暂时性将抑制剂效价降低，该降低足以使旁路药物或FVIII替代法提供充分的止血。

自身抗体抑制剂的根除取决于免疫抑制措施，如：(1)施用皮质类固醇，在3-6周内的效力为30％-50％；(2)使用细胞毒性和骨髓抑制性化疗剂，例如环磷酰胺、环孢菌素、2-氯脱氧腺苷；(3)用静脉内免疫球蛋白进行的免疫调节；和(4)用利妥昔单抗进行的选择性B淋巴细胞耗竭。利妥昔单抗(Rituximab^TM)应答者可能需要同时使用类固醇，复发可对再次治疗有应答。

因此，目前所有可用来减少与A型血友病治疗相关的同种异体抗体产生、以及获得性血友病中自身抗体产生的方法，都存在着缺点。因此需要改进的方法来解决A型血友病和获得性血友病中抗-VIII抗体的问题。

本发明人发现，通过用FVIII衍生肽预耐受化患者，来阻止FVIII抑制剂抗体形成是可能的。

发明内容

因此，本发明的第一个方面涉及至少部分序列可从FVIII衍生的、能够诱导或恢复对FVIII的耐受的肽。

在第一个实施方案中，本发明提供一种肽，其包含下列FVIII衍生序列之一：

GTLMVFFGNVDSSGI
	TQTLHKFILLFAVFD
SLYISQFIIMYSLDG
	PPIIARYIRLHPTHY
PPLLTRYLRIHPQSW
	MHTVNGYVNRSLPGL
LGQFLLFCHISSHQH
	DTLLIIFKNQASRPY
PRCLTRYYSSFVNME
	TENIQRFLPNPAGVQ
DNIMVTFRNQASRPY
	RYLRIHPQSWVHQIA

具有下列修饰中的一种或多种：

(i)去除一个或多个疏水性氨基酸；

(ii)用荷电亲水性氨基酸取代一个或多个疏水性氨基酸；和

(iii)在一端或两端插入一荷电氨基酸

所述修饰的肽无需进一步抗原加工就能够结合II类MHC分子，并能由因子VIII特异性T细胞所识别。

“亲本”(未修饰的)肽可以是PRCLTRYYSSFVNME或者DNIMVTFRNQASRPY。

在第二个实施方案中，本发明提供一种肽，其包含序列：

X(aa)_n-核心序列-(aa)_m

其中X是荷电亲水性残基；

aa是氨基酸；

n是0-5的整数；

m是0-5的整数；并且

“核心序列”选自下列FVIII衍生肽组成的组：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

所述肽无需进一步抗原加工就能够结合II类MHC分子，并能由因子VIII特异性T细胞所识别。

例如，所述肽可以包括序列XDNIMVTFRNQAS。

在第三个实施方案中，本发明提供一种肽，其包含序列：

Y(aa)_n-核心序列-(aa)_mZ

其中Y和Z是具有相反极性的荷电氨基酸；

aa是氨基酸；

n是0-5的整数；

m是0-5的整数；并且

“核心序列”选自下列FVIII衍生肽组成的组：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

例如，所述肽可以包含序列YDNIMVTFRNQASZ。

在第三个实施方案中，例如，Y可以是荷正电荷的氨基酸而Z可以是荷负电荷的氨基酸。或者Y可以是荷负电荷的氨基酸而Z可以是荷正电荷的氨基酸。

例如，荷电亲水性氨基酸可以是D，E，K，H或者R。例如，荷正电的氨基酸可以是K，H或者R。例如，荷负电的氨基酸可以是D或者E。

本发明的第一个方面的肽可以，例如，包含序列EDNIMVTFRNQASR或由序列EDNIMVTFRNQASR组成。

在第二个方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其包含本发明第一个方面的一种或多种肽。所述组合物可以包含全部或部分衍生自FVIII的多个肽，所述多个肽能够诱导或者恢复对FVIII的耐受。

组合物可以是试剂盒的形式，其中分别地提供所述多个肽，以供分开(separate)、相继(subsequent)、顺序(sequential)或同时(simultaneous)施用。

本发明的肽或组合物可用于阻遏、减少、或阻止因子VIII抑制剂抗体的产生。

本发明还提供这样的肽或组合物在制备用于阻遏、减少或防止因子VIII抑制剂抗体产生的药物中的用途。

本发明还提供一种用于阻遏、防止或减少受试者中因子VIII抑制剂抗体产生的方法，包括对所述受试者施用这样的肽或组合物的步骤。

受试者可以是FVIII缺陷的。特别地，受试者可患有A型血友病，并且可能进行，或者即将进行因子VIII替代治疗。

或者，受试者可能患有获得性血友病，或者有风险感染(contract)获得性血友病。

因子VIII抑制剂在表达HLA-DR2的个体中更常见。用本发明的方法治疗的受试者因此可以是HLA-DR2阳性的。

附图说明

图1：用rhFVIII/CFA初始刺激(prime)的FVIII+DR2+小鼠的淋巴结细胞(LNC)的回忆应答

a)针对FVIII肽1-6的LNC增殖

b)针对FVIII肽7-12的LNC增殖

c)针对FVIII肽1、3和11的LNC增殖

图2：对FVIII衍生肽特异性的FVIII+DR2+T细胞杂交瘤克隆的代表例

图3：用rhFVIII/CFA初始刺激的FVIII-DR2+小鼠的LNC的回忆应答

图4：对FVIII衍生肽特异性的FVIII-DR2+T细胞杂交瘤克隆的代表例

图5：对a)DNIMV和b)PRCLT特异性的FVIII-/-克隆

图6：用肽3x i.p.处理后用rhFVIII/CFA初始刺激的FVIII+DR2+小鼠的LNC对FVIII的回忆应答。

图7：利用针对FVIII衍生的重叠肽特异性的FVIII-DR2+T细胞杂交瘤克隆确定能够起apitope作用的肽表位的范围。原始肽称为0。向N末端移动一个氨基酸是-1，向N末端移动两个氨基酸是-2，等等。向C末端移动一个氨基酸是+1，等等。

图8：用FVIII衍生肽PRCLT、DNIMV或这二者的混合物处理的FVIII-DR2+小鼠响应于FVIII的淋巴结细胞IFN-γ产生。

图9：用EDNIMVTFRNQASR(EDNIMV)或对照肽(DNIMV)刺激的首次接受实验

小鼠或耐受化小鼠的应答。

详述

肽

本发明涉及一种肽。

术语“肽”使用其普通意义，意指一系列残基，通常是L-氨基酸，它们相互连接，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键。该术语包括修饰的肽和合成的肽类似物。

本发明的肽可以使用化学方法来制备(Peptide Chemistry，Apractical Textbook.Mikos Bodansky，Springer-Verlag，Berlin.)。例如，可以用固相技术合成肽(Roberge JY等(1995)Science 269：202-204)，将其从树脂上切下，并用制备型高效液相层析来纯化(例如，Creighton(1983)Proteins Structures AndMolecular Principles，WH Freeman and Co，New York NY)。可以使用例如ABI 431APeptide Synthesizer(Perkin Elmer)按照制造商提供的指导来实现自动化合成。

或者，肽可以通过重组手段，或通过从因子VIII切割肽继之以在一端或两端的修饰来制备。肽的组成可以通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解方法)来确认。

为了实际目的，存在多种所述肽可以表现出的其他特征。例如，所述肽在体内足够稳定是重要的，以使得它在治疗上有用。肽在体内的半衰期可以为至少10分钟、30分钟、4小时或24小时。

所述肽还可在体内表现良好的生物利用度。所述肽可在体内维持这样的构象，使得它能够结合细胞表面的MHC分子而没有应有的阻碍。

核心残基

在适应性免疫应答中，T淋巴细胞能够识别蛋白质抗原的内部表位。抗原呈递细胞(APC)掺入蛋白质抗原并把它们降解成短的肽片段。肽可与细胞内的I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，并被带到细胞表面。当肽与MHC分子结合被呈递于细胞表面时，该肽可由T细胞(通过T细胞受体(TCR))所识别，在这种情况下该肽是T细胞表位。

因此表位是这样一种肽，它能够从抗原衍生而来，能够结合I类或II类MHC分子的肽结合沟(peptide-binding groove)并由T细胞所识别。

最小表位是能够从表位衍生而来的、能够结合I类或II类MHC分子的肽结合沟并由T细胞所识别的最短片段。对于给定的免疫原性区域，通常能够产生“一组套叠的”(a nested set)重叠肽，这些肽发挥表位作用，都包含最小表位，但它们的侧翼区域不同。

类似地，对于特定的MHC分子：T细胞组合，可以通过测量针对截短的肽的应答来鉴定最小表位。例如，如果获得了针对重叠文库中包含残基1-15的肽的应答，那么可以使用两端截短的组(即1-14、1-13、1-12等，及2-15、3-15、4-15等)来鉴定最小表位。

本发明提供包含FVIII的“核心残基”序列的肽，核心残基序列选自下列：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

如实施例所示，这些核心残基序列使用HLA-DR2结合算法预测以代表或包含每个区域的最小表位。

Apitope

本发明人先前已确定，肽在无需进一步抗原加工的条件下结合I类或II类MHC分子并被呈递给T细胞的能力，与该肽诱导体内耐受性的能力之间存在关联(WO 02/16410)。如果肽过长，以至于其不经过进一步加工(例如修剪)就无法结合MHC分子的肽结合沟，或者以不合适的构象结合，则它不会在体内具有致耐受性。另一方面，如果肽具有合适的大小和构象以直接结合MHC肽结合沟并呈递给T细胞，则可预计该肽可用于诱导耐受性。

因此，有可能通过考察肽在体外能否无需进一步抗原加工而结合I类或II类MHC分子并呈递给T细胞，来考察该肽的致耐受能力。

本发明的肽是apitope (Antigen Processing-Indepent Epitopes，不依赖抗原加工的表位)，因为它们无需进一步抗原加工就能够结合II类MHC分子并刺激来自因子VIII特异性T细胞的应答。可以预计，依照WO 02/16410中描述的基于规则的(rule-based)方法，这样的apitope会导致对FVIII的耐受。

本发明的肽可以为任何能够无需进一步加工即结合I类或II类MHC分子的长度。通常，本发明的肽能够结合II类MHC分子。

结合I类MHC分子的肽通常为7-13个，更通常为8-10个氨基酸长。在肽的两端，通过肽主链中的原子与所有I类MHC分子的肽结合沟中的不变位点之间的接触使得肽的结合稳定化。在所述沟的两端均有不变位点，它们结合肽的氨基和羧基末端。肽主链中的扭转(kinking)适应肽长度的变化，扭转常常在脯氨酸或甘氨酸残基处发生，这些残基容许所需的柔性。

结合II类MHC分子的肽通常为8到20个氨基酸长，更通常为10到17个氨基酸长，并且可以更长(例如长达40个氨基酸)。这些肽沿着MHC II肽结合沟采取伸展的构象，这种沟(与I类MHC肽结合沟不同)两端是开放的(open at both ends)。肽主要通过主链原子与排列成肽结合沟的保守残基的接触被固定到位(held in place)。

肽序列

本发明的第一个实施方案涉及一种肽，其包含下列FVIII衍生序列之一：

具有下列修饰中的一种或多种：

(i)去除一个或多个疏水性氨基酸；

(ii)用荷电亲水性氨基酸取代一个或多个疏水性氨基酸；和

(iii)在一端或两端插入一荷电氨基酸

在表1中给出了标准氨基酸的列表，连同它们的侧链极性、电荷和疏水性指数。

表1

疏水性氨基酸包括：G，C，M，A，P，I，L，V和芳族氨基酸F和W。可以从序列末端或序列内部去除疏水性氨基酸。

荷电亲水性氨基酸包括：K，R，D，H和E。可以在序列末端或序列内部用荷电亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。

序列的N末端可以插入一个或多个荷电氨基酸。有利地，为了产生电荷偶极，在一端插入或取代一荷正电氨基酸并在另一端插入/取代一荷负电荷的氨基酸。

亲本序列的修饰不应显著地损害肽与MHC分子的肽结合沟的结合、其由T细胞识别的能力，或者其充当apitope(无需进一步的抗原加工就能够结合MHC分子并呈递至T细胞)的能力。这可以使用已知的抗原呈递测定法和T细胞杂交瘤容易地检测。

本发明的第二个实施方案涉及一种肽，其包含下列序列：

X(aa)_n-核心序列-(aa)_m

其中X是荷电亲水性残基；

aa是氨基酸；

n是0-5的整数；

m是0-5的整数；并且

“核心序列”选自下列FVIII衍生肽组成的组：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

序列(aa)_n或(aa)_m可以是4-5个氨基酸的任意序列。例如，肽可以具有序列：XDNIMVTFRNQAS，在这种情况下n＝3并且m＝0。

本发明的第三个实施方案涉及一种肽，其包含下列序列：

Y(aa)_n-核心序列-(aa)_mZ

其中Y和Z是具有相反极性的荷电氨基酸；

aa是氨基酸；

n是0-5的整数；

m是0-5的整数；并且

“核心序列”选自下列FVIII衍生肽组成的组：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

例如，对于肽EDNIMVTFRNQASR，

Y＝E；

(aa)_n＝DNI

m＝0；并且

Z＝R

所述肽可包含核心序列，以及附加的位于N和/或C端的侧翼序列(分别是(aa)_n和(aa)_m)，只要所得的肽能够无需进一步抗原加工即能够结合II类MHC分子即可。

侧翼的N和/或C端序列可以是从人FVIII核心残基序列侧翼的序列衍生的。

APIPS

已知多种不依赖抗原加工的呈递系统(antigen processing independentpresentation systems，APIPS)，包括：

a)固定的APC(有或无针对CD28的抗体)；

b)含有I类或II类MHC分子的脂质膜(有或无针对CD28的抗体)；和

c)以结合于平板的形式存在的、经纯化的天然或重组MHC(有或无针对CD28的抗体)。

全部这些系统都能够呈递与MHC分子结合的抗原，但不能加工抗原。在所有这些系统中，加工功能或者缺失，或者被失能化。这就为研究某种肽是否能在不经过进一步抗原加工的条件下结合I类或II类MHC分子并被呈递至T细胞提供了可能。

使用固定的APC来研究T细胞应答在本领域是众所周知的，例如，在通过测量针对截短的肽的应答来考察多肽内的最小表位的研究中(Fairchild等(1996)Int.Immunol.8：1035-1043)。APC可以使用例如甲醛(通常是多聚甲醛)或戊二醛来固定。

脂质膜(可以是平面膜或者脂质体)可以用人工脂质来制备，或者可以是来自APC的质膜/微粒体级分。

在使用中，可以将APIPS施加到组织培养板的孔中。然后加入肽抗原，并通过添加所选的T细胞系或克隆检测所述肽与APIPS的MHC部分的结合。T细胞系或克隆的活化可以用本领域中已知的任何方法来测量，例如通过³H-胸苷掺入或细胞因子分泌。

因子VIII

本发明的肽的核心序列可衍生自因子VIII。一侧或两侧的侧翼序列((aa)_n和(aa)_m)也可衍生自因子VIII。

因子VIII参与内在的血液凝固途径；因子VIII是因子IXa的辅因子，后者在Ca+2和磷脂的存在下将因子X转化为活化形式Xa。

因子VIII的基因产生两种可选的经剪接的转录物。转录物变体1编码一种大的糖蛋白，亚型a，其在血浆中循环并与von Willebrand因子缔合成非共价的复合物。该蛋白质经历多个切割事件。转录物变体2编码一种推定的小蛋白，亚型b，其主要由因子VIIIc的磷脂结合域组成。该结合域对促凝剂活性来说是关键的。

在1980年代中期阐明了人因子VIII基因的186,000个碱基对的全序列(Gitschier等(1984)Nature 312326-330)。同时，在经培养的哺乳动物细胞中使用了编码全部2351个氨基酸序列的DNA克隆来产生生物学活性的因子VIII(Wood等(1984)Nature 312：330-337)。人因子VIII的全部2,351个氨基酸的序列在SEQ ID NO：1中给出。

本发明的肽的核心序列可衍生自因子VIII。任选的，侧翼序列也可衍生自因子VIII，只要它们与天然因子VIII多肽中核心序列侧翼的序列相同。所述序列可以是能够从因子VIII序列的切割获得的，或者是从因子VIII序列的切割获得的。

可溶性

本发明的第一个实施方案的肽是下列肽之一的修饰形式：

已经证明这些肽作为apitope发挥作用并且在体内是致耐受的(见实施例和国际专利申请No PCT/GB2008/003996)。

众所周知，在肽介导的耐受诱导中，可溶性是重要的考虑因素。可以通过下列方式中的一种或多种提高可溶性：

(i)去除一个或多个疏水性残基；

(ii)添加/取代以添加一个或多个荷电亲水性残基

(iii)在任一端放置(placing)荷正电或荷负电的氨基酸以造成电荷偶极。

修饰的肽可能比亲本(未修饰的)肽具有更高的可溶性。修饰的肽可以比亲本肽具有2、3、4或5倍高的可溶性。这些肽可以在高至0.5mg/ml、1mg/ml，或5mg/ml的浓度下是可溶的。

耐受性

T细胞表位在针对任何抗原(自身的或外来的)的适应性免疫应答中扮演着中枢性的角色。已经通过利用实验模型证明了T细胞表位在超敏性疾病(包括变态反应、自身免疫疾病和移植物排斥)中的中枢性作用。通过注射合成肽(基于T细胞表位的结构)和佐剂的组合，可以诱导炎症性或变应性疾病。

与之形成对照的是，已经证明，通过施用可溶形式的肽表位来诱导针对特定抗原的免疫耐受是可能的。已经在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，一种多发性硬化(MS)的模型)(Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5：1159-1165；Liu和Wraith(1995)Int.Immunol.7：1255-1263；Anderton and Wraith(1998)Eur.J.Immunol.28：1251-1261)、以及关节炎、糖尿病和葡萄膜视网膜炎(uveoretinitis)(Anderton和Wraith(1998)，同上中有综述)的实验模型中，证明了施用可溶性肽抗原是有效的疾病抑制手段。还证明了它是治疗EAE中正在进行的疾病的手段。

耐受是对抗原的不应答。对自身抗原的耐受是免疫系统的一个关键特征，如果丧失了这种耐受，就可能导致自身免疫疾病。适应性免疫系统必须保持这样的能力：对千差万别的致病原(infectious agent)产生应答，同时避免对其自己的组织中所含的自身抗原的自身免疫攻击。这一点在很大程度上是由未成熟的T淋巴细胞对胸腺中凋亡性细胞死亡的敏感性(中心耐受)所调控的。然而，不是所有的自身抗原都在胸腺中被检测到，所以自身反应性胸腺细胞的死亡仍然是不完全的。因此还存在这样的机制，使得外周组织中成熟的自身反应性T淋巴细胞可以获得耐受(外周耐受)。Anderton等(1999)(Immunological Reviews 169：123-137)提供了关于中心耐受和外周耐受的机制的综述。

在A型血友病中，患者在因子VIII基因中有缺陷。这意味着因子VIII不被免疫系统识别为“自身”抗原。因此，当在凝血因子替代治疗过程中施用因子VIII时，针对该外来蛋白产生了同种异体免疫应答，导致FVIII抑制剂抗体的产生。

本发明的肽能够诱导对因子VIII的耐受，这样当治疗性施用FVIII时，它不诱导免疫应答，也不产生FVIII抑制剂。

获得性血友病是一种对因子VIII的耐受被破坏的自身免疫疾病，在这种情况下，可以施用本发明的肽来恢复针对这种自身蛋白的耐受并减少病原性的免疫应答。

耐受可能是至少一部分CD4+T细胞被诱导出无反应性(anergy)的结果，或者以至少一部分CD4+T细胞被诱导出无反应性为特征。为了活化T细胞，肽必须与“专职”APC结合；“专职”APC能够把两种信号传递给T细胞。第一种信号(信号1)由APC细胞表面上的MHC-肽复合物传递而T细胞通过TCR接收。第二种信号(信号2)由APC表面上的共刺激分子如CD80和CD86传递并被T细胞表面的CD28所接收。认为当T细胞在没有信号2的情况下接收到信号1时，它不被活化，并且事实上变成无反应性的。无反应性T细胞对接下来的抗原刺激(challenge)无反应，并且可能能够阻遏其它免疫应答。无反应性T细胞被认为与介导T细胞耐受有关。

不希望受理论束缚，本发明人预测，需要加工后方可与MHC分子结合呈递的肽不诱导耐受，因为它们必需由成熟的抗原呈递细胞来处理。成熟的抗原呈递细胞(如巨噬细胞、B细胞和树突细胞)能够进行抗原加工，但是也能够将信号1和信号2二者传递给T细胞，导致T细胞活化。另一方面，apitope将能够结合未成熟APC上的II类MHC。因此它们会在没有共刺激的条件下被呈递给T细胞，导致T细胞无反应性和耐受。

当然，apitope也能够结合成熟APC的细胞表面上的MHC分子。然而，免疫系统所含的未成熟APC的丰度高于成熟APC(已经提出少于10％的树突细胞是活化的，Summers等.(2001)Am.J.Pathol.159：285-295)。因此，apitope的缺省状态(default position)应该是无反应性/耐受，而不是活化。

针对FVIII的耐受的诱导可以在体内通过本领域已知的技术寻找下列各项的水平的降低来加以监测：

(i)FVIII抑制性抗体：

(ii)针对FVIII特异性的CD4+T细胞

(iii)能够分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。

已经证明当通过施用肽诱导了耐受时，抗原特异性CD4+T细胞的增殖能力降低。同时，这些细胞的IL-2、IFN-γ及IL-4的产生受到下调，但IL-10的产生增加。已经证明，在肽诱导的耐受状态的小鼠中，中和IL-10完全恢复对疾病的易感性。已经提出，在耐受状态下仍然存在某个调节细胞群体，它们产生IL-10并介导免疫调节(Burkhart等(1999)Int.Immunol.11：1625-1634)。

因此，耐受性的诱导可以通过包括下述在内的多种技术来监测：

(a)CD4+T细胞中的无反应性的诱导(这可以通过后续的在体外用FVIII的刺激来检测)；

(b)CD4+T细胞群体中的变化，包括

(i)增殖的减少；

(ii)IL-2、IFN-γ和IL-4产生的下调；和

(iii)IL-10的产生的增加。

如本文中使用的，术语“致耐受性”(tolerogenic)意指能够诱导耐受。

组合物

本发明还涉及一种组合物，例如药物组合物，其包含一种或多种根据本发明的肽。

所述肽可包括多种本发明的肽，例如两种，三种，四种，五种或六种本发明的肽。

本发明的组合物可以用于预防或治疗用途。

当施用所述组合物用于预防时，所述组合物可减少或防止针对FVIII的免疫应答的产生。免疫应答的水平低于未使用该组合物处理时该患者中本应得到的免疫应答。术语“减少”表示观察到免疫应答的部分减少，例如在尚未使用该组合物处理的患者中会观察到的应答(或在同一时间段中未处理患者中观察到的应答)的50％、70％、80％或90％的减少。术语“防止”表示没有观察到可觉察的针对FVIII的免疫应答。

当施用所述组合物用于治疗用途时，所述组合物可阻遏已经处于正在进行中的针对FVIII的免疫应答。术语“阻遏”(suppress)表示与肽处理之前的水平，或若不接受处理于同一时间点上可观察到的水平相比，正在进行的免疫应答的水平下降。

用本发明的组合物治疗可导致下列各项中任一项或全部的水平减少：

(i)FVIII抑制性抗体

(ii)FVIII特异性CD4+T细胞

(iii)分泌FVIII抑制性抗体的B细胞。

所有这些因素的检测都可以通过本领域已知的技术如ELISA、FACS等来实施。

并且/或者，用本发明的组合物治疗可导致针对FVIII特异性的CD4+T细胞的无反应性。无反应性可以例如通过后续在体外用FVIII刺激来检测。

重要的是不能忘记，不是所有的针对FVIII的免疫应答都是致病性的。在没有抑制剂的血友病患者中(Moreau等(2000)Blood 95：3435-41)和大约15％的健康献血者中(Algiman等(1992)89：3795-9)可以发现非抑制性的抗FVIII抗体。

FVIII抑制剂可以利用凝血Bethesda测定法的Nijmegen修改版本来检测，该方法中测试患者血浆对正常血浆中的FVIII的灭活能力。一个Bethesda单位定义为中和50％的血浆FVIII活性的抗体量，且0.6BU或更高的效价提示抗体的存在。

一般而言，抑制剂若水平＜5BU则归类为低效价，若≥5BU则归类为高效价。

循环中的FVIII抑制性抗体的水平可以减少到若患者不接受治疗可观察到的抗体水平的90％、75％、50％、20％、10％、5％。

循环中的FVIII抑制性抗体的水平可以被减少到5、4、3、2、1、或0.5BU。

本发明的肽和组合物可以增加治疗性施用的FVIII中可用于帮助患者凝血的量或比例。这是因为减少了FVIII抑制剂，FVIII抑制剂可能有效地使一部分FVIII不能发挥其治疗功能。本发明的肽或组合物可以使可用FVIII的量增加，例如，10％、25％、50％、75％或100％。

因此本发明的肽和组合物可以减少为了帮助患者凝血而需要施用的FVIII的量。

制剂

所述组合物可以制备为可注射制剂，作为液体溶液或悬浮液；还可以制备适于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。制备物还可以乳化，或者将肽包埋在脂质体中。可以将活性成分与可药用且与该活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂有，例如，水、盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水)、葡萄糖、甘油、乙醇、等等，以及它们的组合。

此外，如果期望，组合物可以含有次要量的辅助物质如润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。缓冲性盐包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐。可以使用盐酸和/或氢氧化钠调节pH。为了稳定化，可以使用二糖，如蔗糖或海藻糖。

如果组合物含有多种肽，各种肽的相对比例可以是大致相等的。或者可以改变各种肽的相对比例，例如，可以改变各种肽的相对比例以便将致耐受性应答集中于某一特定的自身反应性T细胞子集，或者若发现在特定HLA类型中某种肽的作用好于其他肽，可改变各种肽的相对比例。

配制后，可以将组合物装入无菌容器中，然后密封，并于低温(例如4℃)保存，或者可以将其冷冻干燥。

方便地，组合物制备为冻干(冷冻干燥)粉末。冻干允许以稳定形式长期保存。冻干方法是本领域众所周知的，例如参见http://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.html。在冷冻干燥前通常使用填充剂，如甘露醇、葡聚糖或甘氨酸。

组合物可以以方便的方式施用，如通过口服、静脉内(当可水溶时)、肌肉内、皮下、舌下、鼻内、皮内或栓剂途径，或植入(例如利用缓释分子)。

组合物有利地可以通过鼻内、皮下或皮内途径施用。

本发明的肽和组合物可以用来治疗人受试者。受试者可患有A型血友病，尤其是严重A型血友病。受试者可以是FVIII遗传缺陷的。受试者可患有获得性血友病。受试者可具有抑制性抗FVIII抗体。

受试者可正在进行或即将进行使用FVIII的凝血替代治疗。

受试者可正在进行或即将进行使用FVIII基因的基因治疗。

受试者可以是与产生抑制性抗FVIII同种抗体或自身抗体的倾向相关的HLA单体型。受试者可表达HLA-DR2。测定个体的HLA单体型的方法是本领域已知的。

通常，医师会为每个受试者确定最合适的实际剂量，且该剂量将随着特定患者的年龄、体重和应答而变化。

在一个优选的实施方案中，可遵循“剂量提升”方案，其中以递增的浓度给患者施用多个剂量。这种手段已经用于例如对蜂毒变态反应的免疫治疗应用中的磷脂酶A2肽(Müller等(1998)J.Allergy Clin Immunol.101：747-754，以及Akdis等(1998)J.Clin.Invest.102：98-106)。

试剂盒

方便地，如果所述组合物包含多种肽，它们可以以混合的组合物或鸡尾酒混合物的形式一起施用。但是，可能在有些情况下优选以试剂盒的形式各别地提供所述肽，用于同时、分开、顺序或联合施用。

试剂盒还可包含混合和/或施用手段(例如用于鼻内施用的汽化器(vapouriser)；或用于皮下/皮内定量给药的注射器和针头)。试剂盒还可包含使用说明。

本发明的药物组合物或试剂盒可以用来治疗和/或预防疾病。

特别地，所述组合物/试剂盒可以用来治疗和/或预防A型血友病或获得性血友病。

A型血友病

A型血友病(经典血友病)是由因子VIII的缺陷造成的。

A型血友病的估计发病率是每10,000名男性中1人，而B型血友病估计是每40,000名男性中1人。每5,000名女性中约有1人是A型血友病携带者，而每20,000名女性中有1人是B型血友病携带者。

根据血液中凝血因子的水平，血友病通常分为3类：严重、中度和轻度。在严重血友病中，正常凝血因子少于1％。严重程度在世代之间倾向于保持一致。

与普遍的想法相反，对于血友病患者而言，轻微的切割和伤口通常没有威胁。相反，最大的危险来自于可能发生于关节和肌肉中的自发出血。这在快速生长的年龄最容易发生，通常在5到15岁之间。

关节中重复的自发出血可造成关节炎和相邻肌肉逐渐弱化。血液累积引起的对神经的压迫可导致疼痛、麻木、以及患处暂时性移动不能。

A型血友病通常用血液检测来诊断，以测定凝血效率并考察凝血因子水平是否异常。

在1970年代，纯化的凝血因子(从捐献的血液中分离的)的开发显著改善了血友病患者的长期远景。轻度到中度的血友病患者可以基于特定情况(on an adhoc basis)使用FVIII治疗，而严重血友病患者可能需要规律性的、无期限的治疗。

从前，给予患者的因子VIII浓缩物是从数千份血浆捐献品汇集而来的。这样造成了严重的病毒性病原体，尤其是人免疫缺陷病毒和肝炎病毒污染的问题。单克隆抗体纯化技术、热灭活和杀病毒去污剂处理已经使得血浆来源的浓缩物相对安全。

重组DNA技术现在已经提供了一系列合成产品，如Recombinate^TM和Kogenate^TM。Kogenate是利用表达人因子VIII的幼仓鼠肾细胞制备的。所得的因子是高度纯化的，排除了任何从血浆中带入病毒的可能。

本发明的肽或组合物可以在因子VIII替代治疗之前和/或之中施用。

A型血友病是基因治疗的理想目标疾病，因为i)它是在单个已鉴定的基因中的突变造成的，ii)体内凝血因子水平的稍许提高即可以将严重血友病转化为较轻微的疾病，和iii)现有的替代治疗被认为差强人意。此外，如果期望的凝血活性水平“过火”的话，有很宽的安全范围。

遗憾的是，迄今为止通过基因治疗治愈血友病的承诺尚未实现，这主要是因为难以找到一种具有充分的非免疫原性以容许长期表达凝血因子的基因投递系统。

本发明的肽还会适用于在用因子VIII进行基因治疗之前使受试者耐受化和/或在基因治疗之后应对患者中的FVIII抑制剂生成。

获得性血友病

获得性血友病的特征是，在先前凝血正常的个体中抗FVIII的自身抗体抑制剂的存在。它是一种少见的病症，估计发病率为每年每百万人的群体中1-3人。与获得性自身抗体抑制剂相关的死亡率接近25％，而相比之下具有同种异体抗体的个体中的死亡风险显著更低。

与同种抗体抑制剂患者相比，获得性血友病的特征在于：(1)更严重的出血模式；(2)在年龄较大的群体中的发生率更高；(3)其发生伴随着可鉴定的原因性(identifiable underlying)自身免疫疾病、淋巴增殖性或实体瘤性恶性肿瘤、妊娠、以及在大约50％的病例中使用特定的抗生素如青霉素和磺胺；和(4)遵循II型药代动力学模式的体外抑制剂活性，以及自身抗体对目标凝血因子活性的不完全中和，通常造成患者血浆中残留因子VIII水平为2％-18％。

本发明的肽或组合物可以施用于患有获得性血友病的患者，或者被认为有风险患上获得性血友病的患者，例如由于

i)即将进行例如青霉素或磺胺治疗，

ii)肿瘤或其他恶性肿瘤的进展，

iii)即将开始的或早期妊娠。

下面将借助实施例进一步说明本发明，这些实施例仅仅意在用来帮助本领域普通技术人员实施本发明，而绝不意在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：HLA-DR2因子VIII肽的选择

使用3种HLA-DR结合算法比较了一系列FDVIII 15聚体肽：

SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm)

ProPred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)和

IEDB(http://www.immuneepitope.org/home.do)。

选择由超过一种上述程序预测为HLA-DR2结合性的肽，并为预测的核心残基(表2)设计侧翼序列。

表2

实施例2：考察来自用因子VIII免疫的小鼠的HLA-DR2限制性细胞对肽的应答

用佐剂中的人因子VIII免疫HLA-DR2转基因小鼠。收集引流淋巴结细胞，用不同浓度的来自表2的12种肽进行体外再刺激。结果示于图1

来自用因子VIII免疫的小鼠的HLA-DR2限制性细胞明显地对肽DNIMV(第一个氨基酸为1788)强应答。对肽PRCLT(545)和PPIIA(2161)也有应答。

实施例3：考察来自HLA-DR2小鼠的T细胞对肽的应答

首先用佐剂中的因子VIII免疫HLA-DR2小鼠。在体外用因子VIII对来自免疫小鼠的脾细胞进行再刺激，并使用聚乙二醇将所得的淋巴母细胞与BW5147胸腺瘤融合。

T细胞杂交瘤在HAT培养基中选择，克隆杂交瘤并测试它们对因子VIII的应答。然后以杂交瘤对12种预测肽的应答为条件对它们进行筛选。在被筛选的27个杂交瘤中，11个对DNIMV应答，3个对PRCLT应答，而3个对PPIIA应答，尽管对PPIIA的应答较弱且特异性较低。两个对DNIMV和PRCLT特异性的杂交瘤的应答如图2所示。

实施例4：考察来自FVIII-DR2+小鼠的淋巴结细胞对肽的应答

将HLA-DR2小鼠与因子VIII缺陷小鼠杂交以产生表达人II类MHC分子的血友病模型。

用佐剂中的因子VIII免疫这些FVIII-DR2+动物。分离引流淋巴结并测试它们对肽组的应答。如图3所示，这些细胞对PRCLT和DNIMV应答良好。对GTLMV有弱应答，对RYLRI应答显著。

实施例5：考察来自HLA-DR2小鼠的T细胞对肽的应答

用佐剂中的因子VIII免疫表达HLA-DR2的因子VIII缺陷小鼠。将来自经免疫小鼠的脾细胞在体外用因子VIII再刺激，并将所得的淋巴母细胞与BW5147融合，如上所述。以其针对12种预测肽的应答为条件筛选T细胞杂交瘤。同样，大部分杂交瘤对DNIMV和PRCLT肽有应答。在19个对因子VIII特异性的杂交瘤中，10个对DNIMV有应答，6个对PRCLT有应答，1个对PPIIA有应答，1个对SLYIS有应答，而1个对DTLLI有应答。这些杂交瘤的应答的实例如图4所示。

基于这些实验，很明显两种肽DNIMV(第一个氨基酸编号为1788)和PRCLT(第一个氨基酸为545)构成针对人因子VIII的HLA-DR2限制性T细胞应答中的免疫显性T细胞表位。

实施例6：DNIMV和PRCLT表现为apitope

要成为apitope，肽必须有这样的能力：在不经过进一步抗原加工(即修剪(trimming))的条件下即能结合I类或II类MHC分子，并被呈递给T细胞。在本案中，考察了肽被固定的APC呈递的能力。

Mgar细胞是新鲜的或者用1％多聚甲醛固定的。通过将100μl杂交瘤细胞与5×10⁴个Mgar细胞在有或无20μg/ml rhFVIII或肽表位的存在下一起培养过夜来测试克隆的抗原特异性。然后收集上清液，并通过ELISA评估IL-2生成。rhFVIII必须由活的Mgar细胞呈递的事实表明，完整蛋白要呈递需要抗原加工。另一方面，肽DNIMV和PRCLT既被活Mgar细胞呈递，又被固定的Mgar细胞呈递，表明这些肽有apitope的功能(图5)。

实施例7：能够发挥apitope功能的肽表位的范围的确定

通过制备一组重叠肽(如30-32页所示)，并按照与实施例5相同的方法使用T细胞杂交瘤来筛选它们，以鉴定DNIMV、PRCLT及其他肽周围的序列中能够发挥apitope功能的肽表位的范围(图7)。

实施例8：DNIMV和PRCLT诱导针对完整因子VIII蛋白的耐受

用两种可溶肽中的任一种或作为对照的PBS处理HLA-DR2转基因小鼠，然后用佐剂中的因子VIII进行免疫。分离引流淋巴结并用因子VIII蛋白对细胞进行体外再刺激，以评估小鼠的免疫状态。如图6所示，用DNIMV或PRCLT处理小鼠导致针对因子VIII的免疫应答的显著阻遏。

实施例9：考察DNIMV和PRCLT能否在因子VIII敲除小鼠中诱导耐受

从实施例8可知，这两种肽在表达内源性因子VIII的小鼠中能够防止针对因子VIII的免疫应答。用FVIII-DR2+动物重复该实验以确定这些肽是否也阻止因子VIII缺陷小鼠中针对因子VIII的免疫应答。

实施例10：考察DNIMV和PRCLT的组合能否在因子VIII敲除小鼠中诱导耐受

将这两种已在实施例9中证明能够单独降低因子VIII缺陷小鼠中针对因子VIII的免疫应答的肽组合起来。如图8所示，用DNIMV和PRCLT二者处理小鼠导致针对因子VIII的免疫应答的显著阻遏，表现为IFN-γ产生的减少。IFN-γ是小鼠中中和性抗体所需的主要类别转换淋巴因子。显示的效果比任何一种肽单独使用时观察到的效果都要高。

实施例11：使用修饰肽进行耐受的诱导

肽DNIMV是部分而非完全可溶。为提高这种肽的可溶性，设计了一种具有下列序列的修饰形式：EDNIMVTFRNQASR。

这是在N端延长以添加一荷电亲水性残基。还在C端截短以除去脯氨酸和酪氨酸残基。此外通过在肽的任一端放置荷正电或荷负电的氨基酸，造成了据报道可提高可溶性的电荷偶极。

修饰的肽比DNIMV可溶性更高并足够可溶以允许鼻腔肽递送。为了评估使用此种肽表位对耐受的诱导，取FVIII缺陷小鼠并用修饰的EDNIMV肽(图9中被称为“耐受化(tolerised)”组)处理一半小鼠。接着用CFA中的DNIMV免疫小鼠，并在10天后收集引流淋巴结并在体外用DNIMV或EDNIMV刺激。图9显示了来自体外用DNIMV或EDNIMV刺激的

小鼠或耐受化小鼠的应答结果。

该结果证明了EDNIMV能使用DNIMV免疫的小鼠重新产生(recall)免疫应答。此外，非常清楚地证明了用EDNIMV耐受化的小鼠无法在体内对DNIMV产生免疫应答，正如体外用CFA中的DNIMV初次刺激后对DNIMV或EDNIMV缺乏应答所揭示的一样。

实施例12：EDNIMV诱导对完整因子VIII蛋白的耐受

对修饰的肽EDNIMV重复实施例8所述实验以证明EDNIMV能够抑制对完整因子VIII蛋白的免疫应答。

方法

(i)用rhFVIII初次刺激的DR2+小鼠的回忆应答

用40μg rhFVIII在尾根部皮下免疫HLA-DR2+鼠类II类MHC缺失小鼠(HLA-DR2+murine MHC class II null mice)，其中rhFVIII乳化在加有400μg热灭活的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Ra的完全弗氏佐剂中。10天后处死小鼠，取出引流淋巴结。制备单细胞悬液，将在96孔平底平板中以4-5×10⁵个细胞/孔的淋巴细胞与标示浓度的肽或对照抗原一起温育72小时，然后再用0.5μCi/孔的氚标记胸苷脉冲刺激(pulse)16小时。然后冷冻平板，再将细胞收集到玻璃过滤垫片(glassfilter mat)上，并使用液体闪烁β计数器测量放射性掺入。

(ii)产自DR2+小鼠的T细胞杂交瘤的FVIII肽特异性

如上所述免疫HLA-DR2+鼠类II类MHC缺失小鼠。在第10天取出引流淋巴结，并在24孔平板中以1ml/孔、2.5×10⁶个细胞/ml在20μg/ml rhFVIII存在下培养3天。在这样刺激之后，回收淋巴细胞，洗涤，并如Nelson等(1980)PNAS 77(5)：2866所述，使用聚乙二醇将淋巴细胞与TCRα-β-BW融合配偶体细胞以4个BW细胞对1个淋巴细胞的比例融合。将融合的细胞小心洗涤后铺在96孔平底平板上，2天后加入HAT培养基以选择T细胞杂交瘤。监控细胞生长，并在实施融合后大约10天时，选择单个克隆，并转移到24孔板中的HAT培养基中。将克隆保持在HAT培养基中至少2周，然后转换为HT培养基，再转换为完全培养基。将100μl杂交瘤细胞与5×10⁴个Mgar细胞在有或无20μg/ml rhFVIII存在下培养过夜来测试克隆的抗原特异性。然后收集上清液，通过ELISA评估IL-2产生，其中将响应于rhFVIII而产生IL-2的克隆视为FVIII特异性阳性。为了考察预测的FVIII肽的库(repertoire)，将FVIII特异性克隆与20μg/ml的12种肽中的每一种分别温育过夜后，再次测试IL-2产生。

(iii)用rhFVIII初次刺激的FVIII-/-小鼠的回忆应答

采用与(i)相同的方法，只是小鼠为FVIII缺陷、HLA-DR2+且鼠类II类MHC缺失的。

(iv)自FVIII-/-小鼠产生的T细胞杂交瘤的FVIII肽特异性

按照(ii)同样的方法，只是小鼠为FVIII缺陷和HLA-DR2+的。

(v)通过利用免疫显性FVIII肽预处理使DR2+小鼠中FVIII特异性应答耐受化

将HLA-DR2+鼠类II类MHC缺失小鼠用PBS中的100μg DNIMV、PRCLT或PPIIA或等体积的单独的PBS处理3次。腹膜内施用肽，各剂之间间隔3-4天。最后一次施用后，如(i)所述用在完全弗氏佐剂中乳化的rhFVIII初次刺激小鼠。10天后，回收引流淋巴结，然后将淋巴细胞在体外与rhFVIII，或与耐受化肽和对照肽中的每一种一起培养72小时，再如(i)所述加入氚标记的胸苷。

(vi)通过用免疫显性FVIII肽的组合预处理使DR2+小鼠中FVIII特异性应答耐受化

用溶于PBS的DNIMV、PRCLT、或DNIMV与PRCLT二者的组合，或等体积的单独的PBS处理HLA-DR2+鼠类II类MHC缺失小鼠3次。在8天时间内腹膜内施用肽。最后一次施用之后，如(i)所述用乳化在完全弗氏佐剂中的rhFVIII初次刺激小鼠。10天后，回收引流淋巴结，然后用rhVIII体外再刺激淋巴细胞。然后收集上清液，并测量IFN-γ。

本文通过提述并入本说明书中提及的所有出版物。本领域技术人员在不背离本发明的范围和精髓的前提下可以容易地想到本发明所述方法和系统的各种修改和变化。虽然结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解的是，不应将要求保护的发明过分地限制到这些具体实施方案。事实上，对于分子免疫学或相关领域的技术人员容易想到的、对本文描述的本发明的实施模式的各种修改，都是下文所述的权利要求的范围所意图涵盖的。

SEQ ID No.1

1 mqielstcff lcllrfcfsa trryylgave lswdymqsdl gelpvdarfp prvpksfpfn

61 tsvvykktlf veftdhlfni akprppwmgl lgptiqaevy dtvvitlknm ashpvslhav

121 gvsywkaseg aeyddqtsqr ekeddkvfpg gshtyvwqvl kengpmasdp lcltysylsh

181 vdlvkdlnsg ligallvcre gslakektqt lhkfillfav fdegkswhse tknslmqdrd

241 aasarawpkm htvngyvnrs lpgligchrk svywhvigmg ttpevhsifl eghtflvrnh

301 rqasleispi tfltaqtllm dlgqfllfch isshqhdgme ayvkvdscpe epqlrmknne

361 eaedydddlt dsemdvvrfd ddnspsfiqi rsvakkhpkt wvhyiaaeee dwdyaplvla

421 pddrsyksqy lnngpqrigr kykkvrfmay tdetfktrea iqhesgilgp llygevgdtl

481 liifknqasr pyniyphgit dvrplysrrl pkgvkhlkdf pilpgeifky kwtvtvedgp

541 tksdprcltr yyssfvnmer dlasgligpl licykesvdq rgnqimsdkr nvilfsvfde

601 nrswylteni qrflpnpagv qledpefqas nimhsingyv fdslqlsvcl hevaywyils

661 igaqtdflsv ffsgytfkhk mvyedtltlf pfsgetvfms menpg1wilg chnsdfrnrg

721 mtallkvssc dkntgdyyed syedisayll sknnaieprs fsqnsrhpst rqkqfnatti

781 pendiektdp wfahrtpmpk iqnvsssdll mllrqsptph glslsdlqea kyetfsddps

841 pgaidsnnsl semthfrpql hhsgdmvftp esglqlrlne klgttaatel kkldfkvsst

901 snnlistips dnlaagtdnt sslgppsmpv hydsqldttl fgkkssplte sggplslsee

961 nndskllesg lmnsqesswg knvsstesgr lfkgkrahgp alltkdnalf kvsisllktn

1021 ktsnnsatnr kthidgpsll ienspsvwqn ilesdtefkk vtplihdrml mdknatalrl

1081 nhmsnkttss knmemvqqkk egpippdaqn pdmsffkmlf lpesarwiqr thgknslnsg

1141 qgpspkqlvs lgpeksvegq nflseknkvv vgkgeftkdv glkemvfpss rnlfltnldn

1201 lhennthnqe kkiqeeiekk etliqenvvl pqihtvtgtk nfmknlflls trqnvegsyd

1261 gayapvlqdf rslndstnrt kkhtahfskk geeenleglg nqtkqiveky acttrispnt

1321 sqqnfvtqrs kralkqfrlp leetelekri ivddtstqws knmkhltpst ltqidyneke

1381 kgaitqspls dcltrshsip qanrsplpia kvssfpsirp iyltrvlfqd nsshlpaasy

1441 rkkdsgvqes shflqgakkn nlslailtle mtgdqrevgs lgtsatnsvt ykkventvlp

1501 kpdlpktsgk vellpkvhiy qkdlfptets ngspghldlv egsllqgteg aikwneanrp

1561 gkvpflrvat essaktpskl ldplawdnhy gtqipkeewk sqekspekta fkkkdtilsl

1621 nacesnhaia ainegqnkpe ievtwakqgr terlcsqnpp vlkrhqreit rttlqsdqee

1681 idyddtisve mkkedfdiyd edenqsprsf qkktrhyfia averlwdygm sssphvlrnr

1741 aqsgsvpqfk kvvfqeftdg sftqplyrge lnehlgllgp yiraevedni mvtfrnqasr

1801 pysfysslis yeedqrqgae prknfvkpne tktyfwkvqh hmaptkdefd ckawayfsdv

1861 dlekdvhsgl igpllvchtn tlnpahgrqv tvqefalfft ifdetkswyf tenmerncra

1921 pcniqmedpt fkenyrfhai ngyimdtlpg lvmaqdqrir wyllsmgshe nihsihfsgh

1981 vftvrkkeey kmalynlypg vfetvemlps kagiwrvecl igehlhagms tlflvysnkc

2041 qtplgmasgh irdfqitasg qygqwapkla rlhysgsina wstkepfswi kvdllapmii

2101 hgiktqgarq kfsslyisqf iimysldgkk wqtyrgnstg tlmvffgnvd ssgikhnifn

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2221 twspskarlh lqgrsnawrp qvnnpkewlq vdfqktmkvt gvttqgvksl ltsmyvkefl

2281 isssqdghqw tlffqngkvk vfqgnqdsft pvvnsldppl ltrylrihpq swvhqialrm

2341 evlgceaqdly

实施例7中制备的重叠肽组

对于DTLLIIFKNQASRPY的重叠组

1.473-488 YGEVGDTLLIIFKNQ

2.474-489 GEVGDTLLIIFKNQA

3.475-490 EVGDTLLIIFKNQAS

4.476-491 VGDTLLIIFKNQASR

5.477-492 GDTLLIIFKNQASRP

6.478-493 DTLLIIFKNQASRPY

7.479-494 TLLIIFKNQASRPYN

8.480-495 LLIIFKNQASRPYNI

9.481-496 LIIFKNQASRPYNIY

10.482-497 IIFKNQASRPYNIYP

11.483-498 IFKNQASRPYNIYPH

对于PRCLTRYYSSFVNME的重叠组

1.540-554 PTKSDPRCLTRYYSS

2.541-555 TKSDPRCLTRYYSSF

3.542-556 KSDPRCLTRYYSSFV

4.543-557 SDPRCLTRYYSSFVN

5.544-558 DPRCLTRYYSSFVNM

6.545-559 PRCLTRYYSSFVNME

7.546-560 RCLTRYYSSFVNMER

8.547-561 CLTRYYSSFVNMERD

9.548-562 LTRYYSSFVNMERDL

10.549-563 TRYYSSFVNMERDLA

11.550-564 RYYSSFVNMERDLAS

对于DNIMVTFRNQASRPY的重叠组

1.1783-1797 RAEVEDNIMVTFRNQ

2.1784-1798 AEVEDNIMVTFRNQA

3.1785-1799 EVEDNIMVTFRNQAS

4.1786-1800 VEDNIMVTFRNQASR

5.1787-1801 EDNIMVTFRNQASRP

6.1788-1802 DNIMVTFRNQASRPY

7.1789-1803 NIMVTFRNQASRPYS

8.1790-1804 IMVTFRNQASRPYSF

9.1791-1805 MVTFRNQASRPYSFY

10.1792-1806 VTFRNQASRPYSFYS

11.1793-1807 TFRNQASRPYSFYSS

对于SLYISQFIIMYSLDG的重叠组

1.2109-2123 RQKFSSLYISQFIIM

2.2110-2124 QKFSSLYISQFIIMY

3.2111-2125 KFSSLYISQFIIMYS

4.2112-2126 FSSLYISQFIIMYSL

5.2113-2127 SSLYISQFIIMYSLD

6.2114-2128 SLYISQFIIMYSLDG

7.2115-2129 LYISQFIIMYSLDGK

8.2116-2130 YISQFIIMYSLDGKK

9.2117-2131 ISQFIIMYSLDGKKW

10.2118-2132 SQFIIMYSLDGKKWQ

11.2119-2133 QFIIMYSLDGKKWQT

对于PPIIARYIRLHPTHY的重叠组

1.2156-2170 HNIFNPPIIARYIRL

2.2157-2171 NIFNPPIIARYIRLH

3.2158-2172 IFNPPIIARYIRLHP

4.2159-2173 FNPPIIARYIRLHPT

5.2160-2174 NPPIIARYIRLHPTH

6.2161-2175 PPIIARYIRLHPTHY

7.2162-2176 PIIARYIRLHPTHYS

8.2163-2177 IIARYIRLHPTHYSI

9.2164-2178 IARYIRLHPTHYSIR

10.2165-2179 ARYIRLHPTHYSIRS

11.2166-2180 RYIRLHPTHYSIRST

对于RYLRIHPQSWVHQIA的重叠组

1.2317-2331 PPLLTRYLRIHPQSW

2.2318-2332 PLLTRYLRIHPQSWV

3.2319-2333 LLTRYLRIHPQSWVH

4.2320-2334 LTRYLRIHPQSWVHQ

5.2321-2335 TRYLRIHPQSWVHQI

6.2322-2336 RYLRIHPQSWVHQIA

7.2323-2337 YLRIHPQSWVHQIAL

8.2324-2338 LRIHPQSWVHQIALR

9.2325-2339 RIHPQSWVHQIALRM

10.2326-2340 IHPQSWVHQIALRME

11.2327-2341 HPQSWVHQIALRMEV

Claims

1.一种肽，其包含下列F VIII衍生序列之一：

具有下列修饰中的一种或多种：

(i)去除一个或多个疏水性氨基酸；

(ii)用荷电亲水性氨基酸取代一个或多个疏水性氨基酸；和

(iii)在一端或两端插入一荷电氨基酸

2.一种肽，其包含序列：

X(aa)_n-核心序列-(aa)_m

其中X是荷电亲水性残基；

aa是氨基酸；

n是0-5的整数；

m是0-5的整数；并且

所述“核心序列”选自下列F VIII衍生肽组成的组：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

3.权利要求1所述的肽，其包含序列XDNIMVTFRNQAS。

4.一种肽，其包含序列：

Y(aa)_n-核心序列-(aa)_mZ

其中Y和Z是具有相反极性的荷电氨基酸；

aa是氨基酸；

n是0-5的整数；

m是0-5的整数；并且

所述“核心序列”选自下列FVIII衍生肽组成的组：

LYISQFIIM

FIIMYSLDG

IARYIRLHP

LIIFKNQAS

LTRYYSSFV

MVTFRNQAS

LRIHPQSWV

5.权利要求4所述的肽，其包含序列YDNIMVTFRNQASZ。

6.权利要求4或5所述的肽，其中Y是荷正电的氨基酸并且Z是荷负电的氨基酸。

7.权利要求4、5或6所述的肽，其中Z是K或R。

8.权利要求2-7中任一项所述的肽，其中X或Y是D或E。

9.任一前述权利要求所述的肽，其包含序列EDNIMVTFRNQASR。

10.任一前述权利要求所述的肽，其由序列EDNIMVTFRNQASR组成。

11.一种包含多种肽的组合物，其包括一种或多种任一前述权利要求所述的肽。

12.权利要求1-10中任一项所述的肽或权利要求11所述的组合物，用于阻遏或防止因子VIII抑制剂抗体在体内的产生。

13.权利要求1-10中任一项所述的肽或权利要求11所述的组合物在制备用于阻遏或防止因子VIII抑制剂抗体的在体内产生的药物中的用途。

14.一种阻遏或防止受试者中因子VIII抑制剂抗体的产生的方法，所述方法包括对受试者施用权利要求1-10中任一项所述的肽或权利要求11所述的组合物的步骤。

15.一种治疗受试者中血友病的方法，所述方法包括对受试者施用权利要求1-10中任一项中所述的肽或权利要求11所述的组合物的步骤。

16.权利要求14或15所述的方法，其中所述受试者患有A型血友病，并且正在接受或即将接受因子VIII替代治疗。

17.权利要求14或15所述的方法，其中所述受试者患有获得性血友病，或者有感染获得性血友病的风险。

18.权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述受试者为HLA-DR2。